Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Моделирование здорового и дисбиотического микроокружения влагалища в человеческом влагалище-на-чипе

Published: February 16, 2024 doi: 10.3791/66486
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Vascular Biology Program and Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School, 3Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences

Summary

В данной статье описан протокол создания микрофлюидного устройства для культивирования влагалища на чипе (Vagina Chip), позволяющего изучать взаимодействие человека с живым микробиомом влагалища в микроаэрофильных условиях. Этот чип может быть использован в качестве инструмента для исследования вагинальных заболеваний, а также для разработки и тестирования потенциальных терапевтических контрмер.

Abstract

Женскому здоровью, и особенно заболеваниям женских репродуктивных путей (ФРТ), не уделяется должного внимания, даже несмотря на то, что нездоровая репродуктивная система может привести к опасным для жизни заболеваниям, бесплодию или неблагоприятным исходам во время беременности. Одним из препятствий в этой области является нехватка доклинических, экспериментальных моделей, которые точно имитируют физиологию и патофизиологию FRT. Современные модели in vitro и на животных не полностью повторяют гормональные изменения, микроаэробные условия и взаимодействие с микробиомом влагалища. Появление технологии микрофлюидной культуры Organ-on-a-Chip (Organ Chip), которая может имитировать тканевые границы, сосудистую перфузию, потоки интерстициальной жидкости и физическое микроокружение основной субъединицы человеческих органов, потенциально может служить решением этой проблемы. Недавно был разработан чип влагалища человека, который поддерживает совместное культивирование микробных консорциумов влагалища человека с первичным эпителием влагалища человека, который также сопряжен со стромой влагалища и испытывает динамический поток жидкости. Этот чип воспроизводит физиологические реакции человеческого влагалища на здоровые и дисбиотические микробиомы. Подробный протокол создания вагинальных чипов человека был описан в этой статье.

Introduction

Микробиом влагалища с преобладанием Lactobacillus spp., который помогает поддерживать кислую микросреду, играет важную роль в поддержании женского репродуктивного здоровья1. Однако иногда может происходить изменение в составе микробных сообществ, составляющих микробиом, что приводит к увеличению разнообразия вагинальных бактерий. Эти дисбиотические изменения, которые часто приводят к переходу от состояния с преобладанием лактобактерий к состоянию с преобладанием более разнообразных анаэробных видов бактерий (например, Gardnerella vaginalis), связаны с различными заболеваниями репродуктивной системы, такими как бактериальный вагиноз, атрофический вагинит, инфекция мочевыводящих путей, вульвовагинальный кандидоз, уретрит и хориоамнионит 2,3,4,5 . Эти заболевания, в свою очередь, увеличивают шансы женщины приобрести заболевания, передающиеся половым путем, и воспалительные заболевания органов малого таза 6,7,8,9. Они также представляют более высокий риск преждевременных родов и выкидышей у беременных женщин 10,11,12, а также связаны с бесплодием 13,14,15,16.

Несмотря на то, что были предприняты усилия по моделированию дисбиоза влагалища с использованием эпителиальных клеток влагалища, культивируемых в статических, двумерных (2D) системах культивирования17,18, они не эффективно имитируют физиологию и сложность микроокружения влагалища19. Животные модели также использовались для изучения дисбактериоза влагалища; однако их менструальные фазы и взаимодействие хозяина с микробиомом сильно отличаются от таковых у людей, и, таким образом, физиологическая значимость результатов этих исследований остается неясной 19,20,21. Чтобы противодействовать этим проблемам, органоиды и модели вставок Transwell из ткани влагалища человека также использовались для изучения взаимодействия хозяина и патогена в FRT 19,22,23,24. Но поскольку это статические культуры, они могут поддерживать совместное культивирование клеток человека с живыми микробами только в течение короткого периода времени (<16-24 ч), и в них отсутствуют многие другие потенциально важные физические особенности микроокружения влагалища человека, такие как выработка слизи и поток жидкости22.

Чипы органов представляют собой трехмерные (3D) микрофлюидные системы культивирования, которые содержат один или несколько параллельных полых микроканалов, выстланных живыми клетками, культивируемыми в динамическом потоке жидкости. Двухканальные чипы позволяют воссоздавать тканевые границы на уровне органов путем культивирования различных типов клеток (например, эпителия и стромальных фибробластов или эпителия и эндотелия сосудов) на противоположных сторонах пористой мембраны, которая разделяет два параллельных канала (рис. 1). Обе ткани могут независимо подвергаться воздействию потока жидкости, а также могут испытывать микроаэробные условия, позволяющие проводить совместное культивирование со сложным микробиомом 25,26,27,28. Этот подход недавно был использован для разработки человеческого влагалищного чипа, выстланного гормоночувствительным первичным эпителием влагалища, взаимодействующим с нижележащими фибробластами стромы, который поддерживает низкую физиологическую концентрацию кислорода в просвете эпителия и позволяет совместно культивировать со здоровыми и дисбиотическими микробиомами в течение не менее 3 дней in vitro29. Было продемонстрировано, что Vagina Chip может быть использован для изучения колонизации оптимальными (здоровыми) консорциумами L. crispatus и выявления воспаления и повреждений, вызванных неоптимальными (нездоровыми) консорциумами, содержащими G. vaginalis. Здесь мы подробно опишем методы, которые используются для создания чипа влагалища человека, а также для создания здоровых и дисбиотических бактериальных сообществ на чипе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Это исследование было выполнено в соответствии с институциональными рекомендациями по использованию клеток человека. Клетки были получены коммерческим путем (см. Таблицу материалов). Все этапы должны выполняться асептически в шкафу биобезопасности (БСК). Для этого протокола используйте только наконечники для дозатора с фильтром (или барьером).

