Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מידול מיקרו-סביבות נרתיקיות בריאות ודיסביוטיות בנרתיק אנושי על שבב

Published: February 16, 2024 doi: 10.3791/66486
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Vascular Biology Program and Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School, 3Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת מכשיר תרבית נרתיק על שבב (שבב נרתיק) מיקרופלואידי המאפשר לחקור אינטראקציות של מארח אנושי עם מיקרוביום נרתיקי חי בתנאים מיקרואירופיליים. שבב זה יכול לשמש ככלי לחקר מחלות נרתיקיות, כמו גם לפתח ולבדוק אמצעי נגד טיפוליים פוטנציאליים.

Abstract

בריאות האישה, ובמיוחד מחלות של מערכת הרבייה הנשית (FRT), לא קיבלו את תשומת הלב הראויה להם, למרות שמערכת רבייה לא בריאה עלולה להוביל למחלות מסכנות חיים, אי פוריות או תוצאות שליליות במהלך ההריון. מחסום אחד בתחום הוא שקיים מחסור במודלים פרה-קליניים וניסיוניים המחקים נאמנה את הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של ה-FRT. מודלים נוכחיים במבחנה ובבעלי חיים אינם משחזרים באופן מלא את השינויים ההורמונליים, התנאים המיקרואירוביים והאינטראקציות עם המיקרוביום הנרתיקי. הופעתה של טכנולוגיית תרבית מיקרופלואידית של איבר-על-שבב (Organ-on-a-Chip) שיכולה לחקות ממשקי רקמות-רקמות, זילוח כלי דם, זרימות נוזלים אינטרסטיציאליות והמיקרו-סביבה הפיזית של תת-יחידה עיקרית של איברים אנושיים יכולה לשמש כפתרון לבעיה זו. לאחרונה פותח שבב נרתיק אנושי התומך בתרבית משותפת של קונסורציום מיקרוביאלי נרתיקי אנושי עם אפיתל נרתיקי אנושי ראשוני המתממשק גם עם סטרומה נרתיקית וחווה זרימת נוזלים דינמית. שבב זה משכפל את התגובות הפיזיולוגיות של הנרתיק האנושי למיקרוביום בריא ודיסביוטי. פרוטוקול מפורט ליצירת שבבי נרתיק אנושיים תואר במאמר זה.

Introduction

מיקרוביום נרתיקי הנשלט על ידי Lactobacillus spp. המסייע לשמור על מיקרו-סביבה חומצית ממלא תפקיד חשוב בשמירה על בריאות הרבייה הנשית1. עם זאת, לעיתים יכול להתרחש שינוי בהרכב קהילות החיידקים המרכיבות את המיקרוביום, מה שמביא לגידול במגוון חיידקי הנרתיק. שינויים דיסביוטיים אלה, אשר לעתים קרובות גורמים למעבר ממצב הנשלט על ידי לקטובצילוס למצב הנשלט על ידי מיני חיידקים אנאירוביים מגוונים יותר (למשל, Gardnerella vaginalis), קשורים למחלות שונות של מערכת הרבייה, כגון וגינוזיס חיידקי, דלקת נרתיק אטרופית, דלקת בדרכי השתן, קנדידה פות-וגינלית, דלקת מפרקים וכוריאמניוניטיס 2,3,4,5 . מחלות אלה, בתורן, מגדילות את סיכויי האישה לחלות במחלות מין ומחלות דלקתיות באגן 6,7,8,9. הם גם מהווים סיכון גבוה יותר ללידה מוקדמת והפלות אצל נשים הרות 10,11,12 וגם היו מעורבים באי פוריות 13,14,15,16.

למרות שנעשו מאמצים למדל דיסביוזיס נרתיקי באמצעות תאי אפיתל נרתיקי שגודלו בתרבית במערכות תרבית סטטיות דו-ממדיות (2D)17,18, הם אינם מחקים ביעילות את הפיזיולוגיה והמורכבות של מיקרו-סביבה נרתיקית19. מודלים של בעלי חיים שימשו גם לחקר דיסביוזיס בנרתיק; עם זאת, שלבי הווסת שלהם והאינטראקציות בין המיקרוביום לפונדקאי שונים מאוד מאלה שבבני אדם, ולכן הרלוונטיות הפיזיולוגית של תוצאות מחקרים אלה נותרה לא ברורה 19,20,21. כדי לנטרל בעיות אלה, אורגנואידים ומודלים של Transwell insert של רקמת נרתיק אנושית שימשו גם לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן ב- FRT 19,22,23,24. אבל מכיוון שמדובר בתרביות סטטיות, הן יכולות לתמוך רק בתרבית משותפת של תאים אנושיים עם מיקרובים חיים לפרק זמן קצר (<16-24 שעות), והן חסרות תכונות פיזיות רבות אחרות שעשויות להיות חשובות של המיקרו-סביבה הנרתיקית האנושית, כגון ייצור ריר וזרימת נוזלים22.

שבבי איברים הם מערכות תרבית מיקרופלואידיות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) המכילות מיקרו-ערוץ חלול מקביל אחד או יותר המרופדים בתאים חיים בתרבית תחת זרימת נוזל דינמית. השבבים הדו-ערוציים מאפשרים יצירה מחדש של ממשקי רקמה-רקמה ברמת האיבר על-ידי תרבית סוגי תאים שונים (למשל, אפיתל ופיברובלסטים של סטרומה או אפיתל ואנדותל כלי דם) משני צדי קרום נקבובי המפריד בין שתי התעלות המקבילות (איור 1). שתי הרקמות יכולות להיחשף באופן עצמאי לזרימת נוזלים, והן יכולות גם לחוות תנאים מיקרואירוביים המאפשרים תרבית משותפת עם מיקרוביוםמורכב 25,26,27,28. גישה זו מונפה לאחרונה לפיתוח שבב נרתיק אנושי מרופד באפיתל נרתיקי ראשוני רגיש להורמונים המתממשק עם פיברובלסטים סטרומליים בסיסיים, השומר על ריכוז חמצן פיזיולוגי נמוך בלומן האפיתל ומאפשר תרבית משותפת עם מיקרוביום בריא ודיסביוטי למשך 3 ימים לפחות במבחנה29. הוכח כי שבב הנרתיק יכול לשמש לחקר נשאות על ידי קונסורציום L. crispatus אופטימלי (בריא) ולזהות דלקת ופציעה הנגרמת על ידי קונסורציום G. vaginalis לא אופטימלי (לא בריא) המכיל קונסורציומים. כאן, אנו מתארים בפירוט את השיטות המשמשות ליצירת שבב הנרתיק האנושי, כמו גם להקמת קהילות חיידקים בריאות ודיסביוטיות על שבב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות מוסדיות לשימוש בתאים אנושיים. התאים הושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים). כל השלבים צריכים להתבצע באופן אספטי בארון בטיחות ביולוגית (BSC). השתמש רק בעצות פיפטה מסנן (או מחסום) עבור פרוטוקול זה.

