Summary
本文介绍了在成年 非洲爪蟾 中可以快速轻松地访问的六个重要且多样化的器官样本指南：心室、肝叶、胰腺、脂肪体、成对的肾脏和皮肤。
Abstract
一百多年来，非洲爪蟾一直是理解脊椎动物发育和疾病的强大模式生物。虽然胚胎的实验分析和解剖技术已经有充分的记录，但对成年非洲爪蟾结构和器官的描述，以及与成人一起工作的技术，尚未得到更新，以考虑到定量蛋白质组学和单细胞转录组学等现代方法的要求。从细胞类型和基因为中心的视角，需要在胚胎阶段与在成体组织中进行对比观察。在幼虫向成虫的过渡过程中，幼虫器官的整体结构、形态和解剖位置都发生了重大变化，最明显的是在大规模重塑过程中。建立健全的器官鉴定和解剖标准对于确保在不同实验室进行的研究得出的数据集能够保持一致至关重要。本方案确定了成年非洲爪蟾的六个器官，展示了对成年非洲爪蟾的心室、肝脏、脂肪体、胰腺、配对肾脏和皮肤的解剖和取样方法。根据保存方法的不同，解剖器官可用于定量蛋白质组学、单细胞/细胞核转录组学、原位杂交、免疫组化、组织学等。该协议旨在标准化组织取样并促进成人器官系统的多实验室研究。
Introduction
尽管成年非洲爪蟾的“数字解剖”已经可用1，但如果没有其他成年模型（例如小鼠2,3,4）的详细指导，成年非洲爪蟾的可复制器官和组织采样仍然具有挑战性。本文旨在为成年非洲爪蟾的准确和可复制的器官取样提供明确的指导，类似于目前可用于其幼虫的器官取样5.强调易于完成，以保持最大的新鲜度，并使所有用户都可以访问该协议。
虽然有针对 Rana sp.6 的详尽解剖指南，以及针对其他anurans 7 的大量课堂解剖指南，但目前没有可用的非洲爪蟾解剖和取样指南。对于那些不熟悉采样实践或两栖动物解剖学的人来说，非洲爪蟾和其他无蟾之间的微小差异使得这些资源对于可复制的组织取样来说并不理想。
许多有价值的组织不包括在本指南中，甚至被丢弃;这是为了保证组织的新鲜度。六个样本足够有限，以确保无论使用者的经验或技能水平如何，都可以在心脏开始跳动后一小时内收集到这些组织。关于收集许多其他组织的更先进和详细的指南正在作为单独的配套文件编写中。
对于经验不足的用户，始终建议首先在因实验以外的原因被安乐死的动物上尝试此协议，然后再对任何难以替代的动物（即转基因、高龄动物等）进行采样。理想情况下，所有取样的动物都是健康的，如果是雌性，则在过去两周内不会排卵。
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Protocol
所有实验均按照哈佛医学院IACUC（机构动物护理和使用委员会）（IS 00001365_3）的规则和规定进行。灌注和未灌注的成熟白化雄性 非洲爪蟾（Xenopus laevis）的代表性结果均显示。
1. 实验准备
注意：如果在采样前遵循灌注方案8 ，请跳至步骤 2.2。
- 确保研究机构已批准本协议中描述的安乐死技术。
- 制备 5 g/L MS-222（甲基磺酸三卡因）和 5 g/L 碳酸氢钠的溶液（参见 材料表）。该体积必须大于完全覆盖被安乐死的动物所需的体积。检查 pH 值以确保其为 ≥7。
- 通过将 非洲爪蟾 放入安乐死溶液中进行初级安乐死;动物将保持在水中总共 1 小时。
- 设置解剖站，以便在取样后立即在冷冻 PBS 或 0.7x PBS9 （取决于实验需要）中冲洗所有组织，检查并在 5x（或更大）放大灯下修剪。该站还必须使用户能够更换所有镊子和剪刀，或者在两次使用之间将它们擦拭干净。
- 一旦青蛙在溶液中放置 1 小时，初级安乐死就完成了。取出青蛙并通过执行脚捏来检查疼痛反应的丧失。
- 记录动物的适当详细信息，例如物种、品系、性别、年龄和健康状况，以及是否灌注过。称量 非洲爪蟾 的重量并进行任何其他测量，例如鼻子通风口长度。
- 将青蛙放在背上，将四肢固定在身体附近（图1）。
- 使用解剖剪刀，切开皮肤，沿着中线，然后横向切成两个皮瓣。
- 参 照图 2，识别白线并用镊子抓住它并将其从腔腔中拉开。用剪刀小心地切开肌肉组织。从腔壁上做两个襟翼。将所有襟翼切开或固定在一边。
- 确定仍在跳动的心脏。使用解剖剪刀减少喙突骨（图2），以更好地进入心脏。
注意：如果心脏在采样前停止跳动，则应注意样本新鲜度已受到影响。
2. 抽样
注意：如果动物已经灌注，请跳至步骤 2.2。
- 识别薄心包并用组织钳将其拉紧（图3）。
- 使用虹膜切除术剪刀的尖端，轻轻地穿孔心包，注意不要割伤下面的组织。将心包从心脏的 3 个腔室中剥离出来。