1. Культивирование эпителиальных клеток влагалища человека

  1. Нагрейте 50 мл эпителиальной среды влагалища (ВЭМ, см. Таблицу материалов) до 37 °C.
  2. Аликвота 9 мл ВЭМ в пробирку объемом 15 мл. Затем разморозьте флакон с эпителиальными клетками влагалища человека (HVECs) и добавьте его в пробирку, содержащую VEM.
  3. Центрифугируйте пробирку объемом 15 мл при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) и аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя гранулу.
  4. Осторожно ресуспендируйте гранулу в 2 мл VEM и добавьте по 1 мл в каждую из двух колб T75, содержащих 14 мл VEM.
  5. Инкубируйте колбы при 37 °C с 5%CO2. Меняйте VEM каждые 2 дня до тех пор, пока HVEC не станут примерно на 70% конфлюентными (около 5 дней).

2. Культивирование клеток фибробластов матки человека

  1. Приготовьте 10 мл 15 мкг/мл раствора поли-L-лизина (ФАПЧ) в дважды дистиллированной воде (ddH2O). Добавьте по 5 мл раствора ФАПЧ в каждую из двух колб T75 и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
  2. Нагрейте 50 мл среды фибробластов (FM, см. Таблицу материалов) до 37 °C.
  3. Отсадите раствор ФАПЧ и промойте каждую колбу 5 мл ddH2O.
  4. Добавьте 9 мл FM в пробирку объемом 15 мл и разморозьте флакон с фибробластами матки человека (HUF).
  5. Добавьте HUF в 15-мловую трубку, содержащую FM.
  6. Центрифугируйте пробирку объемом 15 мл при 300 x g в течение 5 мин при ЛТ и аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя клеточную гранулу.
  7. Осторожно суспендируйте гранулу в 2 мл FM и добавьте по 1 мл в каждую из двух колб T75, содержащих 14 мл FM.
  8. Инкубируйте колбы при температуре 37 °C с 5%CO2 до тех пор, пока клетки не сливаются примерно на 70%, меняя среду каждые 2 дня.

3. Активация чипа и покрытие канала

  1. Дегазируйте стружку (полученную в промышленных масштабах, см. Таблицу материалов) в течение 30 мин в вакуумном эксикаторе.
  2. Дайте активационному реагенту 1 (AR-1) и активационному реагенту 2 (AR-2) (см. Таблицу материалов) уравновеситься в RT в течение 15 минут, не снимая упаковки.
  3. Оберните коническую трубку объемом 15 мл в фольгу, чтобы защитить ее от света. Медленно добавьте 1 мл раствора AR-2 на стенки флакона AR-1 и хорошо перемешайте. Переложите смесь в завернутую фольгой пробирку объемом 15 мл.
  4. Повторно добавляйте раствор AR-2 во флакон AR-1 с шагом 1 мл до полного смывания порошка AR-1 из флакона.
  5. Долейте восстановленный раствор AR-1 до 10 мл раствором AR-2.
  6. Добавьте 200 мкл этого раствора во входное отверстие апикального канала каждой микросхемы во время аспирации из выходного отверстия (рис. 1A). Повторите для базального канала. Держите пипетку перпендикулярно чипу во время добавления раствора, чтобы обеспечить плотное прилегание и беспрепятственный поток.
  7. Повторите шаг 3.6 для всех фишек.
  8. Проверьте все фишки на наличие пузырей. Удалите все пузырьки, добавив больше раствора в пораженные каналы.
  9. Отсасывайте излишки раствора AR-1 с поверхности чипа, избегая входных и выходных отверстий каналов.
  10. Поместите чипсы в чашку Петри диаметром 150 мм и вставьте эту открытую чашку в коробку с ультрафиолетовым излучением.
  11. Поверните коробку УФ-света к задней части BSC и оставьте стружку под постоянным ультрафиолетовым светом на 30 минут. Цвет раствора в стружке изменится с темно-розового на красное дерево.
  12. Промойте каждый канал, добавив 200 μL раствора AR-2 на входное отверстие и одновременно отсасывая из выходного отверстия.
  13. Промойте каждый канал дважды, добавив 200 μL холодной DPBS (-/-) на входное отверстие и одновременно отсасывая из выходного отверстия.
  14. Приготовьте покрытие апикального канала (смесь 200 мкг/мл коллагена I и 30 мкг/мл коллагена IV в DMEM) (см. таблицу материалов). Держитесь на льду.
  15. Приготовьте покрытие базального канала (смесь ФАПЧ 15 мкг/мл и коллагена I 200 мкг/мл I в DMEM). Держитесь на льду.
  16. Добавьте 200 мкл покрытия базального канала на вход базального канала. Заглушите розетку наконечником P200, когда на выходе появится раствор покрытия. Дозируйте раствор до тех пор, пока объемы входного и выходного наконечников не сравняются, а затем освободите наконечник дозатора от дозатора, оставив наконечник на входе.
  17. Аналогичным образом добавьте 200 мкл покрытия апикального канала в апикальный канал.
  18. Отсасывайте избыток раствора с поверхности стружки.
  19. Проверьте все фишки на наличие пузырей. Удалите все пузырьки, добавив больше покрытия канала к пораженному каналу (каналам).
  20. Инкубируйте чипсы в течение ночи в чашке Петри диаметром 150 мм при 37 °C с 5%CO2.