1. טיפוח תאי אפיתל בנרתיק האנושי

  1. חם 50 מ"ל של תווך אפיתל הנרתיק (VEM, ראה טבלה של חומרים) עד 37 ° C.
  2. Aliquot 9 מ"ל של VEM לצינור 15 מ"ל. לאחר מכן, הפשיר בקבוקון של תאי אפיתל נרתיקי אנושיים (HVECs), והוסף אותו לצינור המכיל VEM.
  3. צנטריפוגו את הצינור 15 מ"ל ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ושאפו את הסופרנטנט, משאירים את הגלולה מאחור.
  4. השהה מחדש בעדינות את הגלולה ב- 2 מ"ל של VEM והוסף 1 מ"ל לכל אחת משתי צלוחיות T75 המכילות 14 מ"ל VEM.
  5. לדגור על צלוחיות ב 37 ° C עם 5% CO2. שנה VEM כל יומיים עד HVECs הם כ 70% confluent (כ 5 ימים).

2. גידול תאי פיברובלסטים ברחם אנושיים

  1. הכן 10 מ"ל של 15 מיקרוגרם/מ"ל תמיסת פולי-L-ליזין (PLL) במים מזוקקים כפול (ddH2O). הוסף 5 מ"ל של תמיסת PLL לכל אחת משתי צלוחיות T75 ודגור ב- 37 ° C למשך שעה אחת.
  2. חם 50 מ"ל של מדיום פיברובלסט (FM, ראה טבלת חומרים) עד 37 ° C.
  3. שאפו את תמיסת PLL ושטפו כל בקבוק עם 5 מ"ל של ddH2O.
  4. Aliquot 9 מ"ל של FM לצינור 15 מ"ל ולהפשיר בקבוקון של פיברובלסטים ברחם אנושי (HUFs).
  5. הוסף את HUFs לצינור 15 מ"ל המכיל FM.
  6. צנטריפוגו את צינור 15 מ"ל ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT ושאפו את supernatant, משאיר את כדור התא מאחור.
  7. השהה מחדש בעדינות את הגלולה ב- 2 מ"ל FM והוסף 1 מ"ל לכל אחת משתי צלוחיות T75 המכילות 14 מ"ל FM.
  8. לדגור צלוחיות ב 37 ° C עם 5% CO2 עד התאים הם כ 70% confluent תוך שינוי המדיום כל 2 ימים.

3. הפעלת שבב וציפוי ערוצים

  1. משחררים את השבבים (המתקבלים באופן מסחרי, ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות במייבש ואקום.
  2. אפשר למגיב ההפעלה 1 (AR-1) ולמגיב ההפעלה 2 (AR-2) (ראה טבלת חומרים) לאזן ל- RT למשך 15 דקות מבלי להסיר את האריזה שלהם.
  3. עטפו צינור חרוטי בנפח 15 מ"ל בנייר כסף כדי להגן עליו מפני אור. הוסף לאט 1 מ"ל של תמיסת AR-2 לדפנות בקבוקון AR-1 וערבב היטב. מעבירים את התערובת לצינור 15 מ"ל עטוף בנייר כסף.
  4. הוסף שוב ושוב תמיסת AR-2 לבקבוקון AR-1 במרווחים של 1 מ"ל עד שאבקת AR-1 נשטפת במלואה מהבקבוקון.
  5. טען את הפתרון המשוחזר של AR-1 ל -10 מ"ל עם פתרון AR-2.
  6. הוסיפו 200 μL של התמיסה הזו לכניסת התעלה האפיקלית של כל שבב תוך כדי שאיפה מהשקע (איור 1A). חזור על הפעולה עבור הערוץ הבסיסי. שמור את פיפטה בניצב לשבב תוך הוספת התמיסה כדי לשמור על אטימה הדוקה עם זרימה ללא הפרעה.
  7. חזור על שלב 3.6 עבור כל השבבים.
  8. בדוק את כל השבבים עבור בועות. הסר בועות על-ידי הוספת תמיסה נוספת לערוצים/ות המושפעים.
  9. שאפו את כל עודפי תמיסת ה-AR-1 מפני השטח של השבב תוך הימנעות מכניסות ושקעי ערוצים.
  10. מניחים צ'יפס בצלחת פטרי 150 מ"מ ומכניסים את הכלי החשוף לקופסת אור UV.
  11. פנה את קופסת האור UV לחלק האחורי של BSC ולהשאיר את השבבים תחת אור UV קבוע במשך 30 דקות. צבע התמיסה בשבבים ישתנה מוורוד כהה למהגוני.
  12. שטפו כל תעלה על ידי הוספת 200 μL של תמיסת AR-2 לכניסה ובו זמנית שואפת מהשקע.
  13. שטפו כל תעלה פעמיים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של DPBS קר (-/-) לכניסה ובו זמנית שאפו מהשקע.
  14. הכינו את ציפוי התעלה האפיקלית (200 מיקרוגרם/מ"ל קולגן I ו-30 מק"ג/מ"ל תערובת קולגן IV ב-DMEM) (ראו טבלת חומרים). שמור על קרח.
  15. הכינו את ציפוי תעלת הבסיס (תערובת 15 מיקרוגרם/מ"ל PLL ו-200 מק"ג/מ"ל קולגן I ב-DMEM). שמור על קרח.
  16. הוסף 200 μL של ציפוי ערוץ בסיסי לכניסת התעלה הבסיסית. חבר את השקע עם קצה P200 כאשר תמיסת הציפוי מופיעה בשקע. מוציאים את התמיסה עד שנפחי קצה הכניסה והיציאה שווים, ולאחר מכן משחררים את קצה הפיפטה מהפיפטה, ומשאירים את הקצה בכניסה.
  17. באופן דומה, הוסף 200 μL של ציפוי ערוץ אפי לערוץ האפיקאלי.
  18. שאפו תמיסה עודפת משטח השבב.
  19. בדוק את כל השבבים עבור בועות. הסר בועות על-ידי הוספת ציפוי ערוצים נוסף לערוצים המושפעים.
  20. לדגור על הצ'יפס למשך הלילה בצלחת פטרי 150 מ"מ בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2.

