Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Modellering af sunde og dysbiotiske vaginale mikromiljøer i en menneskelig vagina-on-a-chip

Published: February 16, 2024 doi: 10.3791/66486
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Vascular Biology Program and Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School, 3Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences

Summary

Denne artikel beskriver en protokol til oprettelse af en mikrofluidisk vagina-on-a-chip (Vagina Chip) kulturenhed, der muliggør undersøgelse af menneskelige værtsinteraktioner med et levende vaginalt mikrobiom under mikroaerofile forhold. Denne chip kan bruges som et værktøj til at undersøge vaginale sygdomme samt til at udvikle og teste potentielle terapeutiske modforanstaltninger.

Abstract

Kvinders sundhed, og især sygdomme i den kvindelige reproduktive kanal (FRT), har ikke fået den opmærksomhed, de fortjener, selvom et usundt reproduktionssystem kan føre til livstruende sygdomme, infertilitet eller negative resultater under graviditeten. En barriere på området er, at der har været mangel på prækliniske, eksperimentelle modeller, der trofast efterligner FRT's fysiologi og patofysiologi. Nuværende in vitro- og dyremodeller rekapitulerer ikke fuldt ud de hormonelle ændringer, mikroaerobe tilstande og interaktioner med det vaginale mikrobiom. Fremkomsten af Organ-on-a-Chip (Organ Chip) mikrofluidisk kulturteknologi, der kan efterligne væv-vævsgrænseflader, vaskulær perfusion, interstitielle væskestrømme og det fysiske mikromiljø i en større underenhed af menneskelige organer kan potentielt tjene som en løsning på dette problem. For nylig er der udviklet en human vaginachip, der understøtter samkultur af humane vaginale mikrobielle konsortier med primært humant vaginalt epitel, der også er forbundet med vaginal stroma og oplever dynamisk væskestrøm. Denne chip replikerer de fysiologiske reaktioner fra den menneskelige vagina til sunde og dysbiotiske mikrobiomer. En detaljeret protokol til oprettelse af humane vaginachips er beskrevet i denne artikel.

Introduction

Et vaginalt mikrobiom domineret af Lactobacillus spp., der hjælper med at opretholde et surt mikromiljø, spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af kvindelig reproduktiv sundhed1. Imidlertid kan der til tider være en ændring i sammensætningen af mikrobielle samfund, der omfatter mikrobiomet, hvilket resulterer i en stigning i mangfoldigheden af vaginale bakterier. Disse dysbiotiske ændringer, som ofte resulterer i et skift fra en Lactobacillus-domineret tilstand til en domineret af mere forskelligartede anaerobe bakteriearter (fx Gardnerella vaginalis), er forbundet med forskellige sygdomme i reproduktionssystemet, såsom bakteriel vaginose, atrofisk vaginitis, urinvejsinfektion, vulvovaginal candidiasis, urethritis og chorioamnionitis 2,3,4,5 . Disse sygdomme øger igen en kvindes chancer for at erhverve seksuelt overførte sygdomme og bækkenbetændelse 6,7,8,9. De udgør også en højere risiko for for tidlig fødsel og aborter hos gravide kvinder 10,11,12 og har også været impliceret i infertilitet 13,14,15,16.

Selvom der er gjort en indsats for at modellere vaginal dysbiose ved hjælp af vaginale epitelceller dyrket i statiske, todimensionelle (2D) kultursystemer17,18, efterligner de ikke effektivt fysiologien og kompleksiteten af det vaginale mikromiljø19. Dyremodeller er også blevet brugt til at studere vaginal dysbiose; Imidlertid adskiller deres menstruationsfaser og værtsmikrobiominteraktioner sig meget fra hos mennesker, og derfor forbliver den fysiologiske relevans af resultaterne fra disse undersøgelser uklar 19,20,21. For at modvirke disse problemer er organoider og Transwell-indsatsmodeller af humant vaginalt væv også blevet brugt til at studere værtspatogeninteraktioner i FRT 19,22,23,24. Men fordi disse er statiske kulturer, kan de kun understøtte samkultur af humane celler med levende mikrober i en kort periode (<16-24 timer), og de mangler mange andre potentielt vigtige fysiske træk ved det menneskelige vaginale mikromiljø, såsom slimproduktion og væskestrøm22.

Orgelflis er tredimensionelle (3D) mikrofluidiske kultursystemer, der indeholder en eller flere parallelle hule mikrokanaler foret med levende celler dyrket under dynamisk væskestrøm. Tokanalchipsene muliggør rekreation af vævsvævsgrænseflader på organniveau ved at dyrke forskellige celletyper (f.eks. epitel og stromale fibroblaster eller epitel og vaskulært endotel) på modsatte sider af en porøs membran, der adskiller de to parallelle kanaler (figur 1). Begge væv kan uafhængigt udsættes for væskestrøm, og de kan også opleve mikroaerobe forhold for at muliggøre samkultur med et komplekst mikrobiom 25,26,27,28. Denne tilgang blev for nylig udnyttet til at udvikle en human vaginachip foret med hormonfølsomt, primært vaginalt epitel forbundet med underliggende stromale fibroblaster, som opretholder en lav fysiologisk iltkoncentration i epitellumen og muliggør samkultur med sunde og dysbiotiske mikrobiomer i mindst 3 dage in vitro29. Det blev påvist, at Vagina Chip kunne bruges til at studere kolonisering af optimale (sunde) L. crispatus konsortier og detektere betændelse og skade forårsaget af ikke-optimale (ikke-sunde) G. vaginalis indeholdende konsortier. Her beskriver vi detaljeret de metoder, der bruges til at skabe den menneskelige Vagina Chip samt til at etablere sunde og dysbiotiske bakteriesamfund on-chip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne forskning blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer for anvendelse af humane celler. Cellerne blev opnået kommercielt (se materialetabel). Alle trin skal udføres aseptisk i et biosikkerhedsskab (BSC). Brug kun pipettespidser med filter (eller barriere) til denne protokol.