4. Засевающий базальный канал стружки с форинтами

  1. Ежедневно наблюдайте за ростом форинтов в колбе под микроскопом.
  2. После того, как культуры HUF станут 70%-90% конфлюентными (~3 дня после осаждения), нагрейте 25 мл FM, 5 мл Ca2+/Mg2+ свободного DPBS (DPBS (-/-), 10 мл трипсина/ЭДТА и 15 мл нейтрализующего трипсина раствора (TNS, см. Таблицу материалов) до 37 °C.
  3. Аспирируйте среду из колб. Смойте 5 мл DPBS (-/-), затем снова аспирируйте.
  4. Добавьте 4 мл трипсина-ЭДТА в каждую колбу и инкубируйте при 37 °C в течение 3-5 мин до отделения клеток.
  5. Добавьте 6 мл TNS в каждую колбу и перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл.
  6. Хорошо перемешайте суспензию пипеткой и возьмите аликвоту 10 мкл для подсчета клеток. Смешайте 10 μл клеточной суспензии с 10 μл трипанового синего и подсчитайте с помощью гемоцитометра.
  7. Центрифужная суспензия клеток при 300 x g в течение 5 мин при RT. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в теплой FM до конечной концентрации 7,5 x 105 клеток/мл.
  8. Промыть базальный канал 200 μл FM.
  9. Нагрейте 15 мл VEM до 37 °C. Промойте апикальный канал 200 μл VEM.
  10. Добавьте 200 μL полного VEM во входное отверстие апикального канала, закупоривая выходное отверстие наконечником для дозатора. Дозируйте среду до тех пор, пока объемы входного и выходного наконечников не сравняются, затем освободите наконечник дозатора от дозатора, оставив наконечник на входе. Держите верхний канал заполненным и заглушенным как на входе, так и на выходе.
  11. Медленно пипетируйте 50 μл суспензии HUF-клеток во входное отверстие базального канала, одновременно отсасывая из выходного отверстия. Извлекайте наконечник дозатора из входного отверстия, когда в наконечнике пипетки остается ~2 μл клеточной суспензии, не нажимая на поршень пипетки и не отпуская его, чтобы избежать образования пузырьков. Заглушите входное и выходное отверстия наконечниками для дозатора.
  12. Проверьте наличие пузырьков под микроскопом. Если они присутствуют, промывайте базальный канал FM и повторяйте шаг 4.11.
  13. Переверните заглушенные чипсы на штатив для пробирок объемом 15 мл и инкубируйте при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 1 часа. Понаблюдайте за чипами после инкубации и проверьте прикрепление клеток.
  14. Заглушите выходное отверстие базального канала наконечником для дозатора. Добавьте 200 мкл FM на вход базального канала, не нажимая на поршень пипетки. Освободите наконечник от пипетки и позвольте среде свободно течь по каналу к выходному наконечнику пипетки под действием гравитационного потока.
  15. Инкубируйте чипсы, посеянные в форинтах, в течение ночи при температуре 37 °C с 5%CO2.

5. Посевной чип апикального канала с эпителиальными клетками влагалища

  1. Нагрейте 50 мл VEM до 37 °C.
  2. Приготовьте покрытие апикального канала (200 мкг/мл коллагена I в DMEM). Держитесь на льду.
  3. Заглушите выход апикального канала наконечником для дозатора.
  4. Добавьте 200 μL покрытия апикального канала на вход апикального канала. Дозируйте апикальный раствор для покрытия до тех пор, пока объемы входного и выходного наконечников не сравняются, затем освободите наконечник дозатора от дозатора, оставив наконечник на входе.
  5. Отсасывайте лишний раствор с поверхности чипа.
  6. Инкубируйте чипсы при 37 °C с 5%CO2 в течение 1 часа.
  7. Через 1 ч промыть покрытие апикального канала, добавив 200 мкл VEM на вход апикального канала во время аспирации из выходного отверстия.
  8. Проверьте рост HVEC под микроскопом на ~70%-90% конфлюенции.
  9. Если клетки на 70–90% сливаются, нагрейте 6 мл полной среды эпителиальных клеток влагалища и 4 мл трипсина/ЭДТА на колбу до 37 °C.
  10. Отсадите среду из колбы HVEC и промойте 5 мл DPBS (-/-), затем аспирируйте.
  11. Добавьте 4 мл трипсина в каждую колбу и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 в течение 3-5 мин до отделения клеток.
  12. Добавьте 6 мл VEM в колбу для инактивации трипсина и перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл.
  13. Хорошо перемешайте суспензию пипеткой и возьмите аликвоту 10 мкл для подсчета клеток. Смешайте 10 μл клеточной суспензии с 10 μл трипанового синего и подсчитайте с помощью гемоцитометра.
  14. Центрифужную суспензию клеток при 300 x g в течение 5 мин при RT. Аспирировать надосадочную жидкость и ресуспендировать гранулу в VEM до конечной концентрации 3,5-4 млн клеток/мл.
  15. Нагрейте 25 мл FM до 37 °C.
  16. Заглушите выход апикального канала наконечником для дозатора. Медленно пипетируйте не менее 40 мкл суспензии клеток HVEC во входное отверстие апикального канала. Дозируйте суспензию клеток до тех пор, пока объемы входного и выходного наконечников не сравняются, затем освободите наконечник дозатора от дозатора, оставив наконечник на входе. Держите базальный канал заполненным FM и подключенным как на входе, так и на выходе.
  17. Осторожно аспирируйте лишнюю среду на поверхности стружки и проверьте наличие пузырьков под микроскопом. Если они присутствуют, повторите шаг 5.16.
  18. Поместите чипсы в большую чашку Петри и инкубируйте при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение ночи.
  19. На следующий день осмотрите чипы под микроскопом для прикрепления клеток.
  20. Извлеките наконечники пипеток из входных и выходных отверстий как апикального, так и базального каналов.
  21. Заглушите выходное отверстие базального канала наконечником для дозатора и добавьте 200 μл FM на входное отверстие базального канала, не нажимая на поршень дозатора. Освободите наконечник пипетки от пипетки и позвольте среде свободно течь по каналу к выходному наконечнику пипетки под действием гравитационного потока.
  22. Повторите шаг 5.21 для апикального канала с помощью VEM.
  23. Инкубировать щепу с двойным посевом при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 24 часов.