4. זריעה של שבב בסיס ערוץ עם HUFs

  1. צפה בצמיחה של HUFs בבקבוק תחת מיקרוסקופ מדי יום.
  2. לאחר תרביות HUF הן 70%-90% confluent (~ 3 ימים לאחר ציפוי), חם 25 מ"ל של FM, 5 מ"ל של Ca2+/Mg2+ DPBS חינם (DPBS (-/-), 10 מ"ל של טריפסין/EDTA, ו 15 מ"ל של תמיסת נטרול טריפסין (TNS, ראה טבלה של חומרים) עד 37 ° C.
  3. שאפו את המדיום מהצלוחיות. לשטוף עם 5 מ"ל של DPBS (-/-), ולאחר מכן לשאוף שוב.
  4. יש להוסיף 4 מ"ל טריפסין-EDTA לכל בקבוק ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 3-5 דקות עד שהתאים מתנתקים.
  5. הוסף 6 מ"ל TNS לכל בקבוק והעבר את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  6. מערבבים היטב את המתלה עם פיפטה ולוקחים אליקוט 10 μL לספירת תאים. מערבבים 10 μL של תרחיף תאים עם 10 μL טריפאן כחול ולספור באמצעות המוציטומטר.
  7. תרחיף תאי צנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות ב RT. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב- FM חם לריכוז סופי של 7.5 x 105 תאים/מ"ל.
  8. לשטוף את הערוץ הבסיסי עם 200 μL של FM.
  9. חם 15 מ"ל של VEM עד 37 ° C. לשטוף את הערוץ apical עם 200 μL של VEM.
  10. הוסף 200 μL של VEM מלא לכניסת הערוץ האפי תוך חיבור השקע עם קצה פיפטה. מוציאים את המדיום עד שנפחי קצה הכניסה וקצה היציאה שווים, ואז משחררים את קצה הפיפטה מהפיפטה ומשאירים את הקצה בכניסה. השאר את הערוץ העליון מלא ומחובר הן בכניסה והן בשקע.
  11. פיפטה איטית 50 μL של תא HUF השעיה לתוך פתח תעלת הבסיס ובו זמנית שואף מהשקע. הסר את קצה הפיפטה מהכניסה כאשר ~ 2 μL של מתלה התא נשאר בקצה פיפטה מבלי ללחוץ או לשחרר את בוכנה פיפטה כדי למנוע היווצרות בועות. חבר את הכניסה והשקע עם קצות פיפטה.
  12. בדוק בועות תחת מיקרוסקופ. אם הם קיימים, שטפו את ערוץ הבסיס עם FM וחזרו על שלב 4.11.
  13. הפוך את השבבים המחוברים על מדף צינורות של 15 מ"ל ודגור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך שעה אחת. התבונן בשבבים לאחר הדגירה ובדוק אם יש חיבור לתאים.
  14. חבר את שקע תעלת הבסיס עם קצה פיפטה. הוסף 200 μL של FM לכניסת התעלה הבסיסית מבלי לדחוף כלפי מטה על בוכנה פיפטה. שחררו את החוד מהפיפטה ואפשרו לתווך לזרום בחופשיות דרך התעלה אל קצה פיפטת המוצא על ידי זרימה כבידתית.
  15. לדגור שבבי זרעי HUF למשך הלילה ב 37 ° C עם 5% CO2.

5. זריעה שבב ערוץ אפיקלי עם תאי אפיתל בנרתיק

  1. חם 50 מ"ל של VEM עד 37 ° C.
  2. הכינו ציפוי ערוץ אפיקלי (200 מיקרוגרם/מ"ל קולגן I ב-DMEM). שמור על קרח.
  3. חבר את שקע הערוץ האפי עם קצה פיפטה.
  4. הוסף 200 μL של ציפוי ערוץ אפי לכניסת התעלה האפיקאלית. מוציאים את תמיסת הציפוי האפי עד שנפחי קצה הכניסה והיציאה שווים, ואז משחררים את קצה הפיפטה מהפיפטה, ומשאירים את הקצה בכניסה.
  5. שואפים תמיסה עודפת מפני השטח של השבב.
  6. לדגור שבבים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 1 שעות.
  7. לאחר שעה אחת, שטפו את ציפוי התעלה האפיקלית על ידי הוספת 200 μL של VEM לכניסת התעלה האפיקלית תוך כדי שאיפה מהשקע.
  8. בדוק את צמיחת HVEC תחת מיקרוסקופ עבור ~ 70%-90% מפגש.
  9. אם התאים הם 70%-90% חופפים, חם 6 מ"ל של תא אפיתל נרתיקי מלא בינוני ו 4 מ"ל של טריפסין/EDTA לכל צלוחיות, עד 37 ° C.
  10. יש לשאוף מדיום מבקבוק HVEC ולשטוף עם 5 מ"ל DPBS (-/-), ואז לשאוף.
  11. הוסיפו 4 מ"ל טריפסין לכל בקבוק ודגרו בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך 3-5 דקות עד שהתאים מתנתקים.
  12. הוסף 6 מ"ל של VEM לבקבוק כדי להשבית טריפסין ולהעביר את תרחיף התא לצינור חרוטי 15 מ"ל.
  13. מערבבים היטב את המתלה עם פיפטה ולוקחים אליקוט 10 μL לספירת תאים. מערבבים 10 μL של תרחיף תאים עם 10 μL טריפאן כחול ולספור באמצעות המוציטומטר.
  14. תרחיף תאי צנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות ב RT. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב- VEM לריכוז סופי של 3.5-4 מיליון תאים / מ"ל.
  15. חם 25 מ"ל של FM עד 37 ° C.
  16. חבר את שקע הערוץ האפי עם קצה פיפטה. לאט פיפטה לפחות 40 μL של תא HVEC השעיה לתוך פתח התעלה apical . הוציאו את מתלה התא עד שנפחי הכניסה וקצה היציאה יהיו שווים, ולאחר מכן שחררו את קצה הפיפטה מהפיפטה והשאירו את הקצה בכניסה. השאר את ערוץ הבסיס מלא ב-FM ומחובר הן בכניסה והן בשקע.
  17. בזהירות לשאוף מדיום עודף על פני השטח של שבבים ולבדוק בועות תחת מיקרוסקופ. אם הם קיימים, חזור על שלב 5.16.
  18. הניחו את הצ'יפס בצלחת פטרי גדולה ודגרו על טמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 למשך הלילה.
  19. למחרת, צפו בשבבים תחת מיקרוסקופ לחיבור תאים.
  20. הסר את קצות פיפטה מן הפתחים והשקעים של שני ערוצי apical ו basal.
  21. חבר את שקע ערוץ הבסיס עם קצה פיפטה והוסף 200 μL של FM לכניסת תעלת הבסיס מבלי לדחוף כלפי מטה את בוכנה פיפטה. שחררו את קצה הפיפטה מהפיפטה ואפשרו לתווך לזרום בחופשיות דרך התעלה אל קצה פיפטת המוצא על ידי זרימה כבידתית.
  22. חזור על שלב 5.21 עבור הערוץ האפי באמצעות VEM.
  23. לדגור על שבבי זרעים כפולים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות.