1. Dyrkning af humane vaginale epitelceller

  1. 50 ml vaginalt epitelmedium (VEM, se materialetabel) opvarmes til 37 °C.
  2. Alikvote 9 ml VEM til et 15 ml rør. Optø derefter et hætteglas med humane vaginale epitelceller (HVEC'er), og tilsæt det til røret, der indeholder VEM.
  3. Der centrifugeres 15 ml tuben ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT), og supernatanten suges til sig, mens pelletsen efterlades.
  4. Pelletpen opslæmmes forsigtigt i 2 ml VEM, og der tilsættes 1 ml til hver af de to T75-kolber, der indeholder 14 ml VEM.
  5. Kolberne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2. Skift VEM hver 2. dag, indtil HVEC'erne er ca. 70% sammenflydende (ca. 5 dage).

2. Dyrkning af humane livmoderfibroblastceller

  1. Der fremstilles 10 ml 15 μg/ml Poly-L-lysinopløsning (PLL) i dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Der tilsættes 5 ml PLL-opløsning til hver af de to T75-kolber, og der inkuberes ved 37 °C i 1 time.
  2. 50 ml fibroblastmedium (FM, se materialetabel) opvarmes til 37 °C.
  3. PLL-opløsningen suges op, og hver kolbe vaskes med 5 ml ddH2O.
  4. Alikvote 9 ml FM til et 15 ml rør og optø et hætteglas med humane livmoderfibroblaster (HUF'er).
  5. Tilsæt HUF'erne til 15 ml røret, der indeholder FM.
  6. Der centrifugeres 15 ml tuben ved 300 x g i 5 minutter ved RT, og supernatanten suges til sig, mens cellepillen efterlades.
  7. Pelletpen resuspenderes forsigtigt i 2 ml FM og tilsættes 1 ml til hver af de to T75-kolber, der indeholder 14 ml FM.
  8. Kolberne inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2, indtil cellerne er ca. 70 % sammenflydende, mens substratet skiftes hver 2. dag.

3. Chipaktivering og kanalbelægning

  1. Afgas chipsene (opnået kommercielt, se materialetabellen) i 30 minutter i en vakuumekssikkator.
  2. Lad aktiveringsreagens 1 (AR-1) og aktiveringsreagens 2 (AR-2) (se materialetabel) ekvilibrere til RT i 15 minutter uden at fjerne emballagen.
  3. Pak et 15 ml konisk rør ind i folie for at beskytte det mod lys. Tilsæt langsomt 1 ml AR-2-opløsning til væggene i hætteglasset med AR-1 og bland godt. Overfør blandingen til det folieindpakkede 15 ml rør.
  4. Tilsæt gentagne gange AR-2 opløsning til hætteglasset med AR-1 i trin på 1 ml, indtil AR-1 pulveret er helt vasket fra hætteglasset.
  5. Fyld den rekonstituerede AR-1-opløsning op til 10 ml med AR-2-opløsning.
  6. Der tilsættes 200 μL af denne opløsning til den apikale kanalindgang på hver chip, mens der suges fra udløbet (figur 1A). Gentag for basalkanalen. Hold pipetten vinkelret på chippen, mens opløsningen tilsættes for at opretholde en tæt forsegling med uhindret flow.
  7. Gentag trin 3.6 for alle chips.
  8. Kontroller alle chips for bobler. Fjern eventuelle bobler ved at tilføje mere løsning til de(n) berørte kanal(er).
  9. Opsug al overskydende AR-1-opløsning fra chipoverfladen, samtidig med at du undgår kanalindløb og -udløb.
  10. Læg chips i en 150 mm petriskål, og indsæt denne udækkede skål i en UV-lysboks.
  11. Vend UV-lysboksen mod bagsiden af BSC, og lad chipsene stå under konstant UV-lys i 30 minutter. Farven på opløsningen i chipsene ændres fra mørk pink til mahogni.
  12. Vask hver kanal ved at tilsætte 200 μL AR-2-opløsning til indløbet, mens du samtidig aspirerer fra udløbet.
  13. Hver kanal vaskes to gange ved at tilsætte 200 μL kold DPBS (-/-) til indtaget, samtidig med at der suges fra udløbet.
  14. Forbered den apikale kanalbelægning (200 μg/ml kollagen I og 30 μg/ml kollagen IV blanding i DMEM) (se materialetabel). Hold på is.
  15. Forbered basalkanalbelægningen (15 μg/ml PLL og 200 μg/ml kollagen I-blanding i DMEM). Hold på is.
  16. Tilsæt 200 μL basalkanalbelægning til basalkanalindløbet. Tilslut stikkontakten med en P200-spids, når belægningsopløsningen vises ved stikkontakten. Dispenser opløsningen, indtil indløbs- og udløbsspidsvolumenerne er ens, og slip derefter pipettespidsen fra pipetten, så spidsen efterlades i indløbet.
  17. På samme måde tilsættes 200 μL apikal kanalbelægning til den apikale kanal.
  18. Aspirer overskydende opløsning fra chipoverfladen.
  19. Kontroller alle chips for bobler. Fjern eventuelle bobler ved at tilføje mere kanalbelægning til de(n) berørte kanal(er).
  20. Chipsene inkuberes natten over i en 150 mm petriskål ved 37 °C med 5% CO2.

