인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성
Summary
본 프로토콜은 높은 반복성과 효율성으로 망막 오가노이드의 접착 및 융합을 감소시키는 최적화된 3D 신경 망막 유도 시스템을 설명합니다.
Abstract
망막병증은 전 세계적으로 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 망막병증의 발병기전을 조사하는 것은 망막병증의 조기 진단과 적시 치료에 필수적입니다. 불행히도 윤리적 장벽은 인간으로부터 증거를 수집하는 것을 방해합니다. 최근 수많은 연구에서 인간 만능 줄기세포(PSC)가 다양한 유도 프로토콜을 사용하여 망막 오가노이드(RO)로 분화될 수 있음을 보여주었으며, 이는 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 줄기 세포 기반 치료를 위한 망막병증에서 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 이 연구는 소포 형성 및 융합 가능성을 크게 줄여 60일까지 생산 성공률을 높이는 신경 망막(NR)을 생성하기 위한 최적화된 유도 프로토콜을 설명합니다. 특정 보완 요인과 결합된 해리 후 PSC의 자체 재구성 능력을 기반으로 하는 이 새로운 방법은 NR 분화를 구체적으로 유도할 수 있습니다. 또한, 이 접근법은 복잡하지 않고, 비용 효율적이며, 주목할 만한 반복성과 효율성을 보여주고, 망막 질환의 개인화된 모델에 대한 고무적인 전망을 제시하며, 세포 치료, 약물 스크리닝 및 유전자 치료 테스트와 같은 응용 분야를 위한 풍부한 세포 저장소를 제공합니다.
Introduction
눈은 인간의 감각 기관 중 주요 정보 공급원 역할을 하며, 망막은 포유류 눈의 주요 시각 감각 조직이다1. 망막병증은 전 세계적으로 안과 질환의 주요 원인 중 하나로, 실명을 유발한다2. 전 세계적으로 약 285만 명의 사람들이 망막병증으로 인한 다양한 정도의 시력 장애를 겪고 있습니다3. 따라서 발병 기전을 조사하는 것은 조기 진단과 시기 적절한 치료에 매우 중요합니다. 인간 망막증에 대한 대부분의 연구는 주로 동물 모델에 초점을 맞추고 있다 4,5,6. 그러나 인간의 망막은 다양한 세포 유형으로 구성된 복잡하고 다층 조직입니다. 기존의 2차원(2D) 세포 배양 및 동물 모델 시스템은 일반적으로 인간 망막의 정상적인 시공간 발달 및 약물 대사를 충실하게 재현하지 못합니다 7,8.
최근에는 3D 배양 기술이 발전하여 만능 줄기 세포(PSC)에서 조직과 유사한 장기를 생성하게 되었습니다.9,10. 3D 현탁 배양 시스템에서 인간 PSC로부터 생성된 망막 오가노이드(RO)는 7가지 망막 세포 유형을 포함할 뿐만 아니라 생체 내 인간 망막과 유사한 뚜렷한 층화 구조를 나타냅니다 11,12,13. 인간 PSC 유래 RO는 대중화되고 널리 보급되었으며 현재 인간 망막의 발달 및 질병을 연구하기 위한 최고의 시험관 모델입니다14,15. 지난 수십 년 동안 수많은 연구자들이 배아 줄기 세포(ESC) 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함한 인간 PSC가 다양한 유도 프로토콜을 사용하여 RO로 분화할 수 있음을 입증했습니다. 이러한 발전은 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 줄기 세포 기반 치료를 위한 망막병증에서 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다 16,17,18.
그러나 인간 만능 줄기세포(PSC)에서 신경 망막(NR)을 생성하는 것은 복잡하고 번거로우며 시간이 많이 걸리는 과정입니다. 또한, 조직 오가노이드의 배치 간 변이는 결과의 재현성을 낮출 수 있습니다19,20. 수많은 내인적 및 외인적 인자가 망막 오가노이드(RO)의 수율에 영향을 미칠 수 있으며, 이를테면 시작 세포의 수 또는 종, 전사 인자 및 소분자 화합물의 사용 21,22,23. 최초의 인간 RO가 사사이 실험실(11)에 의해 생성된 이래로, 유도 과정(13,21,24,25)의 용이성과 효과를 향상시키기 위해 수년에 걸쳐 여러 가지 변형이 제안되었다. 안타깝게도 현재까지 모든 실험실에서 RO를 생성하기 위한 표준 프로토콜은 확립되지 않았습니다. 실제로, RO에는 상이한 유도 방법으로 인한 어느 정도의 불일치가 있을 뿐만 아니라 망막 마커의 발현 및 구조의 견고성에 큰 차이가 있습니다22,26. 이러한 문제는 표본 채취와 연구 결과의 해석을 심각하게 복잡하게 만들 수 있습니다. 따라서 RO 생성의 이질성을 최소화하면서 효율성을 극대화하기 위해 보다 통합되고 강력한 차별화 프로토콜이 필요합니다.
이 연구는 Kuwahara et al.12 및 Döpper et al.27 의 조합을 기반으로 하는 최적화된 유도 프로토콜을 자세한 지침과 함께 설명합니다. 새로운 방법은 오가노이드 소포화 및 융합 가능성을 크게 줄여 NR 생성 성공률을 높입니다. 이 개발은 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 망막 장애에 대한 세포 치료 응용 분야에 큰 가능성을 가지고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간 RO는 태아 망막의 발달을 공간적, 시간적으로 재현할 수 있으며, 초기 RO는 동등한 발달 단계에서 태아 망막과 높은 수준의 유사성을 나타낸다15. 조직 형태 및 분자 발현 측면에서 인간 RO는 망막 조직의 실제 성장 상태를 밀접하게 반영하여 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 재생 의학 분야에서 전례 없는 엄청난 기회를 제공합니다. 현재, in vitro에서 인간 PSC로부터 RO를 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