6. Подключение чипов к капсулам и дифференцировка эпителиальных клеток влагалища

  1. Добавьте 50 мл FM и VEM для разделения конических пробирок объемом 50 мл и нагрейте до 37 °C.
  2. Дегазируйте нагретые до 37 °C среды FM и VEM в стерильном вакууме в течение 5 мин.
  3. Продезинфицируйте и очистите лотки для модуля динамического потока (DFM, см. Таблицу материалов). Достаньте стручки из упаковки и поместите их в лотки.
  4. Добавьте 2 мл дегазированного VEM в апикальный входной резервуар (верхний правый резервуар; Рисунок 1B). Добавьте среду вдоль стенок резервуара, чтобы избежать образования пузырьков.
  5. Добавьте 3 мл дегазированного FM в базальный входной резервуар (верхний левый резервуар, рисунок 1B). Добавьте среду вдоль стенок резервуара, чтобы избежать образования пузырьков.
  6. Добавьте 500 μл дегазированного VEM в апикальный выпускной резервуар (нижний правый резервуар, рис. 1B). Наклоните стручок так, чтобы среда покрыла всю нижнюю поверхность водоема.
  7. Добавьте 500 μл дегазированного FM в базальный выпускной резервуар (нижний левый резервуар, рис. 1B). Наклоните стручок так, чтобы среда покрыла всю нижнюю поверхность водоема.
  8. Сдвиньте лотки с капсулами в DFM и дважды запустите цикл Prime . Проверьте, не вытекают ли капли из портов на нижней стороне каждого капсулы.
  9. Если капля не образуется после 4 циклов «Prime», установите прямой контакт с портом внутри выпускного резервуара капсулы (рис. 1B) и пипеткой 200 μл соответствующей среды, чтобы среда могла течь между резервуаром и каналом. Это называется «ручным праймингом».
  10. Снимите наконечники пипеток с чипов и поместите каплю соответствующей среды на все порты для каждого чипа.
  11. Разложите чипсы в стручки и выложите их на подносы.
  12. Аспирируйте все среды на поверхности стружки и вставьте каждый лоток в DFM.
  13. Установите следующие параметры на DFM: Top и Bottom - Liquid; Апикальный (верхний канал) расход - 15 мкл/ч; базальный (донный канал) расход - 30 мкл/ч; Растяжение = 0%; Частота = 0 Гц.
  14. Запустите цикл Регулирование на DFM и разрешите поток на ночь.
  15. Через 24 ч измените настройки расхода на 0 мкл/ч для апикального канала и поддерживайте скорость потока в базальном канале на уровне 30 мкл/ч еще 24 ч.
  16. Приготовьте 500 мл дифференцировочной среды (СВ), добавив 4 мМ L-глутамина, 20 мМ гидрокортизона, 1x ITES, 20 нМ трийодтиронина, 100 мкМ O-фосфорилэтаноламина, 180 мкМ аденина, 3,2 мМ хлорида кальция, 2% термоинактивированного FBS, 1% Pen-стрептококка и 120 мл среды F-12 Ham's к DMEM с низким содержанием глюкозы (см. Таблицу материалов) и профильтруйте-стерилизуйте.
  17. Подогрейте 50 мл сухого вещества до 37 °C.
  18. Добавьте 20 мкл 10 мкМ эстрадиола (см. Таблицу материалов) к 50 мл СВ, хорошо перемешайте и дегазируйте в стерильном вакууме в течение 5 мин.
  19. Нагрейте 50 мл VEM до 37 °C на водяной бане и дегазируйте в стерильном вакууме в течение 5 минут.
  20. Извлеките лотки из DFM, поместите их в BSC и аспирируйте среду из модулей, избегая портов в резервуарах (рис. 1A). Затем добавьте 2 мл VEM во входной резервуар апикального канала и 3 мл DM во входной резервуар базального канала.
  21. Верните лотки в DFM и установите поток в апикальный канал на 15 μл/ч, а поток в базальном канале на 30 μл/ч.
  22. Дайте DFM течь в течение 4-7 часов. Затем остановите поток в апикальном канале, установив его на 0 мкл/ч. Пусть поток в базальном канале продолжается со скоростью 30 мкл/ч.
  23. Меняйте носитель, следуя шагам 6.16-6.19 каждые 48 часов.
  24. Проточная среда периодически поступает в апикальный канал в течение 4-7 ч каждый день в течение 5 дополнительных дней после шагов 6.20-6.21.
  25. Приготовьте сбалансированный раствор соли Хэнкса с низкой буферной способностью с глюкозой (HBSS (LB/+G)) путем добавления 1,26 мМ хлорида кальция, 0,49 мМ гексагидрата хлорида магния, 0,406 мМ сульфата магния, 5,33 мМ хлорида калия, 137,93 мМ хлорида натрия, 0,441 мМ одноосновного фосфата калия и 5,55 мМ D-глюкозы к dd H2O (см. Таблицу материалов); рН 4,8.
  26. Приготовьте 500 мл ДМ без стрептококка, добавив 4 мМ L-глутамина, 20 мМ гидрокортизона, 1x ITES, 20 нМ трийодтиронина, 100 мкМ O-фосфорилэтаноламина, 180 мкМ аденина, 3,2 мМ хлорида кальция, 2% инактивированного при нагревании FBS и 120 мл среды F-12 Ham's в DMEM с низким содержанием глюкозы и простерилизуйте фильтром.
  27. На 6-й день замените среду апикального канала на (HBSS (LB/+G)), а среду базального канала на DM без стрептококка, следуя шагам 6.16-6.19.
  28. Установите расход на DFM на 15 мкл/ч для апикального канала и 30 мкл/ч для базального канала в течение 24 ч, прежде чем приступить к бактериальному посеву.