4. Såning chip basal kanal med HUF'er

  1. Se væksten af HUF'er i kolben under et mikroskop dagligt.
  2. Når HUF-kulturer er 70% -90% sammenflydende (~ 3 dage efter plettering), varm 25 ml FM, 5 ml Ca2+/Mg2+ fri DPBS (DPBS (-/-), 10 ml trypsin / EDTA og 15 ml trypsinneutraliserende opløsning (TNS, se materialetabel) til 37 ° C.
  3. Opsug mediet fra kolberne. Vask med 5 ml DPBS (-/-), og aspirer derefter igen.
  4. Der tilsættes 4 ml trypsin-EDTA til hver kolbe og inkuberes ved 37 °C i 3-5 minutter, indtil cellerne løsner sig.
  5. Der tilsættes 6 ml TNS til hver kolbe, og cellesuspensionen overføres til et 15 ml konisk rør.
  6. Suspensionen blandes godt med en pipette og tager en 10 μL alikvote til celletælling. Bland 10 μL cellesuspension med 10 μL trypanblåt og tæl ved hjælp af et hæmocytometer.
  7. Centrifugecellesuspension ved 300 x g i 5 minutter ved RT. Supernatanten suges til syn, og pelletpen resuspenderes i varm FM til en slutkoncentration på 7,5 x 105 celler/ml.
  8. Basalkanalen vaskes med 200 μL FM.
  9. Der opvarmes 15 ml VEM til 37 °C. Den apikale kanal vaskes med 200 μL VEM.
  10. Der tilsættes 200 μL komplet VEM til det apikale kanalindløb, mens stikkontakten tilsluttes med en pipettespids. Dispenser mediet, indtil indløbs- og udløbsspidsvolumenerne er ens, og slip derefter pipettespidsen fra pipetten, og lad spidsen være i indløbet. Hold den øverste kanal fyldt og tilsluttet ved både indløb og stikkontakt.
  11. Der pipetteres langsomt 50 μL HUF-cellesuspension ind i basalkanalindløbet, samtidig med at der suges fra udløbet. Fjern pipettespidsen fra indtaget, når ~2 μL af cellesuspensionen forbliver i pipettespidsen uden at trykke på eller slippe pipettestemplet for at undgå bobledannelse. Tilslut indløbet og stikkontakten med pipettespidser.
  12. Kontroller for bobler under et mikroskop. Hvis de er til stede, skal du vaske basalkanalen med FM og gentage trin 4.11.
  13. Vend de tilsluttede chips på hovedet på en 15 ml rørrist og inkuber ved 37 °C med 5% CO2 i 1 time. Overhold chipsene efter inkubation og kontroller for cellevedhæftning.
  14. Sæt basalkanalens udløb med en pipettespids. Der tilsættes 200 μL FM til basalkanalens indgang uden at trykke pipettestemplet ned. Frigør pipettens spids, og lad mediet strømme frit gennem kanalen til udløbspipettespidsen ved hjælp af tyngdekraften.
  15. HUF-seedede chips inkuberes natten over ved 37 °C med 5% CO2.

5. Såning chip apikal kanal med vaginale epitelceller

  1. Varm 50 ml VEM til 37 °C.
  2. Forbered apikal kanalbelægning (200 μg/ml kollagen I i DMEM). Hold på is.
  3. Tilslut den apikale kanaludgang med en pipettespids.
  4. Tilsæt 200 μL apikal kanalbelægning til det apikale kanalindløb. Dispenser den apikale belægningsopløsning, indtil indløbs- og udløbsspidsvolumenerne er ens, og slip derefter pipettespidsen fra pipetten, og lad spidsen være i indløbet.
  5. Aspirer overskydende opløsning fra overfladen af chippen.
  6. Der inkuberes chips ved 37 °C med 5% CO2 i 1 time.
  7. Efter 1 time vaskes den apikale kanalbelægning ved at tilsætte 200 μL VEM til det apikale kanalindtag, mens der suges fra udløbet.
  8. Kontroller HVEC-vækst under et mikroskop for ~ 70% -90% sammenløb.
  9. Hvis cellerne er 70% -90% sammenflydende, opvarmes 6 ml komplet vaginal epitelcellemedium og 4 ml trypsin / EDTA pr. kolbe til 37 ° C.
  10. Opsug substratet fra HVEC-kolben og vask med 5 ml DPBS (-/-), og aspirer derefter.
  11. Der tilsættes 4 ml trypsin til hver kolbe og inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 3-5 minutter, indtil cellerne løsner sig.
  12. Der tilsættes 6 ml VEM til kolben for at inaktivere trypsin og overføre cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør.
  13. Suspensionen blandes godt med en pipette og tager en 10 μL alikvote til celletælling. Bland 10 μL cellesuspension med 10 μL trypanblåt og tæl ved hjælp af et hæmocytometer.
  14. Centrifugercellesuspension ved 300 x g i 5 minutter ved RT. Supernatanten suges op, og pellet i VEM resuspenderes til en slutkoncentration på 3,5-4 mio. celler/ml.
  15. Varm 25 ml FM til 37 °C.
  16. Tilslut den apikale kanaludgang med en pipettespids. Langsomt pipetteres mindst 40 μL HVEC-cellesuspension ind i det apikale kanalindløb. Dispenser cellesuspensionen, indtil indløbs- og udløbsspidsvolumenerne er ens, og slip derefter pipettespidsen fra pipetten, og lad spidsen være i indløbet. Hold basalkanalen fyldt med FM og tilsluttet ved både indløb og stikkontakt.
  17. Aspirer forsigtigt overskydende medium på overfladen af chips og kontroller for bobler under et mikroskop. Gentag trin 5.16, hvis de er til stede.
  18. Chips lægges i en stor petriskål og inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 natten over.
  19. Den næste dag skal du observere chips under et mikroskop til cellefastgørelse.
  20. Fjern pipettespidserne fra indløb og udløb i både apikale og basale kanaler.
  21. Tilslut basalkanalens udgang med en pipettespids, og tilsæt 200 μL FM til basalkanalens indgang uden at trykke pipettestemplet ned. Frigør pipettespidsen fra pipetten, og lad mediet strømme frit gennem kanalen til udløbspipettespidsen ved hjælp af tyngdekraften.
  22. Gentag trin 5.21 for den apikale kanal ved hjælp af VEM.
  23. De dobbeltseedede chips inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.

