Summary

Generación de retina neural a partir de células madre pluripotentes humanas

Published: December 22, 2023
doi:

Summary

El presente protocolo describe un sistema de inducción neuronal de retina 3D optimizado que reduce la adhesión y fusión de organoides retinianos con alta repetibilidad y eficiencia.

Abstract

La retinopatía es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. Investigar su patogenia es fundamental para el diagnóstico precoz y el tratamiento oportuno de la retinopatía. Desafortunadamente, las barreras éticas dificultan la recopilación de evidencia de los seres humanos. Recientemente, numerosos estudios han demostrado que las células madre pluripotentes humanas (PSC) se pueden diferenciar en organoides de la retina (RO) utilizando diferentes protocolos de inducción, que tienen un enorme potencial en la retinopatía para el modelado de enfermedades, el cribado de fármacos y las terapias basadas en células madre. En este estudio se describe un protocolo de inducción optimizado para generar retina neural (NR) que reduce significativamente la probabilidad de vesiculación y fusión, aumentando la tasa de éxito de la producción hasta el día 60. Basado en la capacidad de las PSC para autoreorganizarse después de la disociación, combinado con ciertos factores complementarios, este nuevo método puede impulsar específicamente la diferenciación de NR. Además, el enfoque es sencillo, rentable, exhibe una notable repetibilidad y eficiencia, presenta perspectivas alentadoras para modelos personalizados de enfermedades de la retina y proporciona un abundante reservorio celular para aplicaciones como la terapia celular, la detección de fármacos y las pruebas de terapia génica.

Introduction

El ojo sirve como la principal fuente de información entre los órganos sensoriales humanos, siendo la retina el principal tejido sensorial visualen los ojos de los mamíferos. La retinopatía se erige como una de las principales causas mundiales de enfermedades oculares, lo que conduce a la ceguera2. Aproximadamente 2,85 millones de personas en todo el mundo sufren diversos grados de discapacidad visual debido a la retinopatía3. En consecuencia, la investigación de su patogenia es crucial para el diagnóstico precoz y el tratamiento oportuno. La mayoría de los estudios sobre retinopatía humana se han centrado principalmente en modelos animales 4,5,6. Sin embargo, la retina humana es un tejido complejo y de múltiples capas que comprende varios tipos de células. Los sistemas tradicionales de cultivo celular bidimensional (2D) y los sistemas de modelos animales generalmente no logran recapitular fielmente el desarrollo espacio-temporal normal y el metabolismo de los fármacos de la retina humana nativa 7,8.

Recientemente, las técnicas de cultivo 3D han evolucionado para generar órganos similares a tejidos a partir de células madre pluripotentes (PSCs)9,10. Los organoides retinianos (RO) generados a partir de PSC humanas en un sistema de cultivo en suspensión 3D no solo contienen siete tipos de células retinianas, sino que también exhiben una estructura estratificada distinta similar a la retina humana in vivo 11,12,13. Las RO derivadas de PSC humanas han ganado popularidad y amplia disponibilidad y actualmente son los mejores modelos in vitro para estudiar el desarrollo y la enfermedad de la retina humana14,15. En las últimas décadas, numerosos investigadores han demostrado que las PSC humanas, incluidas las células madre embrionarias (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), pueden diferenciarse en RO utilizando varios protocolos de inducción. Estos avances tienen un enorme potencial en la retinopatía para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las terapias basadas en células madre 16,17,18.

Sin embargo, la generación de retina neural (NR) a partir de células madre pluripotentes humanas (PSC) es un proceso complejo, engorroso y que requiere mucho tiempo. Además, las variaciones de un lote a otro en los organoides tisulares pueden conducir a una menor reproducibilidad de los resultados19,20. Numerosos factores intrínsecos y extrínsecos pueden influir en el rendimiento de los organoides de la retina (RO), como el número o la especie de células de partida y el uso de factores de transcripción y compuestos de moléculas pequeñas 21,22,23. Desde que el laboratorio Sasaigeneró la primera ósmosis inversa humana 11, se han propuesto múltiples modificaciones a lo largo de los años para mejorar la facilidad y eficacia del proceso de inducción 13,21,24,25. Desafortunadamente, hasta la fecha, no se ha establecido un protocolo estándar de oro para la generación de ósmosis inversa en todos los laboratorios. De hecho, existe un cierto grado de discrepancia en las OR resultantes de los diferentes métodos de inducción, así como una amplia variación en la expresión de los marcadores retinianos y en la robustez de su estructura22,26. Estos problemas pueden complicar gravemente la recolección de muestras y la interpretación de los hallazgos del estudio. Por lo tanto, se necesita un protocolo de diferenciación más consolidado y robusto para maximizar la eficiencia con una heterogeneidad mínima de la generación de ósmosis inversa.