6. חיבור שבבים לתרמילים והתמיינות תאי אפיתל בנרתיק

  1. Aliquot 50 מ"ל של FM ו- VEM כדי להפריד צינורות חרוטי 50 מ"ל וחם ל 37 ° C.
  2. דגה את מדיית FM ו-VEM התחממה ל-37 מעלות צלזיוס תחת ואקום סטרילי למשך 5 דקות.
  3. חיטוי וניקוי מגשים עבור מודול הזרימה הדינמית (DFM, ראה טבלת חומרים). הוציאו תרמילים מהאריזה והניחו אותם במגשים.
  4. הוסף 2 מ"ל של VEM נטול גז למאגר הכניסה האפי (מאגר ימני עליון; איור 1B). הוסיפו תווך לאורך דפנות המאגר כדי למנוע היווצרות בועות.
  5. הוסיפו 3 מ"ל של FM נטול גז למאגר הכניסה הבסיסי (המאגר השמאלי העליון, איור 1B). הוסיפו תווך לאורך דפנות המאגר כדי למנוע היווצרות בועות.
  6. הוסיפו 500 μL של VEM נטול גז למאגר היציאה האפיקלית (מאגר מימין למטה, איור 1B). הטה את התרמיל כך שהתווך יכסה את כל המשטח התחתון של המאגר.
  7. הוסיפו 500 μL של FM נטול גז למאגר מוצא הבסיס (מאגר שמאלי תחתון, איור 1B). הטה את התרמיל כך שהתווך יכסה את כל המשטח התחתון של המאגר.
  8. מגשי שקופיות המכילים תרמילים לתוך DFM והפעל את מחזור Prime פעמיים. בדוק אם יש טיפות שיוצאות מהיציאות בחלק התחתון של כל תרמיל.
  9. אם טיפה אינה נוצרת לאחר 4 מחזורי "פריים", יש ליצור מגע ישיר עם היציאה בתוך מאגר היציאה של התרמיל (איור 1B) ופיפטה של 200 מיקרוליטר של התווך המתאים כדי לאפשר לתווך לזרום בין המאגר לערוץ. זה נקרא "Hand-priming".
  10. הסר את קצות פיפטה משבבים והנח טיפה של מדיום מתאים על כל היציאות עבור כל שבב.
  11. החלק שבבים לתוך תרמילים והנח אותם על מגשים.
  12. שאפו כל מדיה על פני השטח של השבבים והחליקו כל מגש לתוך DFM.
  13. הגדר את הפרמטרים הבאים ב- DFM כ: עליון ותחתון - נוזלי; אפי (ערוץ עליון) זרימה - 15 μL / h; זרימה בסיסית (ערוץ תחתון) - 30 μL / h; מתיחה = 0%; תדר = 0 הרץ.
  14. הפעל את מחזור הוויסות ב- DFM ואפשר זרימה במהלך הלילה.
  15. לאחר 24 שעות, שנו את הגדרות הזרימה ל-0 μL/h עבור הערוץ האפי ושמרו על קצב זרימה של 30 μL/h למשך 24 שעות נוספות.
  16. הכן 500 מ"ל של מדיום התמיינות (DM) על ידי הוספת 4 mM L-גלוטמין, 20 mM הידרוקורטיזון, 1x ITES, 20 nM Triiodothyronine, 100 מיקרומטר O-פוספוריל אתנולמין, 180 מיקרומטר אדנין, 3.2 mM סידן כלורי, 2% FBS מומת חום, 1% Pen-strep, ו 120 מ"ל של מדיה F-12 של Ham's DMEM גלוקוז נמוך (ראה טבלה של חומרים), ו עיקור סינון.
  17. חם 50 מ"ל של DM עד 37 ° C.
  18. יש להוסיף 20 μL של 10 μM אסטרדיול (ראה טבלת חומרים) ל-50 מ"ל DM, לערבב היטב ולפרק את הגז תחת ואקום סטרילי למשך 5 דקות.
  19. לחמם 50 מ"ל של VEM עד 37 ° C באמבט מים ו degas תחת ואקום סטרילי במשך 5 דקות.
  20. הוציאו את המגשים מה-DFM, הניחו אותם ב-BSC ושאפו מדיה מהתרמילים, תוך הימנעות מהיציאות במאגרים (איור 1A). לאחר מכן, הוסף 2 מ"ל של VEM למאגר כניסת התעלה האפיקלית ו- 3 מ"ל DM למאגר כניסת התעלה הבסיסית.
  21. החזירו את המגשים ל-DFM והגדירו את זרימת התעלה האפיקלית ל-15 μL/h ואת זרימת התעלה הבסיסית ל-30 μL/h.
  22. אפשר ל-DFM לזרום במשך 4-7 שעות. לאחר מכן, עצור את זרימת הערוץ האפי על ידי הגדרתו ל- 0 μL/h. תן לערוץ הבסיס להמשיך לזרום במהירות של 30 μL / h.
  23. שנה את המדיה לפי שלבים 6.16-6.19 כל 48 שעות.
  24. הזרימו מדיה לסירוגין בתעלה האפיקלית במשך 4-7 שעות בכל יום למשך 5 ימים נוספים לאחר השלבים 6.20-6.21.
  25. הכינו את תמיסת המלח המאוזנת של הנקס עם קיבולת אגירה נמוכה עם מדיית גלוקוז (HBSS (LB/+G)) על ידי הוספת 1.26 מ"מ סידן כלורי, 0.49 מ"מ מגנזיום כלורי הקסהידראט, 0.406 מ"מ מגנזיום גופרתי, 5.33 מ"מ אשלגן כלורי, 137.93 מ"מ נתרן כלורי, 0.441 מ"מ אשלגן פוספט חד-בסיסי, ו-5.55 מ"מ D- גלוקוז ל-dd H2O (ראה טבלת חומרים); pH 4.8.
  26. הכן 500 מ"ל של DM ללא Pen-Strep על ידי הוספת 4 mM L-גלוטמין, 20 mM הידרוקורטיזון, 1x ITES, 20 ננומטר Triiodothyronine, 100 מיקרומטר O-פוספוריל אתנולמין, 180 מיקרומטר אדנין, 3.2 mM סידן כלורי, 2% FBS מומת חום, ו 120 מ"ל של מדיה F-12 של Ham's ל- DMEM גלוקוז נמוך, ועיקור סינון.
  27. ביום 6, החלף את תווך הערוץ האפי ב- (HBSS (LB/+G)) ואת מדיום הערוץ הבסיסי ב- DM נטול Pen-Strep לאחר שלבים 6.16-6.19.
  28. הגדר את הזרימה ב- DFM ל- 15 μL / h עבור התעלה האפיקלית ו- 30 μL / h עבור התעלה הבסיסית למשך 24 שעות לפני שתמשיך בחיסון חיידקי.