6. Tilslutning af chips til bælg og differentiering af vaginale epitelceller

  1. Alikvote 50 ml FM og VEM til adskillelse af 50 ml koniske rør og varme til 37 °C.
  2. Afgasning af FM- og VEM-mediet opvarmes til 37 °C under sterilt vakuum i 5 minutter.
  3. Desinficer og rengør bakker til Dynamic Flow Module (DFM, se materialetabellen). Fjern bælgene fra emballagen, og læg dem i bakkerne.
  4. Der tilsættes 2 ml afgasset VEM til det apikale indløbsreservoir (øverste højre reservoir; Figur 1B). Tilføj medium langs reservoirvæggene for at undgå bobledannelse.
  5. Der tilsættes 3 ml afgasset FM til basalindløbsbeholderen (øverste venstre reservoir, figur 1B). Tilføj medium langs reservoirvæggene for at undgå bobledannelse.
  6. Der tilsættes 500 μL afgasset VEM til den apikale udløbsbeholder (nederst til højre reservoir, figur 1B). Vip bælgen, så mediet dækker hele bunden af reservoiret.
  7. Der tilsættes 500 μL afgasset FM til basaludløbsbeholderen (nederste venstre reservoir, figur 1B). Vip bælgen, så mediet dækker hele bunden af reservoiret.
  8. Skub bakker med pods ind i DFM, og kør Prime-cyklussen to gange. Kontroller, om der kommer dråber ud af portene på undersiden af hver pod.
  9. Hvis der ikke dannes en dråbe efter 4 "Prime"-cyklusser, skal du komme i direkte kontakt med porten inde i podens udløbsbeholder (figur 1B) og pipette 200 μL af det respektive medium for at lade mediet strømme mellem reservoiret og kanalen. Dette kaldes "Hand-priming".
  10. Fjern pipettespidser fra chips, og placer en dråbe af det respektive medium over alle porte for hver chip.
  11. Skub chips i bælg og placer bælg på bakker.
  12. Opsug ethvert medie på overfladen af chipsene, og skub hver bakke ind i en DFM.
  13. Indstil følgende parametre på DFM som: Top og bund - flydende; Apical (Top Channel) Flow - 15 μL / h; Basal (bundkanal) flow - 30 μL / h; Stræk = 0%; Frekvens = 0 Hz.
  14. Kør programmet Reguler på DFM'en, og lad flowet løbe natten over.
  15. Efter 24 timer ændres flowindstillingerne til 0 μL/h for den apikale kanal, og basalkanalen holdes ved 30 μL/h strømningshastighed i yderligere 24 timer.
  16. Forbered 500 ml differentieringsmedium (DM) ved at tilsætte 4 mM L-glutamin, 20 mM hydrocortison, 1x ITES, 20 nM Triiodothyronin, 100 μM O-phosphorylethanolamin, 180 μM adenin, 3,2 mM calciumchlorid, 2% varmeinaktiveret FBS, 1% Pen-strep og 120 ml skinkes F-12-medier til DMEM med lav glukose (se materialetabel) og filtrer-sterilisere.
  17. Varm 50 ml DM til 37 °C.
  18. Tilsæt 20 μL 10 μM østradiol (se materialetabel) til 50 ml DM, bland godt og afgas under sterilt vakuum i 5 minutter.
  19. 50 ml VEM opvarmes til 37 °C i vandbad og afgasses under sterilt vakuum i 5 minutter.
  20. Fjern bakkerne fra DFM'en, læg dem i en BSC, og aspirer medier fra bælgene, undgå portene i reservoirerne (figur 1A). Derefter tilsættes 2 ml VEM til det apikale kanalindløbsreservoir og 3 ml DM til basalkanalindløbsreservoiret.
  21. Sæt bakkerne tilbage i DFM'en, og indstil den apikale kanalstrøm til 15 μL/h og basalkanalstrømmen til 30 μL/h.
  22. Lad DFM flyde i 4-7 timer. Stop derefter den apikale kanalstrøm ved at indstille den til 0 μL / h. Lad basalkanalstrømmen fortsætte ved 30 μL/h.
  23. Skift mediet ved at følge trin 6.16-6.19 hver 48. time.
  24. Flowmedier periodisk i den apikale kanal i 4-7 timer hver dag i yderligere 5 dage efter trin 6.20-6.21.
  25. Forbered Hanks' afbalancerede saltopløsning med lav bufferkapacitet med glukosemedier (HBSS (LB/+G)) ved tilsætning af 1,26 mM calciumchlorid, 0,49 mM magnesiumchloridhexahydrat, 0,406 mM magnesiumsulfat, 5,33 mM kaliumchlorid, 137,93 mM natriumchlorid, 0,441 mM kaliumphosphatmonobasisk og 5,55 mM D- glucose til ddH2O(se materialetabel); pH 4,8.
  26. Forbered 500 ml Pen-Strep-fri DM ved at tilføje 4 mM L-glutamin, 20 mM hydrocortison, 1x ITES, 20 nM Triiodothyronin, 100 μM O-phosphoryl ethanolamin, 180 μM adenin, 3,2 mM calciumchlorid, 2% varmeinaktiveret FBS og 120 ml skinkes F-12 medier til DMEM med lav glukose og filtersterilisere.
  27. På dag 6 skal du udskifte det apikale kanalmedium med (HBSS (LB/+G)) og basalkanalmediet med Pen-Strep-fri DM ved at følge trin 6.16-6.19.
  28. Indstil flowet på DFM til 15 μL/h for den apikale kanal og 30 μL/h for basalkanalen i 24 timer, før du fortsætter med bakteriepodning.