- 使用镊子抓住心室的顶点，确定它附着在耳廓和动脉干上的位置（图4），并将其切入这些附着物下方（图5）。如果需要，修剪心室，使耳廓或动脉干的组织不可见，并且心室内仍可见浅色瓣膜组织。
注意：在未灌注的动物中，切除心室可能符合继发性安乐死的条件。 - 肝脏的 3 个叶将是可见的（图 6 和 图 7）。抓住左叶的边缘（在观察者的右侧）并轻轻提起它，使肝管和囊管可见（图8）。对这些附件下方波瓣的底部 1/3 进行采样（图 9）。
- 为了更好地接触雌性青蛙的组织，切除卵巢是有帮助的。识别包裹在称为生发上皮的内脏腹膜层中的卵巢。轻轻移动波瓣，直到它们位于各自的一侧，使附着区域可见（图 10）。这些附着物直接位于配对肾脏的腹侧。
- 使用剪刀，尽可能靠近肾脏切除卵巢，而不会损坏它们（图11）。
- 检查肝脏的内侧叶（也称为前叶），并注意它如何通过肠系膜和肝胰管（也称为胆总管）连接到胃和十二指肠（图 6、 图 7 和 图 8）。
- 使用虹膜切除术剪刀切断肠系膜、肝十二指肠韧带以及与十二指肠相接的肝胰管。切断胰腺和肝胰管与肝脏内侧叶的连接，以免附着深色肝组织（图12）。
- 用齿镊子夹住胃，用组织镊子夹住胰腺的上端。在5倍放大镜下，轻轻地将胰腺从胃中取出（图13）。
注意：如果它没有干净地脱落，剩余的胰腺组织将是可见的，并且可以被切成碎片。或者，可以使用虹膜切除术剪刀和组织镊子有方法地分离胰腺。 - 参考 图 14A，识别膀胱并将其切除，尽可能靠近泄殖腔切开。丢弃此纸巾。
- 参考 图 14B，识别大肠并将其拉紧，以尽可能靠近泄殖腔切断大肠。切除并丢弃整个消化道，切断腹膜与脾脏相连的地方。现在，肥胖的身体将完全可以接触到。
- 挑逗脂肪体，使它们位于各自的两侧。脂肪体与腹膜相连的肾脏上方区域将是可见的。抓住左侧脂肪体的底部（观察者的右侧），并用剪刀将其从腹膜上剪下，留出一小块边缘，以免肾脏受损（图15）。
- 取出并丢弃剩余的脂肪体。配对的肾脏现在将完全可见。
- 在雌性青蛙或具有明显退化输卵管的雄性青蛙中，抓住输卵管并将其从肾脏和泄殖腔中拉开（图16）。切开输卵管与泄殖腔相接的地方，继续将其从肾脏拉开，当它们变得明显时，切断任何明显的腹膜附着物。丢弃此纸巾。
- 对剩余的输卵管重复此过程。
- 肾脏仍然覆盖着透明的腹膜（腹膜后）10。使用镊子抓住肾脏并切断其下端的腹膜。
- 将肾脏从腔腔中取出，使用剪刀将腹膜尽可能靠近肾脏切开，而不会损坏它们（图17）。
- 在 5 倍放大镜下，切去多余的腹膜和任何其他剩余组织（脂肪体、脾脏）。如果青蛙是雌性，请确保切除任何剩余的卵巢组织（图18）。如果青蛙是雄性，小心地切除睾丸并检查是否有退化的输卵管，如果不放大，可能无法看到（图19）。
- 从动物身上取下别针，将其翻转到腹腔，然后重新固定动物的四肢。
- 选择任一后肢进行采样，并固定该肢体的脚。
- 从腓肠肌/胫腓骨上方取下杏仁形的皮瓣（图20）。
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Representative Results
通过使用 图 1 至 图 20 并遵循该协议的所有步骤，心室、肝左叶、胰腺、左脂肪体、成对的肾脏和皮瓣在安乐死后一小时内净地切除。在这段时间内，对样品进行冲洗和修整，使其出现，如图 21 所示。
图 1：固定的非洲爪蟾。 一只成熟的雌性热带X. tropicalis被钉在每肢体上。请点击这里查看此图的较大版本.
图2：腹壁。X. tropicalis 雌性的腹侧皮肤被切成瓣状，使白线和喙状骨可见。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：心包封闭的心脏。 心室的顶点通过心包被抓住。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：心室和动脉干。灌注的 X laevis 的心室，被抓住，显示其与动脉干的附着。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：心脏图。 心脏相关结构图，用虚线表示心室取样位置。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：肝胰图。 肝脏、胰腺和相关器官的 3 个叶的图表。请点击这里查看此图的较大版本.