7. חיסון חיידקי של שבבים מובחנים

הערה: בצע את השלבים הבאים במעבדה וב-BSC התואמים לתקנות לטיפול בחיידקים.

  1. חשב את CFU/מ"ל של כל זן חיידק שייכלל בחיסון. יש לערבב את הכמות הנדרשת של כל זן חיידקי עד ~5 x 106 יחידות יוצרות מושבה (CFU/mL).
  2. צנטריפוגה את התערובת ב 7,000 x גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C ובזהירות להסיר את supernatant. השהה מחדש את הגלולה פנימה (HBSS (LB/+G)). זה יהיה החיסון החיידקי.
  3. נתקו שבבים מתרמילים. חבר את השקע של תעלת הבסיס עם קצה פיפטה והוסף 200 μL של DM ללא Pen-Strep לכניסת תעלת הבסיס מבלי לדחוף למטה על בוכנה פיפטה. שחררו את קצה הפיפטה מהפיפטה ואפשרו לתווך לזרום בחופשיות דרך התעלה לשקע על ידי זרימה כבידתית.
  4. הוסף 37 μL של החיסון החיידקי לכניסת התעלה האפיקאלית, תוך שאיפה מהשקע. כאשר נשאר בערך 2 μL בקצה הפיפטה, משוך את הקצה החוצה וחבר את פתח התעלה האפיקלית ואת היציאה עם קצות פיפטה.
  5. עבור שבבי הבקרה (לא מחוסנים), חזור על שלב 7.4 עם 37 μL של (HBSS (LB/+G)).
  6. לשאוף כל מדיה על פני השטח של השבב. מניחים את השבבים בצלחת פטרי 150 מ"מ ודגרים בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך 24 שעות.
  7. מניחים את התרמילים (ללא שבבים) על המגשים ומניחים אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך 24 שעות.
  8. חם 50 מ"ל של (HBSS (LB/+G)) ו-50 מ"ל של DM נטול Pen-Strep עד 37°C.
  9. יש להוסיף 20 μL של 10 מיקרומטר אסטרדיול ל-50 מ"ל של DM נטול Pen-Strep, לערבב היטב ולפרק את הגז תחת שואב אבק סטרילי למשך 5 דקות. משחררים את הגז (HBSS (LB/+G)) תחת שואב אבק למשך 5 דקות.
  10. שאפו בזהירות את המדיה בתרמילים תוך הימנעות מכניסת המאגר ויציאות היציאה.
  11. הוסף 3 מ"ל של degassed (HBSS (LB/+G)) למאגר תרמיל הכניסה האפי ו- 500 μL של degassed (HBSS (LB/+G)) למאגר תרמיל היציאה האפיקאלי.
  12. הוסף 3 מ"ל של DM נטול Pen-Strep נטול גז למאגר תרמילי הכניסה הבסיסיים ו- 500 μL של DM נטול אנטיביוטיקה נטול גז למאגר תרמילי היציאה הבסיסי.
  13. החלק מגשים עם התרמילים (ללא השבבים) לתוך DFM והפעל את מחזור Prime פעמיים. בדוק אם יש טיפות שיוצאות מכל יציאה בחלק התחתון של התרמיל.
    הערה: אם טיפה לא נוצרת לאחר 4 מחזורי "פריים", יש ליצור מגע ישיר עם היציאה בתוך מאגר היציאה של התרמיל (איור 1B) ופיפטה 200 μL של התווך המתאים כדי לאפשר לתווך לזרום בין המאגר לתעלה.
  14. הסר קצות פיפטה משבבים והנח טיפה של מדיה מתאימה על כל כניסות ושקעי הערוץ.
  15. החליקו שבבים לתוך תרמילים והניחו תרמילים במגשים.
  16. יש לשאוף מדיה במאגרי המוצא האפי והבסיסי ובכל מדיה על פני השבבים. לאחר מכן, החלק את המגשים לתוך DFM.
  17. הגדר את הפרמטרים הבאים ב- DFM: עליון ותחתון - נוזלי; זרימה אפית (עליונה) - 40 μL/h; זרימה בסיסית (למטה) - 40 μL / h; למתוח - 0%; תדר - 0 הרץ. הפעל את מחזור הוויסות .
  18. לעצור את הזרימה לאחר 4 שעות ולאסוף את הקולחים, כלומר את התקשורת במאגרי מוצא אפי ובזאלי.
  19. למדוד ולתעד את נפחי הקולחים.
  20. החזירו את השבבים ל-DFM והגדירו את קצב הזרימה האפי ל-0 μL/h ואת הזרימה הבסיסית ל-30 μL/h. התחל את הזרימה כך שתפעל במהלך הלילה.
  21. Aliquot את הקולחים שנאספו עבור בדיקות מתוכננות שונות ולאחסן אותם בטמפרטורות המתאימות.
    הערה: למדידת CFU, יש להוסיף גליצרול לריכוז סופי של 16% ולאחסן מיד בטמפרטורה של -80°C.
  22. שאפו את התווך רק במאגרי מוצא הבסיס וקבעו את קצבי הזרימה האפיקליים והבזאליים ל-40 מיקרוליטר/שעה ב-DFM. התחל את הזרימה במשך 4 שעות וחזור על שלבים 7.18-7.21. זה יהיה איסוף הקולחים למשך 48 שעות.
  23. חזור על שלב 7.22 במשך 72 שעות או עד לסיום הניסוי.
  24. בנקודת הסיום של הניסוי יש לאסוף את הקולחים לפי שלבים 7.18-7.19.
  25. הכינו את תמיסת העיכול על ידי הוספת 1 מ"ג/מ"ל Collagenase IV ב-TrypLE express. חם 10 מ"ל של פתרון העיכול ל 37 ° C.
  26. חבר את יציאת השקע של תעלת הבסיס עם קצה פיפטה. הוסף 100 μL של פתרון העיכול לערוץ הבסיסי. מערבבים היטב, ובעזרת פיפטה, אוספים את כל התמיסה מהתעלה בצינור שכותרתו 'צינור B'.
  27. חבר את יציאת השקע של הערוץ האפי עם קצה פיפטה. הוסף 100 μL של פתרון העיכול לערוץ apical . מערבבים היטב, ובעזרת פיפטה, אוספים את כל התמיסה מהתעלה בצינור שכותרתו 'צינור A'.
  28. הוסף עוד 100 μL של תמיסת העיכול הן לפתחי התעלה האפיקלית והן לפתחי התעלה הבסיסית תוך חיבור שקעים עם קצות פיפטה. לדגור את השבבים ואת צינורות A ו- B ב 37 ° C במשך 1-1.5 שעות.
  29. ערבבו את תכולת העיכול היטב בתוך התעלות באמצעות הקצוות המחוברים שכבר הונחו בכניסות ובשקעים. אספו את תכולת התעלות האפיקליות והבזליות לצינורות A ו-B, בהתאמה. אלה הם שבב apical ו בסיסי digests.
  30. ספור את התאים בצינור A באמצעות המוציטומטר. כמו כן, הסר aliquot מתעזרי השבב למדידת CFU לאחר שלב 7.21.