7. Bakteriel podning af differentierede chips

BEMÆRK: Udfør følgende trin i et laboratorium og BSC, der overholder reglerne for håndtering af mikrober.

  1. Beregn CFU/ml for hver bakteriestamme, der skal indgå i podningen. Bland den nødvendige mængde af hver bakteriestamme til i alt op til ~ 5 x 106 CFU / ml.
  2. Blandingen centrifugeres ved 7 000 x g i 7 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes forsigtigt. Opslæmp pelletten igen (HBSS (LB/+G)). Dette vil være bakteriens inokulum.
  3. Fjern chips fra bælg. Tilslut basalkanalens udløb med en pipettespids, og tilsæt 200 μL Pen-Strep-fri DM til basalkanalindtaget uden at trykke pipettestemplet ned. Frigør pipettespidsen fra pipetten, og lad mediet strømme frit gennem kanalen til udløbet ved tyngdekraften.
  4. Tilsæt 37 μL bakterieinokulum til det apikale kanalindløb, mens du aspirerer fra udløbet. Når der er ca. 2 μL tilbage i pipettespidsen, trækkes spidsen ud, og den apikale kanalindgang og -udgang sættes i stikkontakten med pipettespidser.
  5. For kontrolchips (ikke-inokulerede) gentages trin 7.4 med 37 μL (HBSS (LB/+G)).
  6. Opsug ethvert medie på overfladen af chippen. Chipsene anbringes i en 150 mm petriskål og inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 24 timer.
  7. Bælgene (uden chips) anbringes på bakkerne og anbringes i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 i 24 timer.
  8. Varm 50 ml (HBSS (LB/+G)) og 50 ml Pen-Strep-fri DM til 37 °C.
  9. Tilsæt 20 μL 10 μM østradiol til 50 ml Pen-Strep-fri DM, bland godt og afgas under sterilt vakuum i 5 minutter. Afgas (HBSS (LB/+G)) under vakuum i 5 min.
  10. Aspirer forsigtigt mediet i bælgene, mens du undgår reservoirets indløbs- og udløbsporte.
  11. Der tilsættes 3 ml afgasset (HBSS (LB/+G)) til den apikale indløbskapselbeholder og 500 μL afgasset (HBSS (LB/+G)) til den apikale udløbskapselbeholder.
  12. Tilsæt 3 ml afgasset Pen-Strep-fri DM til reservoiret med basalindløbskapsler og 500 μL afgasset antibiotikafri DM til basaludløbskapslen.
  13. Skub bakker med bælgene (uden chips) ind i DFM'en, og kør Prime-cyklussen to gange. Kontroller, om der kommer dråber ud af hver port på undersiden af kapslen.
    BEMÆRK: Hvis der ikke dannes en dråbe efter 4 "Prime"-cyklusser, skal du komme i direkte kontakt med porten inde i kapslens udløbsbeholder (figur 1B) og pipette 200 μL af det respektive substrat for at lade mediet strømme mellem reservoiret og kanalen.
  14. Fjern pipettespidser fra chips, og placer en dråbe af de respektive medier over alle kanalens indløb og udløb.
  15. Skub chips i bælg og placer bælg i bakker.
  16. Aspirat medier i apikale og basale udløbspodreservoirer og ethvert medie på overfladen af chipsene. Skub derefter bakkerne ind i DFM.
  17. Indstil følgende parametre på DFM: Top og bund - flydende; Apical (Top) Flow - 40 μL / h; Basal (bund) strømning - 40 μL / h; Stræk - 0%; Frekvens - 0 Hz. Kør cyklussen Reguler .
  18. Stop strømmen efter 4 timer og opsaml spildevandet, dvs. mediet i de apikale og basale udløbsreservoirer.
  19. Mål og registrer spildevandsmængderne.
  20. Sæt spånerne tilbage i DFM'en, og indstil den apikale strømningshastighed til 0 μL/h og basalstrømmen til 30 μL/h. Start flowet for at køre natten over.
  21. Det opsamlede spildevand anvendes til forskellige planlagte assays og opbevares ved passende temperaturer.
    BEMÆRK: Til CFU-måling tilsættes glycerol til en slutkoncentration på 16% og opbevares straks ved -80 °C.
  22. Opsug mediet i kun basaludløbsreservoirerne, og indstil apikale og basale strømningshastigheder til 40 μL / h i DFM. Start flowet i 4 timer, og gentag trin 7.18-7.21. Dette vil være spildevandsopsamlingen i 48 timer.
  23. Gentag trin 7.22 i 72 timer, eller indtil eksperimentet slutter.
  24. Ved forsøgets slutning indsamles spildevandet ved at følge trin 7.18-7.19.
  25. Forbered fordøjelsesopløsningen ved at tilsætte 1 mg/ml Collagenase IV i TrypLE express. 10 ml fordøjelsesopløsning opvarmes til 37 °C.
  26. Sæt udløbsporten på basalkanalen med en pipettespids. Tilsæt 100 μL fordøjelsesopløsning til basalkanalen. Bland godt, og brug en pipette til at samle al opløsningen fra kanalen i et rør mærket som 'Tube B'.
  27. Sæt udløbsporten på den apikale kanal med en pipettespids. Tilsæt 100 μL fordøjelsesopløsning til den apikale kanal. Bland godt, og brug en pipette til at samle al opløsningen fra kanalen i et rør mærket som 'Tube A'.
  28. Tilsæt yderligere 100 μL af fordøjelsesopløsningen til både de apikale og basale kanalindtag, mens du tilslutter udløbene med pipettespidser. Chips og rør A og B inkuberes ved 37 °C i 1-1,5 timer.
  29. Bland fordøjelsesindholdet godt inde i kanalerne ved hjælp af de tilsluttede spidser, der allerede er placeret i indløb og stikkontakter. Saml indholdet af de apikale og basalkanalerne til henholdsvis rør A og B. Disse er chip apikale og basale fordøjelser.
  30. Tæl cellerne i rør A ved hjælp af et hæmocytometer. Fjern også en delprøve fra chipfordøjelserne til CFU-måling ved at følge trin 7.21.