图7：肝胰腺器官。 灌注的白化 X. laevis 男性，有 3 个肝叶、胰腺和相关器官标记。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：囊性管和肝管。肝脏的左叶被抬起，以显示灌注的 X. laevis 中的囊性管和肝管。请点击这里查看此图的较大版本.
图9：肝脏取样。未灌注的 X. tropicalis 的左肝叶在肝管的附着下被切断。请点击这里查看此图的较大版本.
图 10：卵巢附着。由于卵巢叶位于各自的两侧，因此可以看到生发上皮到腹膜壁（肾脏上方）的连续性。两条白色虚线表示在何处切断这些附件。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 11：卵巢切除。未灌注的 X. laevis 的卵巢被从配对的肾脏中拉开。请点击这里查看此图的较大版本.
图 12：肠系膜切口。未灌注的 X. laevis 的腔腔，在对心室和肝左叶进行取样以及切除卵巢之后。白色虚线表示在哪里切断肝胰韧带和导管，而绿色虚线表示从肝脏内叶切断胰腺的位置。请点击这里查看此图的较大版本.
图 13：胰腺取样。 未灌注的 X. laevis 的胰腺正在从胃中被挑逗出来。请点击这里查看此图的较大版本.
图14：器官摘除。 （A） 将未灌注的 X. laevis 的膀胱从泄殖腔中拉出，并用虚线指示切口的位置。（B） 未灌注的 X. laevis 的大肠被从泄殖腔中拉出，并用虚线指示切断泄殖腔的位置。请点击这里查看此图的较大版本.
图 15：脂肪体采样。 附着在成对肾脏上端腹膜上的脂肪体被从腔腔中拉出，虚线表示切割它们的位置。请注意，与此附件相邻，这种雄性 X. tropicalis 有 1 个睾丸以及一对不同的退化输卵管。请点击这里查看此图的较大版本.
图 16：输卵管移除。 灌注的 X. laevis 的输卵管从配对的肾脏中被拉开，使透明的腹膜可见。虚线表示切开腹膜的位置。请点击这里查看此图的较大版本.
图17：肾脏取样。 未灌注的 X. laevis 的成对肾脏被从腔腔中取出。请点击这里查看此图的较大版本.
图 18：肾脏修剪。 （A） 未灌注的女性 X. laevis 配对肾脏的腹侧视图，附着相关的腹膜器官。（B） 同一个肾脏，相关器官被切除，但仍有一些腹膜组织。请点击这里查看此图的较大版本.
图 19：睾丸切除。 未灌注的 X. tropicalis 的配对肾脏，切除一个睾丸。请点击这里查看此图的较大版本.
图 20：皮肤采样。 （A） 热带X. tropicalis的右腿，用虚线表示要取样的皮肤区域。（B） 热带 X. tropicalis 的右腿，在胫腓骨上取出皮肤样本。请点击这里查看此图的较大版本.
图21：器官取样的代表性结果。心脏心室、肝脏、胰腺、脂肪体、配对肾脏和皮肤样本取自灌注和未灌注的白化病 X. laevis。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
由于该协议旨在最大限度地提高新鲜度，因此某些样品可能包含不需要的组织。例如，肝胰管和一些肠系膜与胰腺一起取样，一些腹膜组织、肾上腺和输尿管将始终与配对的肾脏一起取样。 如果新鲜度不是问题，那么可以使用改进的技术实现更精确的采样。
器官的外观和位置在非洲 爪蟾的性别和物种之间具有可比性。然而，根据动物是否灌注过，组织的颜色会有很大差异。正是由于这个原因，包括灌注和未灌注动物的图像。
该协议的一个限制是速度和可重复性优先于收集最能代表整个所需组织的样本。例如，此处取样的肝左叶切片不能充分代表肝组织的所有三个叶。如果取样中存在错误，则故障排除选项会受到组织不同切片之间可能存在的差异的影响。例如，目前尚不清楚肝脏的右叶、右脂肪体或皮肤的不同部分是否是所需组织的功能性替代品。在这些情况下，应根据研究的需要，在替换组织切片之前谨慎使用。
该协议的另一个限制是，如果被取样的动物有严重的解剖缺陷或具有临床意义的健康问题，则腔室中的器官可能不会像这里描述的那样出现。在感染分枝杆菌属 11,12 的青蛙组织中发现了肉芽肿，先前的卵巢过度刺激综合征病例似乎会导致器官的异常表现13。
虽然这种方法是为实验室 非洲爪蟾开发的，但在许多非盲肠两栖动物和有肢体爬行动物中，这些器官的外观存在显着的相似性14。该协议的采样部分可以很容易地针对其他模型进行修改，例如蝾螈或绿色蝾螈。
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Disclosures
提交人声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了 NIH 的 OD 拨款R24OD031956的支持。我们感谢 Samantha Jalbert、Jill Ralston 和 Cora Anderson 的帮助和支持，以及我们的编辑和匿名同行评审员的有用反馈
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying Glass with LED Light and Stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable Transfer Pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection Tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Iridectomy Scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Sodium Bicarbonate, Powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen Forceps, Serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for Dissecting | Fisher Scinetific | S99385 |
References
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