8. ניתוח שפכי שבבים ותקצירים

  1. לספירת חיידקים מהקולחים והמעכלים, מדללים סדרתי את הקולחים או המעכלים ב- DPBS סטרילי (-/-) וצלחת על צלחת מדיה מתאימה, דוגרים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24-48 שעות, וסופרים את המושבות על הצלחת.
  2. למדידת pH, יש ליטול 10 μL מהשפכים של 72 שעות מיד לאחר האיסוף ולהשתמש ברצועת pH כדי למדוד את רמת החומציות של הקולחים.
  3. לניתוח הציטוקינים, השתמש בקולחים כדי לזהות ציטוקינים ספציפיים באמצעות בדיקה מבוססת לומינקס, ELISA, או כל טכניקה ישימה אחרת29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנרתיק האנושי מרופד באפיתל מרובד שמעל סטרומה קולגן עשירה בפיברובלסטים. כדי למדל זאת, ממשק רקמות נוצר על ידי תרבית אפיתל נרתיקי אנושי ראשוני ופיברובלסטים משני צדי קרום נקבובי משותף בתוך מכשיר שבב איברים מיקרופלואידי דו-ערוצי. היווצרות אפיתל הנרתיק מנוטרת באמצעות הדמיה מיקרוסקופית של שדה בהיר, אשר חושפת היווצרות של יריעה רציפה של תאים שיוצרת בהדרגה שכבות תאים מרובות (איור 2A). דיווחים קודמים אישרו כי מורפולוגיה זו מתואמת עם התפתחות אפיתל מרובד במלואו כאשר מסתכלים בחתך רוחב29. אולם אם שכבת האפיתל נראית מטושטשת ולא רציפה (איור 2B), ייתכן ששבב הנרתיק אינו מתאים לשימוש בניסויים.

איור 3 מראה ייצוג סכמטי של יצירת שבב הנרתיק. כדי לאמת את הפונקציונליות של שבב הנרתיק, השבבים חוסנו עם L. crispatus ו- G. vaginalis כדי למדל סביבות נרתיקיות בריאות ודיסביוטיות, בהתאמה. G. vaginalis הוא החיידק המעורב בעיקר בוגינוזיס חיידקי. כדי לבדוק אם חיידקים בריאים ודיסביוטיים מושתלים על שבבי הנרתיק, כומתו העומס החיידקי בשבבי הנרתיק שחוסנו עם אוכלוסיות החיידקים השונות על ידי ציפוי שפכי תעלות ושכבות תאים מעוכלות על מצע גידול חיידקים סלקטיבי (De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) אגר עבור L. crispatus ואגר דם Brucella (BBA) עבור G. vaginalis) (ראה טבלת חומרים) והשוואתם לתרבויות דומות באמצעות החיסון המקורי. מושבות של L. crispatus ו-G. vaginalis התגלו תוך 48 שעות מהציפוי (איור 2C), מה שמאשר שגם חיידקים בריאים וגם חיידקים דיסביוטיים הושתלו בשבבי הנרתיק. עם זאת, אם מושבות חיידקים נצפות על הצלחות המכילות את החיסונים אך לא נצפות על צלחות המכילות את השפכים או העיכול לאחר הדגירה הנדרשת, אז ניתן להסיק כי החיידקים לא השתלט.

סביבה נרתיקית בריאה היא חומצית, ודיסביוזיס גורם לעלייה ב- pH31 בנרתיק. לכן נותח גם ה- pH של השפכים של ערוץ האפיתל האפי של שבב הנרתיק. ה-pH של שבבי הנרתיק שחוסנו ב-L. crispatus היה דומה לזה של שבבי בקרה לא מחוסנים, וכאשר הם תורבתו יחד עם G. vaginalis הם חוו עלייה משמעותית ב-pH (איור 2D). אם ה- pH של שבב נרתיק לא נגוע נצפה גבוה, זה מצביע על כך שיש בעיה, ואין להשתמש בשבבים אלה לניסויים.

המצב הדלקתי של רקמת הנרתיק רגיש גם להרכב המיקרוביום של הנרתיק, כאשר מיקרוביום דיסביוטי מעורר דלקת. לאחר ניתוח של הציטוקינים מעודדי הדלקת בתעלה האפיקלית של שבב הנרתיק 3 ימים לאחר החיסון עם L. crispatus או G. vaginalis, התגובה הפרו-דלקתית נמצאה באופן דומה גבוהה יותר עם G. vaginalis בהשוואה לשבבים ושבבים לא נגועים שחוסנו ב-L . crispatus (איור 2E). יחד, תוצאות אלה מראות כי שבב הנרתיק מחקה באופן הדוק את המיקרו-סביבה הנרתיקית האנושית הן במצב בריא והן במצב דיסביוטיקה.

Figure 1
איור 1: שבב דו-ערוצי והתרמיל שלו. (A) תמונה של שבב PDMS דו-ערוצי המתאר את הערוצים והיציאות שלו. (B) תמונה של תרמיל המתאר את המאגרים והיציאות לתעלות אפיות ובזאליות. (C) תרשים סכמטי המציג את תצוגת החתך של שבב נרתיק נגוע בחיידקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שבב הנרתיק מחקה מיקרו-סביבות נרתיקיות אנושיות בריאות ודיסביוטיות. (A) תאי אפיתל בנרתיק בתעלה האפיקלית של שבב נרתיק חזק. סרגל קנה המידה מייצג 1 מ"מ של השבב בתמונה העליונה ו- 500 מיקרומטר בתמונה התחתונה. (B) תאי אפיתל נרתיקי בתעלה אפיקלית של שבב נרתיק לא מתאים. סרגל קנה המידה מייצג 1 מ"מ של השבב בתמונה העליונה ו- 500 מיקרומטר בתמונה התחתונה. (C) השתלה של L. crispatus (LC) ו-G. vaginalis (GV) בשבב הנרתיק. (D) pH של שבבי הנרתיק לאחר דגירה של 72 שעות עם L. crispatus (LC) ו-G. vaginalis (GV) בהשוואה לשבבי נרתיק לא נגועים (בקרה). (E) תגובה פרו-דלקתית של שבבי הנרתיק ל-L. crispatus (LC) ול-G. vaginalis (GV) לאחר דגירה של 72 שעות, בהשוואה לשבבי נרתיק לא נגועים (בקרה). (ג-ה) גרפים מתארים ממוצע ± SD עבור 4-6 שבבים; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 בהשוואה לשבבי נרתיק בקרה; כל אחד מהם (●) מייצג נתונים משבב אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול ליצירת שבב הנרתיק. ייצוג סכמטי של השלבים הכרוכים בזריעת תאים ויצירת שבב הנרתיק. HVECs - תאי אפיתל נרתיקי אנושיים; HUFs - פיברובלסטים ברחם האדם; VEM - מדיום אפיתל בנרתיק; FM - מדיה פיברובלסט; DM - מדיום בידול; נ.ב. - פניצילין סטרפטומיצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודלים קודמים במבחנה של הנרתיק האנושי אינם משכפלים נאמנה מבנים של רקמת הנרתיק, זרימת נוזלים ואינטראקציות פונדקאי-פתוגן19,22. מודלים של בעלי חיים מוגבלים גם על ידי שונות בין מינים במיקרוביום והבדלים בייחום או במחזור החודשי19,22. כתב יד זה מתאר פרוטוקול ליצירת מודל שבב איברים של הנרתיק האנושי שיכול לחקות ביעילות תגובות אנושיות לקהילות מיקרוביאליות בריאות ודיסביוטיות.

פרוטוקול זה כולל זריעת תאי אפיתל ופיברובלסטים וגינליים משני צדי קרום נקבובי משותף המפריד בין מיקרו-ערוצים מקבילים במכשיר שבב איברים דו-ערוצי הזמין מסחרית (ראה טבלת חומרים). הממברנה הנקבובית מאפשרת נדידה של גורמי גדילה וצורות אחרות של תקשורת בין-תאית. עם זאת, ציפוי הקולגן והנוכחות של חד-שכבות התא מונעים ערבוב של מדיה בין ערוצים. עם היווצרות חד-שכבה של תא אפיתל נרתיקי בתעלה האפיקאלית, מוכנסים גורמי התמיינות לתוך התווך הזורם בתעלה הבסיסית, העובר דרך החלל הבין-תאי ובכך מקדם התמיינות של תאי האפיתל בנרתיק ליצירת אפיתל מרובד. צפיפות תאי האפיתל בנרתיק בזמן הזריעה היא גורם מכריע בבריאות שבב הנרתיק בסוף שלב ההתמיינות. לכן, יש להעריך את צפיפות תאי האפיתל בנרתיק לפני תחילת ההתמיינות, אשר לא צריך להיות יזום עד monolayer הוקמה. ניתן להמשיך בחשיפה לגורמי ההתמיינות עד לקבלת הצפיפות הרצויה של תאי האפיתל בנרתיק ולפני חיסון חיידקי. יתר על כן, יש לציין כי קצב הצמיחה עשוי להשתנות עבור תאי אפיתל נרתיק ראשוניים מתורמים שונים (או מקורות מסחריים), אשר יכול להשפיע על איכות שבב הנרתיק שנוצר. בכל מחקרי שבבי האיברים המיקרופלואידים, יש חשיבות עליונה להסיר את כל הבועות שעלולות להיווצר בתעלות לאורך תרבית השבב מכיוון שהן מפריעות לזרימה הבינונית ובסופו של דבר יביאו לזמינות מופחתת של חומרי מזון ולאובדן יכולת הקיום של התא.

פרוטוקול זה מתאר גם כיצד להשתמש בשבב הנרתיק כדי ליצור קהילות חיידקים על שבב המחקות את מצב הנרתיק הבריא או וגינוזיס חיידקי. שבב הנרתיק יכול לשמש גם לחקר מחלות או הפרעות אחרות בנרתיק; עם זאת, יש להקפיד להבין את המאפיינים של כל מחלה ואת האמצעים הטובים ביותר למתאם תוצאות עם ממצאים קליניים בעת ביצוע מחקרים אלה. לסיכום, שבב הנרתיק האנושי פותח אפיקים חדשים לחקר שפע של מחלות ומצבים הקשורים ל- FRT, והוא יכול להיות כלי רב ערך לחקר טיפולים פוטנציאליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