En este estudio se describe un protocolo de inducción optimizado basado en una combinación de Kuwahara et al.12 y Döpper et al.27 con instrucciones detalladas. El nuevo método reduce significativamente la probabilidad de vesiculación y fusión de organoides, lo que aumenta la tasa de éxito en la generación de NR. Este desarrollo es muy prometedor para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las aplicaciones de terapia celular para trastornos de la retina.

Protocol

Este estudio se realizó de acuerdo con los Principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital General del EPL de China. La línea ESC WA09 (H9) se obtuvo del WiCell Research Institute. 1. Medios de cultivo y preparación de reactivos Medio de cultivo ESC humano y solución de pasoMedio de mantenimiento (MM): Preparar 500 mL de MM completo (Medio Basal + 5x suplemento; ver Tabla de Materiales</…

Representative Results

En la Figura 1 se muestra una descripción gráfica del protocolo modificado. Las H9-ESC se utilizaron para generar RO cuando las células crecieron a una densidad del 70%-80%. Las suspensiones de una sola célula de H9-ESC en 96 pozos cónicos con fondo en V se agregaron el día 1 y formaron EB redondos bien circunscritos en el día 6. A medida que aumentaba el tiempo de cultivo, el volumen de EB aumentaba gradualmente. En el día 30, las estructuras de tipo neuroepitelial se formaron clara…

Discussion

Las OR humanas pueden recapitular espacial y temporalmente el desarrollo de la retina fetal, y las OR tempranas exhiben un alto grado de similitud con la retina fetal en etapas equivalentes de desarrollo15. En términos de morfología tisular y expresión molecular, la ósmosis inversa humana refleja de cerca el estado de crecimiento real del tejido de la retina, lo que brinda oportunidades enormes y sin precedentes en los campos del modelado de enfermedades, la detección de medicamentos y la med…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ninguno.

Materials

0.01 M TPBS Servicebio G0002 Washing slices
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101-500ML Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette NEST Biotechnology 318516 Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells Sumitomo Bakelit MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides CITOTEST 188105 Fix slices
AggreWell medium STEMCELL Technologies 5893 Medium
Anhydrous ethanol SINOPHARM 10009218 Dehydrate 
Anti-CHX10 Santa Cruz sc-365519 Primary antibody
Antifade Solution ZSGB-BIO ZLI-9556
Anti-KI67 Abcam ab16667 Primary antibody
Anti-NESTIN Sigma N5413 Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) Beyotime AT809 Primary antibody
Anti-PAX6 Abcam ab195045 Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS) STEMCELL Technologies 7922 Cell dissociation
CHIR99021 Selleckchem S2924 GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate Gibco 12531018 250×
Citrate Antigen Retrieval Solution Servicebio G1202-250ML 20×, pH 6.0
CS10 STEMCELL Technologies 1001061 Cell Freezing Medium
DAPI Roche 10236276001 Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 11330032 Medium
DMEM/F12-GlutaMAX Gibco 10565018 Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32766 Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A10042 Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Biosharp BL518A 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM) Corning 354277 Coating plates
F12-Glutamax Gibco 31765035 Medium
Fetal Bovine Serum Gibco A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer TissueGnostics TissueFAXS Plus Scan sections
IMDM-GlutaMAX Gibco 31980030 Medium
IWR1-endo Selleckchem S7086 Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
LDN-193189 2HCl Selleckchem S7507 BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates Corning 3473
Low-adhesion 6-well Plates Corning 3471
Maintenance medium (MM) STEMCELL Technologies 85850 Medium
N2 supplement Gibco 17502048
Normal Donkey Serum Solarbio SL050 Blocking buffer
Paraplast Leica 39601006 Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x) Gibco C10010500BT Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) R&D 314-BP Key protein factor
Retinoic acid Sigma R2625 Powder, keep out of light
SB431542 Selleckchem S1067 ALK5-inhibitor
SU5402 Selleckchem S7667 Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen ZSGB-BIO ZLI-9305
Taurine Sigma T0625-10G
Thioglycerol Sigma M1753
Triton X-100 Sigma X100 Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line WiCell Research Institute Cell line
Xylene SINOPHARM 10023418 Dewaxing
Y-27632 2HCL Selleckchem S1049 ROCK-inhibitor

References

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Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L., Wang, X., Zhao, L., Yan, Y., Ye, Z., Xi, J., Yue, W., Li, Z. Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e66246, doi:10.3791/66246 (2023).

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