8. Analyse af spånspildevand og -fordøjelser

  1. Til tælling af bakterier fra spildevand og fordøjelser seriefortyndes spildevandet eller fordøjelserne i steril DPBS (-/-) og pladen på en egnet medieplade, inkuberes ved 37 °C i 24-48 timer, og kolonierne tælles på pladen.
  2. Til måling af pH udtages 10 μL af 72 timers spildevandet umiddelbart efter opsamlingen, og der anvendes en pH-strimmel til måling af spildevandets pH-værdi.
  3. Til analyse af cytokinerne skal spildevandet anvendes til at detektere specifikke cytokiner ved hjælp af Luminex-baseret assay, ELISA eller enhver anden anvendelig teknik29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den menneskelige vagina er foret med et lagdelt epitel, der ligger over en fibroblastrig kollagenøs stroma. For at modellere dette blev en vævsgrænseflade skabt ved at dyrke primært humant vaginalt epitel og fibroblaster på modsatte sider af en fælles porøs membran i en tokanals mikrofluidisk organchipenhed. Dannelsen af vaginalepitelet overvåges ved hjælp af lys feltmikroskopisk billeddannelse, som afslører dannelsen af et kontinuerligt ark celler, der gradvist danner flere cellelag (figur 2A). Tidligere rapporter bekræftede, at denne morfologi korrelerer med udviklingen af et fuldt stratificeret epitel, når det ses i tværsnit29. Men hvis epitellaget forekommer ujævnt og diskontinuerligt (figur 2B), er vaginachippen muligvis ikke egnet til brug i forsøg.

Figur 3 viser en skematisk gengivelse af dannelsen af vaginachippen. For at validere funktionaliteten af Vagina Chip blev chipsene podet med L. crispatus og G. vaginalis for at modellere henholdsvis sunde og dysbiotiske vaginale miljøer. G. vaginalis er bakterien primært involveret i bakteriel vaginose. For at kontrollere, om sunde og dysbiotiske bakterier engraft på vaginachips, blev bakteriebelastningen kvantificeret i vaginachipsene podet med de forskellige bakteriepopulationer ved plettering af kanalspildevand og fordøjede cellelag på selektive bakterielle vækstmedier (De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) agar for L. crispatus og Brucella blodagar (BBA) for G. vaginalis) (se materialetabel) og sammenligne dem med lignende kulturer ved hjælp af det originale podemateriale. Kolonier af L. crispatus og G. vaginalis blev påvist inden for 48 timer efter plettering (figur 2C), hvilket bekræfter, at både sunde og dysbiotiske bakterier indpodet i vaginachips. Men hvis bakteriekolonier observeres på pladerne indeholdende podningerne, men ikke observeres på plader, der indeholder spildevandet eller fordøjes efter den krævede inkubation, kan det konkluderes, at bakterierne ikke blev indpodet.

Et sundt vaginalt miljø er surt, og dysbiose resulterer i en stigning i vaginal pH31. Derfor blev pH i spildevandet i den apikale epitelkanal i Vagina Chip også analyseret. PH-værdien i vaginachips podet med L. crispatus svarede til den i ikke-inokulerede kontrolchips, og når de blev dyrket sammen med G. vaginalis , oplevede de signifikant øget pH (figur 2D). Hvis pH-værdien af en uinficeret vaginachip observeres at være høj, indikerer det, at der er et problem, og disse chips bør ikke bruges til forsøg.

Den inflammatoriske tilstand af vaginalt væv er også følsom over for sammensætningen af det vaginale mikrobiom, med et dysbiotisk mikrobiom, der stimulerer inflammation. Efter analyse af de proinflammatoriske cytokiner i den apikale kanal i vaginachippen 3 dage efter podning med enten L. crispatus eller G. vaginalis blev det proinflammatoriske respons ligeledes fundet at være højere med G. vaginalis sammenlignet med uinficerede chips og chips podet med L. crispatus (figur 2E). Samlet set viser disse resultater, at Vagina Chip nøje efterligner det menneskelige vaginale mikromiljø i både sunde og dysbiotiske tilstande.

Figure 1
Figur 1: En tokanals chip og dens pod. (A) Billede af en tokanals PDMS-chip, der viser dens kanaler og porte. (B) Billede af en pod, der viser reservoirer og porte til apikale og basale kanaler. (C) Skematisk diagram, der viser tværsnitsbilledet af en vaginachip inficeret med mikrober. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Vagina Chip efterligner sunde og dysbiotiske humane vaginale mikromiljøer. (A) Vaginale epitelceller i den apikale kanal i en robust vaginachip. Skalabjælken repræsenterer 1 mm af chippen i det øverste billede og 500 μm i det nederste billede. (B) Vaginale epitelceller i den apikale kanal i en utilstrækkelig vaginachip. Skalabjælken repræsenterer 1 mm af chippen i det øverste billede og 500 μm i det nederste billede. c) Engraftment af L. crispatus (LC) og G. vaginalis (GV) i vaginachippen. (D) pH i vaginachips efter 72 timers inkubation med L. crispatus (LC) og G. vaginalis (GV) sammenlignet med uinficerede vaginachips (kontrolchips). (E) Proinflammatorisk respons af vaginachips på L. crispatus (LC) og G. vaginalis (GV) efter 72 timers inkubation sammenlignet med uinficerede (kontrol) vaginachips. (C-E) Grafer viser middel ± SD for 4-6 chips; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 sammenlignet med kontrol Vagina Chips; Hver (●) repræsenterer data fra 1 chip. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skematisk gengivelse af protokollen for generering af vaginachippen. Skematisk repræsentation af de trin, der er involveret i såning af celler og generering af vaginachippen. HVEC'er - Humane vaginale epitelceller; HUF'er - Human livmoderfibroblaster; VEM - Vaginal epitelmedium; FM - Fibroblast medier; DM - Differentieringsmedium; PS - Penicillin Streptomycin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere in vitro-modeller af den menneskelige vagina replikerer ikke trofast vaginale vævsstrukturer, væskestrøm og værtspatogeninteraktioner19,22. Dyremodeller er også begrænset af variation mellem arter i mikrobiom og forskelle i østrus- eller menstruationscyklus19,22. Dette manuskript beskriver en protokol til oprettelse af en Organ Chip-model af den menneskelige vagina, der effektivt kan efterligne menneskelige reaktioner på sunde og dysbiotiske mikrobielle samfund.

Denne protokol involverer såning af vaginale epitel- og fibroblastceller på modsatte sider af en delt porøs membran, der adskiller parallelle mikrokanaler i en tokanals organchipenhed, der er kommercielt tilgængelig (se materialetabel). Den porøse membran muliggør migration af vækstfaktorer og andre former for intercellulær kommunikation. Imidlertid forhindrer kollagenbelægningen og tilstedeværelsen af cellemonolagene blanding af medier mellem kanaler. Ved dannelsen af et vaginalt epitelcellemonolag i den apikale kanal indføres differentieringsfaktorer i mediet, der strømmer i basalkanalen, som passerer gennem det interstitielle rum og derved fremmer differentiering af de vaginale epitelceller til dannelse af et stratificeret epitel. Tætheden af vaginale epitelceller på tidspunktet for såning er en afgørende determinant for sundheden for Vagina Chip i slutningen af differentieringsfasen. Således bør tætheden af vaginale epitelceller vurderes, før differentiering påbegyndes, hvilket ikke bør initieres, før et monolag er etableret. Eksponering for differentieringsfaktorerne kan fortsættes, indtil den ønskede tæthed af vaginale epitelceller opnås og før bakteriel podning. Det skal endvidere bemærkes, at væksthastigheden kan variere for primære vaginale epitelceller fra forskellige donorer (eller kommercielle kilder), hvilket kan påvirke kvaliteten af den genererede vaginachip. I alle mikrofluidiske organchipundersøgelser er det yderst vigtigt at fjerne eventuelle bobler, der kan dannes i kanalerne i hele chipkulturen, da de forstyrrer mediestrømmen og i sidste ende vil resultere i reduceret næringsstoftilgængelighed og tab af cellelevedygtighed.