דונלד אינגבר הוא מייסד, חבר מועצת מנהלים, יו"ר המועצה המדעית המייעצת ובעל מניות ב-Emulate. המחברים האחרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי מימון מקרן ביל ומלינדה גייטס (INV-035977) ומכון ויס להנדסה בהשראת ביולוגיה באוניברסיטת הרווארד. אנו מודים גם לגוון א. מרי, מכון ויס, על עריכת כתב היד הזה. הדיאגרמה באיור 1 נוצרה באמצעות BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Steriflip Millipore  SCGP00525 To degas media
2 channel chip Emulate BRK-S1-WER-24 Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips) Thomas Scientific, SHARP 1159M40 Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)  Emulate Chip S1 Basic Research kit-24PK Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C  
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)  Emulate Chip S1 Basic Research kit-24PK Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine Sigma Aldrich  A2786 Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates VWR International Inc.  89405-032 with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-) ScienCell 303 For washing cells
Calcium Chloride Sigma Aldrich  C5670 Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)  Sigma Aldrich  499609 Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I  Corning 354236 For the coating solution for HVEC
Collagen IV  Sigma Aldrich  C7521 For the coating solution for HVEC
Collagenase IV Gibco 17104019 For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium  ScienCell 2301 Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium Lifeline LL-0068 Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)  Sigma Aldrich  158968 Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)  Thermofisher 12320-032 Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë) Emulate Zoë-CM1 Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12 Thermofisher 11765-054 Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS  Thermofisher  10438018 Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts ScienCell 7040 HUF
Human vaginal epithelial cells Lifeline FC-0083 HVEC
Hydrocortisone Sigma Aldrich  H0396 Component of the Differentiation media
ITES Lonza 17-839Z Component of the Differentiation media
L-glutamine Thermofisher 25030081 Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich  M2393 Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich  M1880 Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates VWR International Inc.  89407-214 For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine Sigma Aldrich  P0503 Component of the Differentiation media
Pen/Strep Thermofisher  15070063 Component of the Differentiation media
pH strips Fischer-Scientific 13-640-520 For measurement of pH 
Pods (1/chip)  Emulate BRK-S1-WER-24 Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine ScienCell 403 For the coating solution for HUFs
Potassium chloride  Sigma Aldrich  P3911 Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich  P0662 Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol  MP Biomedicals  113055034 For freezing bacterial samples
Triiodothyronine Sigma Aldrich   T6397 Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)  Sigma Aldrich  T8154 For counting live/dead cells
TrypLE Express Thermofisher  12605010 For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)  ScienCell 113 For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%) ScienCell 103 For cell dissociation 
β-estradiol  Sigma Aldrich  E2257 Hormone for differentiation media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Ravel, J. The vaginal microbiota, host defence and reproductive physiology. J Physiol. 595 (2), 451-463 (2017).
  2. Van De Wijgert, J., Jespers, V. The global health impact of vaginal dysbiosis. Res Microbiol. 168 (9-10), 859-864 (2017).
  3. Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: Cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
  4. Goldenberg, R. L., Hauth, J. C., Andrews, W. W. Intrauterine infection and preterm delivery. N Engl J Med. 342 (20), 1500-1507 (2000).
  5. Han, Y., Liu, Z., Chen, T. Role of vaginal microbiota dysbiosis in gynecological diseases and the potential interventions. Front Microbiol. 12, 643422 (2021).
  6. Leitich, H., Kiss, H. Asymptomatic bacterial vaginosis and intermediate flora as risk factors for adverse pregnancy outcome. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 21 (3), 375-390 (2007).
  7. Torcia, M. G. Interplay among vaginal microbiome, immune response and sexually transmitted viral infections. Int J Mol Sci. 20 (2), 266 (2019).
  8. Van Oostrum, N., De Sutter, P., Meys, J., Verstraelen, H. Risks associated with bacterial vaginosis in infertility patients: A systematic review and meta-analysis. Hum Reprod. 28 (7), 1809-1815 (2013).
  9. Lewis, F. M. T., Bernstein, K. T., Aral, S. O. Vaginal microbiome and its relationship to behavior, sexual health, and sexually transmitted diseases. Obstet Gynecol. 129 (4), 643-654 (2017).
  10. Hong, X., et al. The association between vaginal microbiota and female infertility: A systematic review and meta-analysis. Arch Gynecol Obstet. 302 (3), 569-578 (2020).
  11. Peelen, M. J., et al. The influence of the vaginal microbiota on preterm birth: A systematic review and recommendations for a minimum dataset for future research. Placenta. 79, 30-39 (2019).
  12. Smith, P. P., et al. Outcomes in prevention and management of miscarriage trials: A systematic review. BJOG. 126 (2), 176-189 (2019).
  13. Harp, D. F., Chowdhury, I. Trichomoniasis: Evaluation to execution. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 157 (1), 3-9 (2011).
  14. Pastorek, J. G., Cotch, M. F., Martin, D. H., Eschenbach, D. A. Clinical and microbiological correlates of vaginal trichomoniasis during pregnancy. The vaginal infections and prematurity study group. Clin Infect Dis. 23 (5), 1075-1080 (1996).
  15. Petrin, D., Delgaty, K., Bhatt, R., Garber, G. Clinical and microbiological aspects of trichomonas vaginalis. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 300-317 (1998).
  16. Edwards, T., Burke, P., Smalley, H., Hobbs, G. Trichomonas vaginalis: Clinical relevance, pathogenicity and diagnosis. Crit Rev Microbiol. 42 (3), 406-417 (2016).
  17. Eade, C. R., et al. Identification and characterization of bacterial vaginosis-associated pathogens using a comprehensive cervical-vaginal epithelial coculture assay. PLoS One. 7 (11), e50106 (2012).
  18. Fichorova, R. N., Yamamoto, H. S., Delaney, M. L., Onderdonk, A. B., Doncel, G. F. Novel vaginal microflora colonization model providing new insight into microbicide mechanism of action. mBio. 2 (6), e00168 (2011).
  19. Herbst-Kralovetz, M. M., Pyles, R. B., Ratner, A. J., Sycuro, L. K., Mitchell, C. New systems for studying intercellular interactions in bacterial vaginosis. J Infect Dis. 214, S6-S13 (2016).
  20. Johnson, A. P., et al. A study of the susceptibility of three species of primate to vaginal colonization with gardnerella vaginalis. Br J Exp Pathol. 65 (3), 389-396 (1984).
  21. Yildirim, S., et al. Primate vaginal microbiomes exhibit species specificity without universal lactobacillus dominance. ISME J. 8 (12), 2431-2444 (2014).
  22. Edwards, V. L., et al. Three-dimensional models of the cervicovaginal epithelia to study host-microbiome interactions and sexually transmitted infections. Pathog Dis. 80 (1), 026 (2022).
  23. Zhu, Y., et al. Ex vivo 2D and 3D HSV-2 infection model using human normal vaginal epithelial cells. Oncotarget. 8 (9), 15267-15282 (2017).
  24. Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infect Immun. 86 (11), e00282 (2018).
  25. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).
  26. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nat Biomed Eng. 3 (7), 520-531 (2019).
  27. Valiei, A., Aminian-Dehkordi, J., Mofrad, M. R. K. Gut-on-a-chip models for dissecting the gut microbiology and physiology. APL Bioeng. 7 (1), 011502 (2023).
  28. Izadifar, Z., et al. Mucus production, host-microbiome interactions, hormone sensitivity, and innate immune responses modeled in human endo- and ecto-cervix chips. bioRxiv. , (2023).
  29. Mahajan, G., et al. Vaginal microbiome-host interactions modeled in a human vagina-on-a-chip. Microbiome. 10 (1), 201 (2022).
  30. Masson, L., et al. Inflammatory cytokine biomarkers to identify women with asymptomatic sexually transmitted infections and bacterial vaginosis who are at high risk of HIV infection. Sex Transm Infect. 92 (3), 186-193 (2016).
  31. Amsel, R., et al. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med. 74 (1), 14-22 (1983).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 204
מידול מיקרו-סביבות נרתיקיות בריאות ודיסביוטיות בנרתיק אנושי על שבב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gulati, A., Jorgenson, A., Junaid,… More

Gulati, A., Jorgenson, A., Junaid, A., Ingber, D. E. Modeling Healthy and Dysbiotic Vaginal Microenvironments in a Human Vagina-on-a-Chip. J. Vis. Exp. (204), e66486, doi:10.3791/66486 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter