Generering av nevral retina fra humane pluripotente stamceller
Summary
Den nåværende protokollen beskriver et optimalisert 3D nevrale retina induksjonssystem som reduserer vedheft og fusjon av retinale organoider med høy repeterbarhet og effektivitet.
Abstract
Retinopati er en av hovedårsakene til blindhet over hele verden. Undersøkelse av patogenesen er avgjørende for tidlig diagnose og rettidig behandling av retinopati. Dessverre hindrer etiske barrierer innsamling av bevis fra mennesker. Nylig har mange studier vist at humane pluripotente stamceller (PSC) kan differensieres til retinale organoider (RO) ved hjelp av forskjellige induksjonsprotokoller, som har enormt potensial i retinopati for sykdomsmodellering, legemiddelscreening og stamcellebaserte terapier. Denne studien beskriver en optimalisert induksjonsprotokoll for å generere nevral retina (NR) som signifikant reduserer sannsynligheten for vesikulasjon og fusjon, og øker suksessraten for produksjon frem til dag 60. Basert på PSCs evne til å omorganisere seg selv etter dissosiasjon, kombinert med visse komplementære faktorer, kan denne nye metoden spesifikt drive NR-differensiering. Videre er tilnærmingen ukomplisert, kostnadseffektiv, viser bemerkelsesverdig repeterbarhet og effektivitet, presenterer oppmuntrende utsikter for personlige modeller av retinale sykdommer, og leverer et rikelig cellereservoar for applikasjoner som celleterapi, narkotikascreening og genterapitesting.
Introduction
Øyet fungerer som den primære informasjonskilden blant menneskelige sanseorganer, med netthinnen som det viktigste visuelle sensoriske vevet i pattedyrøyne1. Retinopati står som en av de viktigste globale årsakene til øyesykdommer, noe som fører til blindhet2. Omtrent 2,85 millioner mennesker over hele verden lider av varierende grad av synshemming på grunn av retinopati3. Følgelig er undersøkelse av patogenesen avgjørende for tidlig diagnose og rettidig behandling. De fleste studier på human retinopati har primært fokusert på dyremodeller 4,5,6. Imidlertid er den menneskelige netthinnen et komplekst, flerlags vev som består av forskjellige celletyper. Tradisjonelle todimensjonale (2D) cellekulturer og dyremodellsystemer klarer vanligvis ikke å rekapitulere den normale spatiotemporale utviklingen og stoffskiftet til den innfødte menneskelige netthinnen 7,8.
Nylig har 3D-kulturteknikker utviklet seg til å generere vevslignende organer fra pluripotente stamceller (PSC)9,10. Retinale organoider (RO) generert fra humane PSCer i et 3D-suspensjonskultursystem inneholder ikke bare syv retinale celletyper, men viser også en distinkt stratifisert struktur som ligner på den menneskelige netthinnen in vivo 11,12,13. Humane PSC-avledede ROs har vunnet popularitet og utbredt tilgjengelighet og er for tiden de beste in vitro-modellene for å studere utviklingen og sykdommen i den menneskelige netthinnen14,15. I løpet av de siste tiårene har mange forskere vist at humane PSC-er, inkludert embryonale stamceller (ESC) og induserte pluripotente stamceller (iPSCs), kan differensiere til ROs ved hjelp av forskjellige induksjonsprotokoller. Disse fremskrittene har enormt potensial i retinopati for sykdomsmodellering, narkotikascreening og stamcellebaserte terapier 16,17,18.
Imidlertid er generering av nevral retina (NR) fra humane pluripotente stamceller (PSC) en kompleks, tungvint og tidkrevende prosess. Videre kan batch-til-batch-variasjoner i vevsorganoider føre til lavere reproduserbarhet av resultatene19,20. Tallrike inneboende og ekstrinsiske faktorer kan påvirke utbyttet av retinale organoider (RO), for eksempel antall eller arter av startceller og bruk av transkripsjonsfaktorer og småmolekylære forbindelser 21,22,23. Siden den første menneskelige RO ble generert av Sasai laboratorium11, har flere modifikasjoner blitt foreslått gjennom årene for å forbedre enkelheten og effektiviteten av induksjonsprosessen 13,21,24,25. Dessverre er det til dags dato ikke etablert noen gullstandardprotokoll for å generere ROer i alle laboratorier. Faktisk er det en viss grad av avvik i ROs som følge av forskjellige induksjonsmetoder, samt stor variasjon i uttrykket av retinale markører og robustheten av deres struktur22,26. Disse problemene kan i alvorlig grad komplisere prøveinnsamling og tolkning av studiefunn. Derfor er det nødvendig med en mer konsolidert og robust differensieringsprotokoll for å maksimere effektiviteten med minimal heterogenitet av RO-generering.
Denne studien beskriver en optimalisert induksjonsprotokoll basert på en kombinasjon av Kuwahara et al.12 og Döpper et al.27 med detaljerte instruksjoner. Den nye metoden reduserer sannsynligheten for organoid vesikulasjon og fusjon betydelig, og øker suksessraten for å generere NR. Denne utviklingen har stort løfte om sykdomsmodellering, narkotikascreening og celleterapiapplikasjoner for retinale lidelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Humane ROs kan romlig og temporalt rekapitulere utviklingen av fosterets netthinne, og tidlige ROs viser en høy grad av likhet med fosterets retina i ekvivalente utviklingsstadier15. Når det gjelder vevsmorfologi og molekylært uttrykk, speiler human RO nøye den faktiske vekststatusen til retinalvevet, og gir enorme og enestående muligheter innen sykdomsmodellering, legemiddelscreening og regenerativ medisin. For tiden er det etablert flere forskjellige metoder for å generere ROer fra humane …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