7. Бактериальный инокуляционный посев дифференцированных чипов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в лаборатории и BSC, которые соответствуют правилам обращения с микробами.

  1. Рассчитайте КОЕ/мл каждого штамма бактерий, который должен быть включен в инокулюм. Смешайте необходимое количество каждого штамма бактерий до ~5 x 106 КОЕ/мл.
  2. Центрифугируйте смесь при 7 000 x g в течение 7 мин при 4 °C и осторожно удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в (HBSS (LB/+G)). Это будет бактериальный инокулюм.
  3. Отсоедините фишки от стручков. Заглушите выходное отверстие базального канала наконечником для дозатора и добавьте 200 мкл Pen-Strep-free DM на входное отверстие базального канала, не нажимая на поршень пипетки. Освободите наконечник пипетки от пипетки и позвольте среде свободно течь по каналу к выходу под действием гравитационного потока.
  4. Добавьте 37 мкл бактериального инокулята на вход в апикальный канал, одновременно отсасывая из выходного отверстия. Когда в наконечнике пипетки останется около 2 μл, вытащите наконечник и закупорьте вход и выход апикального канала наконечниками для дозатора.
  5. Для контрольных (неинокулированных) чипов повторите шаг 7.4 с 37 μL (HBSS (LB/+G)).
  6. Аспирируйте любые среды на поверхности чипа. Поместите чипсы в чашку Петри диаметром 150 мм и инкубируйте при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 24 часов.
  7. Поместите капсулы (без стружки) на лотки и поместите их в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 на 24 часа.
  8. Нагрейте 50 мл (HBSS (LB/+G)) и 50 мл DM без шприц-стрептококка до 37 °C.
  9. Добавьте 20 μL 10 μM эстрадиола к 50 мл DM без Pen-Strep, хорошо перемешайте и дегазируйте в стерильном вакууме в течение 5 минут. Дегазируйте (HBSS (LB/+G)) под вакуумом в течение 5 мин.
  10. Осторожно отсасывайте среду в капсулах, избегая впускных и выпускных отверстий резервуара.
  11. Добавьте 3 мл дегазированного (HBSS (LB/+G)) в апикальный входной резервуар и 500 μл дегазированного (HBSS (LB/+G)) в апикальный выпускной резервуар.
  12. Добавьте 3 мл дегазированного ДМ, не содержащего стрептококка, в базальный резервуар входной капсулы и 500 мкл дегазированного ДМ, не содержащего антибиотиков, в базальный резервуар выходной капсулы.
  13. Вставьте лотки с капсулами (без чипов) в DFM и дважды запустите цикл Prime. Проверьте, не вытекают ли капли из каждого порта на нижней стороне капсулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если капля не образуется после 4 циклов «Prime», установите прямой контакт с портом внутри выпускного резервуара капсулы (рис. 1B) и пипеткой 200 μл соответствующей среды, чтобы среда могла течь между резервуаром и каналом.
  14. Снимите наконечники пипеток с чипов и нанесите каплю соответствующего фильтрующего материала на все входные и выходные отверстия канала.
  15. Поместите чипсы в стручки и поместите капсулы в лотки.
  16. Аспирационная среда в апикальных и базальных резервуарах выпускной стручки и любая среда на поверхности стружки. Затем вставьте лотки в DFM.
  17. Установите следующие параметры на DFM: Top и Bottom - Liquid; Апикальный (верхний) поток - 40 мкл/ч; базальный (донный) поток - 40 μл/ч; Растяжка - 0%; Частота - 0 Гц. Запустите цикл Регулировать .
  18. Остановите поток через 4 ч и соберите сточные воды, т.е. среды в апикальные и базальные выпускные резервуары.
  19. Измерение и регистрация объемов сточных вод.
  20. Поместите стружку обратно в DFM и установите апикальный расход на 0 μл/ч, а базальный поток на 30 μл/ч. Запустите поток для работы в течение ночи.
  21. Собранные стоки используются для различных плановых анализов и хранятся при соответствующей температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения КОЕ добавьте глицерин до конечной концентрации 16% и немедленно храните при -80 °C.
  22. Аспирируйте среду только в базальных выходных резервуарах и установите апикальный и базальный расход до 40 мкл/ч в DFM. Запустите поток в течение 4 часов и повторите шаги 7.18-7.21. Это будет сбор сточных вод в течение 48 часов.
  23. Повторяйте шаг 7.22 в течение 72 ч или до окончания эксперимента.
  24. В конечной точке эксперимента соберите стоки, следуя шагам 7.18-7.19.
  25. Приготовьте раствор для пищеварения, добавив 1 мг/мл коллагеназы в/в в TrypLE экспресс. Нагрейте 10 мл раствора для сбраживания до 37 °C.
  26. Заглушите выходное отверстие базального канала наконечником для дозатора. Добавьте 100 μл раствора для разложения в базальный канал. Хорошо перемешайте и с помощью пипетки соберите весь раствор из канала в трубку с надписью «Tube B».
  27. Заглушите выходное отверстие апикального канала наконечником для дозатора. Добавьте 100 μл раствора для сбраживания в апикальный канал. Хорошо перемешайте и с помощью пипетки соберите весь раствор из канала в пробирку с надписью «Пробирка А».
  28. Добавьте еще 100 μл раствора для разложения на входные отверстия апикального и базального каналов, закупоривая выпускные отверстия наконечниками для пипеток. Инкубировать чипсы и пробирки А и В при 37°С в течение 1-1,5 ч.
  29. Хорошо перемешайте пищеварительное содержимое внутри каналов, используя заглушенные наконечники, уже размещенные на входах и выходах. Соберите содержимое апикального и базального каналов в трубки А и В соответственно. Это апикальный и базальный дайджесты чипов.
  30. Подсчитайте клетки в трубке А с помощью гемоцитометра. Кроме того, удалите аликвоту из дайджестов чипов для измерения КОЕ после шага 7.21.

8. Анализ стоков и дигестов щепы

  1. Для подсчета бактерий из сточных вод и пищеварительных фильтров последовательно разбавляют сточные воды или дигесты в стерильной DPBS (-/-) и помещают в подходящую сердечную тарелку, инкубируют при 37°С в течение 24-48 ч и подсчитывают колонии на планшете.
  2. Для измерения pH возьмите 10 μл сточных вод за 72 часа сразу после сбора и используйте полоску pH для измерения pH сточных вод.
  3. Для анализа цитокинов используют стоки для обнаружения специфических цитокинов с помощью анализа на основе люминекса, ИФА или любого другого применимого метода29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Человеческое влагалище выстлано многослойным эпителием, который покрывает богатую фибробластами коллагеновую строму. Чтобы смоделировать это, тканевый интерфейс был создан путем культивирования первичного вагинального эпителия человека и фибробластов на противоположных сторонах общей пористой мембраны в двухканальном микрофлюидном устройстве Organ Chip. Формирование эпителия влагалища контролируется с помощью светлопольной микроскопической визуализации, которая выявляет образование непрерывного листа клеток, который постепенно образует несколько клеточных слоев (рис. 2A). Предыдущие сообщения подтвердили, что эта морфология коррелирует с развитием полностью стратифицированного эпителия при рассмотрении в поперечном сечении29. Однако, если эпителиальный слой кажется неоднородным и прерывистым (рис. 2B), вагинальный чип может быть непригодн для использования в экспериментах.

На рисунке 3 показано схематическое изображение генерации вагинального чипа. Чтобы проверить функциональность вагинального чипа, чипы были инокулированы L. crispatus и G. vaginalis для моделирования здоровой и дисбиотической вагинальной среды соответственно. G. vaginalis — это бактерия, в первую очередь участвующая в бактериальном вагинозе. Чтобы проверить, приживаются ли здоровые и дисбиотические бактерии на чипах влагалища, бактериальную нагрузку в чипах влагалища, инокулированных различными бактериальными популяциями, количественно оценивали бактериальную нагрузку на выделенные слои каналов и переваренные слои клеток на селективных бактериальных питательных средах (агар De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) для L. crispatus и агар крови Brucella (BBA) для G. vaginalis) (см. Таблицу материалов) и сравнивали их с аналогичными культурами с использованием оригинального инокулята. Колонии L. crispatus и G. vaginalis были обнаружены в течение 48 ч после нанесения (рис. 2C), что подтверждает, что как здоровые, так и дисбиотические бактерии прижились к чипам влагалища. Однако, если колонии бактерий наблюдаются на планшетах, содержащих инокулюмы, но не наблюдаются на планшетах, содержащих стоки или перевариваются после необходимой инкубации, то можно сделать вывод, что бактерии не приживились.

Здоровая вагинальная среда кислая, и дисбактериоз приводит к повышению рН влагалища31. Поэтому также был проанализирован рН стока апикального эпителиального канала вагинального чипа. pH вагинальных чипов, инокулированных L. crispatus , был аналогичен pH неинокулированных контрольных чипов, а при совместном культивировании с G. vaginalis у них наблюдалось значительное повышение pH (рис. 2D). Если рН неинфицированного вагинального чипа наблюдается высокий, это указывает на наличие проблемы, и эти чипы не следует использовать для экспериментов.

Воспалительное состояние тканей влагалища также чувствительно к составу микробиома влагалища, при этом дисбиотический микробиом стимулирует воспаление. При анализе провоспалительных цитокинов в апикальном канале чипа влагалища через 3 дня после инокуляции L. crispatus или G. vaginalis, также было обнаружено, что провоспалительная реакция была выше при использовании G. vaginalis по сравнению с неинфицированными чипами и чипами, инокулированными L. crispatus (рис. 2E). В совокупности эти результаты показывают, что вагинальный чип точно имитирует микроокружение влагалища человека как в здоровом, так и в дисбиотическом состоянии.

Figure 1
Рисунок 1: Двухканальный чип и его модуль. (A) Изображение двухканального чипа PDMS с изображением его каналов и портов. (B) Изображение стручка, изображающего резервуары и порты для апикальных и базальных каналов. (C) Принципиальная диаграмма, показывающая вид в поперечном сечении вагинального чипа, зараженного микробами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Вагинальный чип имитирует здоровое и дисбиотическое вагинальное микроокружение человека. (A) Эпителиальные клетки влагалища в апикальном канале надежного вагинального чипа. Масштабная линейка представляет 1 мм чипа на верхнем изображении и 500 μм на нижнем изображении. (B) Эпителиальные клетки влагалища в апикальном канале неадекватного вагинального чипа. Масштабная линейка представляет 1 мм чипа на верхнем изображении и 500 μм на нижнем изображении. (C) Приживление L. crispatus (LC) и G. vaginalis (GV) в чипе влагалища. (D) рН вагинальных чипов после 72-часовой инкубации с L. crispatus (LC) и G. vaginalis (GV) по сравнению с неинфицированными (контрольными) вагинальными чипами. (E) Провоспалительная реакция влагалищных чипов на L. crispatus (LC) и G. vaginalis (GV) после 72-часовой инкубации по сравнению с неинфицированными (контрольными) вагинальными чипами. (К-Е) Графики отображают среднее значение ± SD для 4-6 чипов; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 по сравнению с контрольными вагинальными чипами; Каждый (●) представляет данные с 1 микросхемы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Схематическое изображение протокола для генерации Vagina Chip. Схематическое изображение этапов, связанных с посевом клеток и генерацией вагинального чипа. HVEC - Клетки эпителия влагалища человека; HUFs - фибробласты матки человека; ВЭМ - Эпителиальная среда влагалища; FM - Фибробластные среды; DM - Среда дифференциации; P.S. - Пенициллин Стрептомицин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Прошлые модели влагалища человека in vitro не точно воспроизводят структуры тканей влагалища, поток жидкости и взаимодействие хозяина и патогена19,22. Животные модели также ограничены межвидовыми вариациями в микробиоме и различиями в течке или менструальном цикле19,22. В этой рукописи описывается протокол создания модели человеческого влагалища с помощью чипа органа, которая может эффективно имитировать реакцию человека на здоровые и дисбиотические микробные сообщества.

Этот протокол включает в себя посев клеток вагинального эпителия и фибробластов на противоположных сторонах общей пористой мембраны, которая разделяет параллельные микроканалы, в двухканальном устройстве Organ Chip, которое коммерчески доступно (см. Таблицу материалов). Пористая мембрана обеспечивает миграцию факторов роста и другие формы межклеточной коммуникации. Однако коллагеновое покрытие и наличие клеточных монослоев препятствуют смешиванию сред между каналами. При образовании монослоя эпителиальных клеток влагалища в апикальном канале факторы дифференцировки вводятся в среду, протекающую в базальном канале, которая проходит через интерстициальное пространство и тем самым способствует дифференцировке эпителиальных клеток влагалища с образованием многослойного эпителия. Плотность эпителиальных клеток влагалища во время посева является решающим фактором, определяющим здоровье вагинального чипа в конце фазы дифференцировки. Таким образом, плотность эпителиальных клеток влагалища должна быть оценена до начала дифференцировки, которую не следует начинать до тех пор, пока не будет установлен монослой. Воздействие факторов дифференцировки можно продолжать до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность эпителиальных клеток влагалища и до бактериального посева. Кроме того, следует отметить, что скорость роста может варьироваться для первичных эпителиальных клеток влагалища от разных доноров (или коммерческих источников), что может повлиять на качество генерируемого вагинального чипа. Во всех исследованиях микрофлюидных чипов органов крайне важно удалить любые пузырьки, которые могут образовываться в каналах по всей культуре чипов, поскольку они мешают потоку среды и в конечном итоге приведут к снижению доступности питательных веществ и потере жизнеспособности клеток.

В этом протоколе также описывается, как использовать вагинальный чип для создания бактериальных сообществ на чипе, которые имитируют либо здоровое состояние влагалища, либо бактериальный вагиноз. Вагинальный чип также можно использовать для изучения других вагинальных заболеваний или расстройств; однако при проведении этих исследований следует позаботиться о понимании характеристик каждого заболевания и наилучших средств для корреляции результатов с клиническими данными. Таким образом, влагалищный чип человека открывает новые возможности для изучения множества заболеваний и состояний, связанных с FRT, и может быть ценным инструментом для исследования потенциальных терапевтических средств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Дональд Ингбер является основателем, членом совета директоров, председателем научно-консультативного совета и акционером Emulate. Другие авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Это исследование было спонсировано финансированием Фонда Билла и Мелинды Гейтс (INV-035977) и Института биологической инженерии Висса при Гарвардском университете. Мы также благодарим Гвенн Э. Мерри из Института Висса за редактирование этой рукописи. Диаграмма на рисунке 1 была создана с помощью BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Steriflip Millipore  SCGP00525 To degas media
2 channel chip Emulate BRK-S1-WER-24 Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips) Thomas Scientific, SHARP 1159M40 Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)  Emulate Chip S1 Basic Research kit-24PK Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C  
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)  Emulate Chip S1 Basic Research kit-24PK Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine Sigma Aldrich  A2786 Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates VWR International Inc.  89405-032 with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-) ScienCell 303 For washing cells
Calcium Chloride Sigma Aldrich  C5670 Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)  Sigma Aldrich  499609 Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I  Corning 354236 For the coating solution for HVEC
Collagen IV  Sigma Aldrich  C7521 For the coating solution for HVEC
Collagenase IV Gibco 17104019 For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium  ScienCell 2301 Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium Lifeline LL-0068 Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)  Sigma Aldrich  158968 Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)  Thermofisher 12320-032 Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë) Emulate Zoë-CM1 Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12 Thermofisher 11765-054 Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS  Thermofisher  10438018 Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts ScienCell 7040 HUF
Human vaginal epithelial cells Lifeline FC-0083 HVEC
Hydrocortisone Sigma Aldrich  H0396 Component of the Differentiation media
ITES Lonza 17-839Z Component of the Differentiation media
L-glutamine Thermofisher 25030081 Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate Sigma Aldrich  M2393 Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich  M1880 Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates VWR International Inc.  89407-214 For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine Sigma Aldrich  P0503 Component of the Differentiation media
Pen/Strep Thermofisher  15070063 Component of the Differentiation media
pH strips Fischer-Scientific 13-640-520 For measurement of pH 
Pods (1/chip)  Emulate BRK-S1-WER-24 Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine ScienCell 403 For the coating solution for HUFs
Potassium chloride  Sigma Aldrich  P3911 Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich  P0662 Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol  MP Biomedicals  113055034 For freezing bacterial samples
Triiodothyronine Sigma Aldrich   T6397 Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)  Sigma Aldrich  T8154 For counting live/dead cells
TrypLE Express Thermofisher  12605010 For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)  ScienCell 113 For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%) ScienCell 103 For cell dissociation 
β-estradiol  Sigma Aldrich  E2257 Hormone for differentiation media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Ravel, J. The vaginal microbiota, host defence and reproductive physiology. J Physiol. 595 (2), 451-463 (2017).
  2. Van De Wijgert, J., Jespers, V. The global health impact of vaginal dysbiosis. Res Microbiol. 168 (9-10), 859-864 (2017).
  3. Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: Cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
  4. Goldenberg, R. L., Hauth, J. C., Andrews, W. W. Intrauterine infection and preterm delivery. N Engl J Med. 342 (20), 1500-1507 (2000).
  5. Han, Y., Liu, Z., Chen, T. Role of vaginal microbiota dysbiosis in gynecological diseases and the potential interventions. Front Microbiol. 12, 643422 (2021).
  6. Leitich, H., Kiss, H. Asymptomatic bacterial vaginosis and intermediate flora as risk factors for adverse pregnancy outcome. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 21 (3), 375-390 (2007).
  7. Torcia, M. G. Interplay among vaginal microbiome, immune response and sexually transmitted viral infections. Int J Mol Sci. 20 (2), 266 (2019).
  8. Van Oostrum, N., De Sutter, P., Meys, J., Verstraelen, H. Risks associated with bacterial vaginosis in infertility patients: A systematic review and meta-analysis. Hum Reprod. 28 (7), 1809-1815 (2013).
  9. Lewis, F. M. T., Bernstein, K. T., Aral, S. O. Vaginal microbiome and its relationship to behavior, sexual health, and sexually transmitted diseases. Obstet Gynecol. 129 (4), 643-654 (2017).
  10. Hong, X., et al. The association between vaginal microbiota and female infertility: A systematic review and meta-analysis. Arch Gynecol Obstet. 302 (3), 569-578 (2020).
  11. Peelen, M. J., et al. The influence of the vaginal microbiota on preterm birth: A systematic review and recommendations for a minimum dataset for future research. Placenta. 79, 30-39 (2019).
  12. Smith, P. P., et al. Outcomes in prevention and management of miscarriage trials: A systematic review. BJOG. 126 (2), 176-189 (2019).
  13. Harp, D. F., Chowdhury, I. Trichomoniasis: Evaluation to execution. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 157 (1), 3-9 (2011).
  14. Pastorek, J. G., Cotch, M. F., Martin, D. H., Eschenbach, D. A. Clinical and microbiological correlates of vaginal trichomoniasis during pregnancy. The vaginal infections and prematurity study group. Clin Infect Dis. 23 (5), 1075-1080 (1996).
  15. Petrin, D., Delgaty, K., Bhatt, R., Garber, G. Clinical and microbiological aspects of trichomonas vaginalis. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 300-317 (1998).
  16. Edwards, T., Burke, P., Smalley, H., Hobbs, G. Trichomonas vaginalis: Clinical relevance, pathogenicity and diagnosis. Crit Rev Microbiol. 42 (3), 406-417 (2016).
  17. Eade, C. R., et al. Identification and characterization of bacterial vaginosis-associated pathogens using a comprehensive cervical-vaginal epithelial coculture assay. PLoS One. 7 (11), e50106 (2012).
  18. Fichorova, R. N., Yamamoto, H. S., Delaney, M. L., Onderdonk, A. B., Doncel, G. F. Novel vaginal microflora colonization model providing new insight into microbicide mechanism of action. mBio. 2 (6), e00168 (2011).
  19. Herbst-Kralovetz, M. M., Pyles, R. B., Ratner, A. J., Sycuro, L. K., Mitchell, C. New systems for studying intercellular interactions in bacterial vaginosis. J Infect Dis. 214, S6-S13 (2016).
  20. Johnson, A. P., et al. A study of the susceptibility of three species of primate to vaginal colonization with gardnerella vaginalis. Br J Exp Pathol. 65 (3), 389-396 (1984).
  21. Yildirim, S., et al. Primate vaginal microbiomes exhibit species specificity without universal lactobacillus dominance. ISME J. 8 (12), 2431-2444 (2014).
  22. Edwards, V. L., et al. Three-dimensional models of the cervicovaginal epithelia to study host-microbiome interactions and sexually transmitted infections. Pathog Dis. 80 (1), 026 (2022).
  23. Zhu, Y., et al. Ex vivo 2D and 3D HSV-2 infection model using human normal vaginal epithelial cells. Oncotarget. 8 (9), 15267-15282 (2017).
  24. Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infect Immun. 86 (11), e00282 (2018).
  25. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659-668 (2018).
  26. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nat Biomed Eng. 3 (7), 520-531 (2019).
  27. Valiei, A., Aminian-Dehkordi, J., Mofrad, M. R. K. Gut-on-a-chip models for dissecting the gut microbiology and physiology. APL Bioeng. 7 (1), 011502 (2023).
  28. Izadifar, Z., et al. Mucus production, host-microbiome interactions, hormone sensitivity, and innate immune responses modeled in human endo- and ecto-cervix chips. bioRxiv. , (2023).
  29. Mahajan, G., et al. Vaginal microbiome-host interactions modeled in a human vagina-on-a-chip. Microbiome. 10 (1), 201 (2022).
  30. Masson, L., et al. Inflammatory cytokine biomarkers to identify women with asymptomatic sexually transmitted infections and bacterial vaginosis who are at high risk of HIV infection. Sex Transm Infect. 92 (3), 186-193 (2016).
  31. Amsel, R., et al. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med. 74 (1), 14-22 (1983).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 204
Моделирование здорового и дисбиотического микроокружения влагалища в человеческом влагалище-на-чипе
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gulati, A., Jorgenson, A., Junaid,… More

Gulati, A., Jorgenson, A., Junaid, A., Ingber, D. E. Modeling Healthy and Dysbiotic Vaginal Microenvironments in a Human Vagina-on-a-Chip. J. Vis. Exp. (204), e66486, doi:10.3791/66486 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter