توليد شبكية العين العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
Summary
يصف البروتوكول الحالي نظام تحريض شبكية العين العصبي 3D الأمثل الذي يقلل من التصاق وانصهار عضويات الشبكية مع قابلية عالية للتكرار والكفاءة.
Abstract
اعتلال الشبكية هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى في جميع أنحاء العالم. التحقيق في التسبب في المرض أمر ضروري للتشخيص المبكر والعلاج في الوقت المناسب لاعتلال الشبكية. لسوء الحظ ، تعيق الحواجز الأخلاقية جمع الأدلة من البشر. في الآونة الأخيرة ، أظهرت العديد من الدراسات أنه يمكن تمييز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) إلى عضويات شبكية العين (ROs) باستخدام بروتوكولات تحريض مختلفة ، والتي لديها إمكانات هائلة في اعتلال الشبكية لنمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية. تصف هذه الدراسة بروتوكول الحث الأمثل لتوليد شبكية العين العصبية (NR) التي تقلل بشكل كبير من احتمال الحويصلة والانصهار ، مما يزيد من معدل نجاح الإنتاج حتى اليوم 60. استنادا إلى قدرة PSCs على إعادة التنظيم الذاتي بعد الانفصال ، جنبا إلى جنب مع بعض العوامل التكميلية ، يمكن لهذه الطريقة الجديدة أن تدفع على وجه التحديد تمايز NR. علاوة على ذلك ، فإن النهج غير معقد وفعال من حيث التكلفة ، ويظهر قابلية تكرار وكفاءة ملحوظة ، ويقدم آفاقا مشجعة لنماذج شخصية لأمراض الشبكية ، ويوفر خزانا وفيرا للخلايا لتطبيقات مثل العلاج بالخلايا ، وفحص الأدوية ، واختبار العلاج الجيني.
Introduction
تعمل العين كمصدر أساسي للمعلومات بين الأعضاء الحسية البشرية ، حيث تكون شبكية العين هي النسيج الحسي البصري الرئيسي في عيون الثدييات1. يعتبر اعتلال الشبكية أحد الأسباب العالمية الرئيسية لأمراض العيون ، مما يؤدي إلى العمى2. يعاني ما يقرب من 2.85 مليون شخص في جميع أنحاء العالم من درجات متفاوتة من ضعف البصر بسبب اعتلال الشبكية3. وبالتالي ، فإن التحقيق في التسبب في المرض أمر بالغ الأهمية للتشخيص المبكر والعلاج في الوقت المناسب. ركزت معظم الدراسات حول اعتلال الشبكية البشري بشكل أساسي على النماذج الحيوانية4،5،6. ومع ذلك ، فإن شبكية العين البشرية هي نسيج معقد متعدد الطبقات يضم أنواعا مختلفة من الخلايا. عادة ما تفشل زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) وأنظمة النماذج الحيوانية في تلخيص التطور الزماني المكاني الطبيعي واستقلاب الدواء لشبكية العين البشرية الأصلية 7,8.
في الآونة الأخيرة ، تطورت تقنيات زراعة 3D لتوليد أعضاء تشبه الأنسجة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) 9,10. لا تحتوي عضويات الشبكية (ROs) المتولدة من PSCs البشرية في نظام ثقافة تعليق ثلاثي الأبعاد على سبعة أنواع من خلايا الشبكية فحسب ، بل تظهر أيضا بنية طبقية مميزة مماثلة لشبكية العين البشرية في الجسم الحي11،12،13. اكتسبت ROs المشتقة من PSC البشرية شعبية وتوافر واسع النطاق وهي حاليا أفضل النماذج في المختبر لدراسة تطور ومرض شبكية العين البشرية14,15. على مدى العقود القليلة الماضية ، أثبت العديد من الباحثين أن PSCs البشرية ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، يمكن أن تتمايز إلى ROs باستخدام بروتوكولات تحريض مختلفة. تحمل هذه التطورات إمكانات هائلة في اعتلال الشبكية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية16،17،18.
ومع ذلك ، فإن توليد شبكية العين العصبية (NR) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) هو عملية معقدة ومرهقة وتستغرق وقتا طويلا. علاوة على ذلك ، قد تؤدي الاختلافات من دفعة إلى أخرى في عضويات الأنسجة إلى انخفاض قابلية استنساخ النتائج19،20. يمكن أن تؤثر العديد من العوامل الجوهرية والخارجية على إنتاجية عضويات الشبكية (ROs) ، مثل عدد أو أنواع الخلايا الأولية واستخدام عوامل النسخ ومركبات الجزيئات الصغيرة21،22،23. منذ أن تم إنشاء أول RO بشري بواسطة مختبر Sasai11 ، تم اقتراح تعديلات متعددة على مر السنين لتعزيز سهولة وفعالية عملية الحث13،21،24،25. لسوء الحظ ، حتى الآن ، لم يتم إنشاء بروتوكول قياسي ذهبي لتوليد ROs في جميع المختبرات. في الواقع ، هناك درجة معينة من التناقض في ROs الناتجة عن طرق الحث المختلفة ، وكذلك التباين الواسع في التعبير عن علامات الشبكية وقوة هيكلها22,26. قد تعقد هذه القضايا بشدة جمع العينات وتفسير نتائج الدراسة. لذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكول تمايز أكثر توحيدا وقوة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة مع الحد الأدنى من عدم تجانس توليد RO.
تصف هذه الدراسة بروتوكول الحث الأمثل بناء على مزيج من Kuwahara et al.12 و Döpper et al.27 مع تعليمات مفصلة. تقلل الطريقة الجديدة بشكل كبير من احتمال الحويصلة العضوية والانصهار ، مما يزيد من معدل نجاح توليد NR. يحمل هذا التطور وعدا كبيرا لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية وتطبيقات العلاج بالخلايا لاضطرابات الشبكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن ل ROs البشرية أن تلخص مكانيا وزمانيا تطور شبكية العين الجنينية ، وتظهر ROs المبكرة درجة عالية من التشابه مع شبكية العين الجنينية في مراحل مماثلة من التطور15. من حيث مورفولوجيا الأنسجة والتعبير الجزيئي ، يعكس RO البشري عن كثب حالة النمو الفعلية لأنسجة الشبكية ، مما يوفر فرصا ه?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