Denne protokol beskriver også, hvordan man bruger Vagina Chip til at etablere bakterielle samfund på chippen, der efterligner enten den sunde vaginale tilstand eller bakteriel vaginose. Vagina Chip kan også bruges til at studere andre vaginale sygdomme eller lidelser; Der bør dog udvises omhu for at forstå hver enkelt sygdoms karakteristika og de bedste midler til at korrelere resultater med kliniske fund, når disse undersøgelser udføres. Sammenfattende åbner den menneskelige vaginachip nye veje til at studere en overflod af sygdomme og tilstande relateret til FRT, og det kan være et værdifuldt værktøj til at undersøge potentielle behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Donald Ingber er grundlægger, bestyrelsesmedlem, videnskabelig rådgivende bestyrelsesformand og aktionær i Emulate. De øvrige forfattere erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Denne forskning blev sponsoreret af finansiering fra Bill and Melinda Gates Foundation (INV-035977) og Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering ved Harvard University. Vi takker også Gwenn E. Merry, Wyss Institute, for at redigere dette manuskript. Diagrammet i figur 1 er oprettet med BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Steriflip Millipore  SCGP00525 To degas media
2 channel chip Emulate BRK-S1-WER-24 Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips) Thomas Scientific, SHARP 1159M40 Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)  Emulate Chip S1 Basic Research kit-24PK Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C  
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)  Emulate Chip S1 Basic Research kit-24PK Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine Sigma Aldrich  A2786 Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates VWR International Inc.  89405-032 with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-) ScienCell 303 For washing cells
Calcium Chloride Sigma Aldrich  C5670 Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)  Sigma Aldrich  499609 Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I  Corning 354236 For the coating solution for HVEC
Collagen IV  Sigma Aldrich  C7521 For the coating solution for HVEC
Collagenase IV Gibco 17104019 For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium  ScienCell 2301 Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium Lifeline LL-0068 Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)  Sigma Aldrich  158968 Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)  Thermofisher 12320-032 Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë) Emulate Zoë-CM1 Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12 Thermofisher 11765-054 Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS  Thermofisher  10438018 Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts ScienCell 7040 HUF
Human vaginal epithelial cells Lifeline FC-0083 HVEC
Hydrocortisone Sigma Aldrich  H0396 Component of the Differentiation media
ITES Lonza 17-839Z Component of the Differentiation media
L-glutamine Thermofisher 25030081 Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich  M2393 Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich  M1880 Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates VWR International Inc.  89407-214 For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine Sigma Aldrich  P0503 Component of the Differentiation media
Pen/Strep Thermofisher  15070063 Component of the Differentiation media
pH strips Fischer-Scientific 13-640-520 For measurement of pH 
Pods (1/chip)  Emulate BRK-S1-WER-24 Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine ScienCell 403 For the coating solution for HUFs
Potassium chloride  Sigma Aldrich  P3911 Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich  P0662 Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol  MP Biomedicals  113055034 For freezing bacterial samples
Triiodothyronine Sigma Aldrich   T6397 Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)  Sigma Aldrich  T8154 For counting live/dead cells
TrypLE Express Thermofisher  12605010 For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)  ScienCell 113 For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%) ScienCell 103 For cell dissociation 
β-estradiol  Sigma Aldrich  E2257 Hormone for differentiation media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Ravel, J. The vaginal microbiota, host defence and reproductive physiology. J Physiol. 595 (2), 451-463 (2017).
  2. Van De Wijgert, J., Jespers, V. The global health impact of vaginal dysbiosis. Res Microbiol. 168 (9-10), 859-864 (2017).
  3. Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: Cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
  4. Goldenberg, R. L., Hauth, J. C., Andrews, W. W. Intrauterine infection and preterm delivery. N Engl J Med. 342 (20), 1500-1507 (2000).
  5. Han, Y., Liu, Z., Chen, T. Role of vaginal microbiota dysbiosis in gynecological diseases and the potential interventions. Front Microbiol. 12, 643422 (2021).
  6. Leitich, H., Kiss, H. Asymptomatic bacterial vaginosis and intermediate flora as risk factors for adverse pregnancy outcome. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 21 (3), 375-390 (2007).
  7. Torcia, M. G. Interplay among vaginal microbiome, immune response and sexually transmitted viral infections. Int J Mol Sci. 20 (2), 266 (2019).
  8. Van Oostrum, N., De Sutter, P., Meys, J., Verstraelen, H. Risks associated with bacterial vaginosis in infertility patients: A systematic review and meta-analysis. Hum Reprod. 28 (7), 1809-1815 (2013).
  9. Lewis, F. M. T., Bernstein, K. T., Aral, S. O. Vaginal microbiome and its relationship to behavior, sexual health, and sexually transmitted diseases. Obstet Gynecol. 129 (4), 643-654 (2017).
  10. Hong, X., et al. The association between vaginal microbiota and female infertility: A systematic review and meta-analysis. Arch Gynecol Obstet. 302 (3), 569-578 (2020).
  11. Peelen, M. J., et al. The influence of the vaginal microbiota on preterm birth: A systematic review and recommendations for a minimum dataset for future research. Placenta. 79, 30-39 (2019).
  12. Smith, P. P., et al. Outcomes in prevention and management of miscarriage trials: A systematic review. BJOG. 126 (2), 176-189 (2019).
  13. Harp, D. F., Chowdhury, I. Trichomoniasis: Evaluation to execution. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 157 (1), 3-9 (2011).
  14. Pastorek, J. G., Cotch, M. F., Martin, D. H., Eschenbach, D. A. Clinical and microbiological correlates of vaginal trichomoniasis during pregnancy. The vaginal infections and prematurity study group. Clin Infect Dis. 23 (5), 1075-1080 (1996).
  15. Petrin, D., Delgaty, K., Bhatt, R., Garber, G. Clinical and microbiological aspects of trichomonas vaginalis. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 300-317 (1998).
  16. Edwards, T., Burke, P., Smalley, H., Hobbs, G. Trichomonas vaginalis: Clinical relevance, pathogenicity and diagnosis. Crit Rev Microbiol. 42 (3), 406-417 (2016).
  17. Eade, C. R., et al. Identification and characterization of bacterial vaginosis-associated pathogens using a comprehensive cervical-vaginal epithelial coculture assay. PLoS One. 7 (11), e50106 (2012).
  18. Fichorova, R. N., Yamamoto, H. S., Delaney, M. L., Onderdonk, A. B., Doncel, G. F. Novel vaginal microflora colonization model providing new insight into microbicide mechanism of action. mBio. 2 (6), e00168 (2011).
  19. Herbst-Kralovetz, M. M., Pyles, R. B., Ratner, A. J., Sycuro, L. K., Mitchell, C. New systems for studying intercellular interactions in bacterial vaginosis. J Infect Dis. 214, S6-S13 (2016).
  20. Johnson, A. P., et al. A study of the susceptibility of three species of primate to vaginal colonization with gardnerella vaginalis. Br J Exp Pathol. 65 (3), 389-396 (1984).
  21. Yildirim, S., et al. Primate vaginal microbiomes exhibit species specificity without universal lactobacillus dominance. ISME J. 8 (12), 2431-2444 (2014).
  22. Edwards, V. L., et al. Three-dimensional models of the cervicovaginal epithelia to study host-microbiome interactions and sexually transmitted infections. Pathog Dis. 80 (1), 026 (2022).
  23. Zhu, Y., et al. Ex vivo 2D and 3D HSV-2 infection model using human normal vaginal epithelial cells. Oncotarget. 8 (9), 15267-15282 (2017).
  24. Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infect Immun. 86 (11), e00282 (2018).
  25. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).
  26. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nat Biomed Eng. 3 (7), 520-531 (2019).
  27. Valiei, A., Aminian-Dehkordi, J., Mofrad, M. R. K. Gut-on-a-chip models for dissecting the gut microbiology and physiology. APL Bioeng. 7 (1), 011502 (2023).
  28. Izadifar, Z., et al. Mucus production, host-microbiome interactions, hormone sensitivity, and innate immune responses modeled in human endo- and ecto-cervix chips. bioRxiv. , (2023).
  29. Mahajan, G., et al. Vaginal microbiome-host interactions modeled in a human vagina-on-a-chip. Microbiome. 10 (1), 201 (2022).
  30. Masson, L., et al. Inflammatory cytokine biomarkers to identify women with asymptomatic sexually transmitted infections and bacterial vaginosis who are at high risk of HIV infection. Sex Transm Infect. 92 (3), 186-193 (2016).
  31. Amsel, R., et al. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med. 74 (1), 14-22 (1983).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 204
Modellering af sunde og dysbiotiske vaginale mikromiljøer i en menneskelig vagina-on-a-chip
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gulati, A., Jorgenson, A., Junaid,… More

Gulati, A., Jorgenson, A., Junaid, A., Ingber, D. E. Modeling Healthy and Dysbiotic Vaginal Microenvironments in a Human Vagina-on-a-Chip. J. Vis. Exp. (204), e66486, doi:10.3791/66486 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter