Summary
Denne artikkelen presenterer en veiledning for prøvetaking av seks betydelige og mangfoldige organer hos voksen Xenopus som raskt og lett kan nås: hjerteventrikkelen, leverlappen, bukspyttkjertelen, fettlegemer, sammenkoblede nyrer og hud.
Abstract
Xenopus har vært en kraftig modellorganisme for å forstå virveldyrs utvikling og sykdom i over hundre år. Mens eksperimentell analyse og disseksjonsteknikker av embryoet er godt dokumentert, har beskrivelser av voksne Xenopus-strukturer og organer, sammen med teknikker for arbeid med voksne, ikke blitt oppdatert for å ta hensyn til kravene til slike moderne tilnærminger som kvantitativ proteomikk og encellet transkriptomikk. De celletype- og gensentriske perspektivene krever kontrasterende observasjoner i embryonale stadier til de i voksent vev. Organene til larven gjennomgår betydelige endringer i deres generelle struktur, morfologi og anatomiske plassering langs overgangen fra larve til voksen, spesielt under massiv metamorfoseombygging. Å etablere robuste standarder for organidentifikasjon og disseksjon er avgjørende for å sikre at datasett som er et resultat av studier utført ved ulike laboratorier kan være konsistente. Denne protokollen identifiserer seks av organene i den voksne Xenopus, og demonstrerer metoder for disseksjon og prøvetaking av hjerteventrikkelen, leveren, fettkroppen, bukspyttkjertelen, sammenkoblet nyre og hud hos den voksne Xenopus. Avhengig av konserveringsmetodene kan de dissekerte organene brukes til kvantitativ proteomikk, enkeltcelle/kjerner transkriptomikk, in situ hybridisering, immunhistokjemi, histologi, etc. Denne protokollen tar sikte på å standardisere vevsprøvetaking og legge til rette for undersøkelser av de voksne organsystemene.
Introduction
Selv om den "digitale disseksjonen" av voksen Xenopus" er tilgjengelig1, er replikerbar organ- og vevsprøvetaking av voksen Xenopus fortsatt utfordrende uten den detaljerte instruksjonen som er tilgjengelig for andre voksne modeller (f.eks. mus 2,3,4). Denne artikkelen tar sikte på å gi klar veiledning for nøyaktig og replikerbar organprøvetaking av voksen Xenopus lik det som for øyeblikket er tilgjengelig for larvenederes 5. Det legges vekt på enkel fullføring for å opprettholde maksimal friskhet og gjøre protokollen tilgjengelig for alle brukere.
Selv om det er en grundig disseksjonsguide for Rana sp.6, samt mange klasseromsdisseksjonsveiledninger for andre anuraner7, er ingen Xenopus-disseksjon og prøvetakingsveiledning tilgjengelig for øyeblikket. For de som ikke er kjent med prøvetakingspraksis eller amfibieanatomi, gjør de små forskjellene mellom Xenopus og andre anuraner disse ressursene suboptimale for replikerbar vevsprøvetaking.
Mange verdifulle vev er ikke inkludert og er til og med forkastet i denne guiden; Dette er for å sikre vevets friskhet. Seks prøver er begrenset nok til å sikre at disse vevene kan samles inn på under en time etter at hjertet begynner å slå, uavhengig av brukerens erfaring eller ferdighetsnivå. Mer avanserte og detaljerte veiledninger for innsamling av mange andre vev er under utarbeidelse som separate ledsagerpapirer.
For mindre erfarne brukere anbefales det alltid at denne protokollen først forsøkes på dyr som avlives av andre grunner enn eksperimentering før du tar prøver av dyr som er utfordrende å erstatte (dvs. transgener, dyr i høy alder, etc). Ideelt sett vil alle dyrene som prøves være friske, og hvis de er hunner, vil de ikke ha hatt eggløsning de siste to ukene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøk ble utført i samsvar med regler og forskrifter fra Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3). De representative resultatene er vist for både en perfusert og uperfundert moden albinohann, Xenopus laevis.
1. Eksperimentell forberedelse
MERK: Hvis perfusjonsprotokoll8 følges før sampling, hopp til trinn 2.2.
- Sørg for at forskningsinstitusjonen har godkjent eutanasiteknikken beskrevet i denne protokollen.
- Tilbered en løsning av 5 g/L MS-222 (trikainmetansulfonat) og 5 g/L natriumbikarbonat (se materialtabell). Volumet må være større enn volumet som kreves for å dekke dyrene som avlives fullstendig. Sjekk pH for å sikre at den er ≥7.
- Utfør primær eutanasi ved å plassere Xenopus i eutanasiløsningen; Dyret vil forbli nedsenket i totalt 1 time.
- Sett opp disseksjonsstasjonen slik at umiddelbart etter prøvetaking kan alt vev skylles i kjølt PBS eller 0.7x PBS9 (avhengig av eksperimentelle behov), kontrolleres og trimmes under et 5x (eller mer) forstørrelseslys. Denne stasjonen må også gjøre det mulig for brukeren å enten bytte ut all tang og saks eller tørke dem rene mellom bruk.
- Når frosken har vært i løsningen i 1 time, er primær eutanasi fullført. Fjern frosken og sjekk tapet av smerterespons ved å utføre en fotklype.
- Registrer de riktige detaljene for dyret, for eksempel art, stamme, kjønn, alder og helsestatus, samt om det var perfusert. Vei Xenopus og ta eventuelle tilleggsmål, for eksempel snuteventillengde.
- Plasser frosken på ryggen og fest lemmene proksimalt for kroppen (figur 1).
- Bruk disseksjonssaks, klipp gjennom huden, oppover midtlinjen og deretter sideveis, og lag to klaffer.
- Med henvisning til figur 2, identifiser linea alba og bruk tang for å ta tak i den og trekke den bort fra det coelomiske hulrommet. Skjær forsiktig opp gjennom muskulaturen med saks. Lag to klaffer ut av hulromsveggen. Klipp eller fest alle klaffene ut av veien.
- Identifiser hjertet som fortsatt vil slå. Bruk disseksjonssaks for å redusere coracoidbeinene (figur 2) for å få bedre tilgang til hjertet.
NOTAT: Hvis hjertet har sluttet å slå før prøvetaking, bør det bemerkes at prøvens friskhet har blitt kompromittert.
2. Prøvetaking
MERK: Hvis dyret har blitt perfusert, hopp til trinn 2.2.
- Identifiser det tynne perikardiet og trekk det stramt med vevstang (figur 3).
- Bruk spissen av iridektomisaksen til å perforere perikardiet forsiktig, og vær forsiktig så du ikke kutter det underliggende vevet. Skrell perikardiet opp vekk fra de 3 kamrene i hjertet.
- Bruk tang til å ta tak i ventrikkelen ved spissen, identifiser hvor den fester seg til auriklene og arteriell stamme (figur 4), og klipp den under disse festene (figur 5). Trim om nødvendig ventrikkelen slik at ingen vev fra auriklene eller arteriestammen er synlig, og lyst klaffvev fortsatt vil være synlig inne i ventrikkelen.
MERK: Hos uperfuserte dyr kan fjerning av ventrikkelen kvalifisere som sekundær eutanasi. - De 3 i leveren vil være synlige (figur 6 og figur 7). Ta tak i leppen på venstre (til høyre for betrakteren) og løft den forsiktig slik at lever- og cystekanalene er synlige (figur 8). Ta prøver av den nederste 1/3 av under disse festene (figur 9).
- For å få bedre tilgang til vevet til en hunnfrosk, er det nyttig å fjerne eggstokken. Identifiser eggstokken som er innhyllet i et lag med visceralt peritoneum kalt germinalepitelet. Flytt forsiktig til de er på hver sin side for å gjøre festeområdet synlig (Figur 10). Disse festene er direkte ventrale til den sammenkoblede nyren.
- Fjern eggstokkene med saks så nær nyrene som mulig uten å skade dem (figur 11).
- Inspiser den mediale (også kalt den fremre) av leveren og legg merke til hvordan den kobles til magesekken og tolvfingertarmen gjennom mesenteriet og hepatopankreaskanalen (også kalt den vanlige gallegangen) (figur 6, figur 7 og figur 8).
- Kutt mesenteriet, hepatoduodenalt ligament ved hjelp av iridektomisaks samt hepatopankreaskanalen der det møter tolvfingertarmen. Bryt forbindelsen mellom bukspyttkjertelen og hepatopankreaskanalen til leverens mediale slik at det ikke festes mørkt levervev (figur 12).
- Ta tak i magen med tanntang og den øvre enden av bukspyttkjertelen med vevstang. Under 5x forstørrelse, erte bukspyttkjertelen forsiktig av magen (figur 13).
NOTAT: Hvis det ikke kommer rent bort, vil det gjenværende bukspyttkjertelvevet være synlig og kan plukkes av i fragmenter. Alternativt kan bukspyttkjertelen metodisk løsnes ved hjelp av iridektomisaks og vevstang. - Med henvisning til figur 14A, identifiser urinblæren og fjern den, skjær så nær cloaca som mulig. Kast dette vevet.
- Med henvisning til figur 14B, identifiser tykktarmen og trekk den stramt for å kutte tykktarmen så nær cloaca som mulig. Fjern og kast hele fordøyelseskanalen, og kutt bukhinnen der den fester seg til milten. De fete kroppene vil nå være fullt tilgjengelige.
- Erter fra hverandre de fete kroppene slik at de er på hver sin side. Området over nyren, der fettlegemet kobles til bukhinnen, vil være synlig. Ta tak i bunnen av den venstre fettkroppen (til høyre for betrakteren) og bruk saks til å klippe den vekk fra bukhinnen, og la det være en liten margin slik at nyrene ikke blir skadet (figur 15).
- Fjern og kast den gjenværende fettkroppen. De sammenkoblede nyrene vil nå være fullt synlige.
- Hos hunnfrosker eller hanner med tydelige vestigiale eggledere, ta tak i en eggleder og trekk den bort fra nyren og cloaca (figur 16). Klipp egglederen der den møter cloacaen og fortsett å trekke den bort fra nyrene, og kutt eventuelle klare peritoneale fester etter hvert som de blir tydelige. Kast dette vevet.
- Gjenta denne prosessen med den gjenværende egglederen.
- Nyrene er fortsatt dekket med klar bukhinne (retroperitoneal)10. Bruk tang for å ta tak i nyrene og kutte bukhinnen i den nedre enden.
- Løft nyrene ut av det coelomiske hulrommet, bruk en saks for å kutte bukhinnen så nær nyrene som mulig uten å skade dem (figur 17).
- Under 5x forstørrelse, kutt bort overflødig bukhinnen og annet gjenværende vev (fettlegemer, milt). Hvis frosken er hunn, sørg for at eventuelt gjenværende eggstokkvev fjernes (figur 18). Hvis frosken er hann, fjern testiklene forsiktig og se etter en vestigial eggleder, som kanskje ikke er synlig uten forstørrelse (figur 19).
- Fjern pinnene fra dyret, vend det på ventrum, og fest dyrets lemmer på nytt.
- Velg et av bakbenene du vil ta prøver fra og fest foten på det lemmet.
- Fjern en mandelformet hudflik over gastrocnemius/tibiofibula (figur 20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å bruke figur 1 til figur 20 og følge alle trinnene i denne protokollen, ble hjerteventrikkelen, venstre leverlapp, bukspyttkjertelen, venstre fettlegeme, sammenkoblede nyrer og en hudklaff skåret rent ut innen en time etter eutanasi. I løpet av denne tiden skylles og trimmes prøvene slik at de vises, som vist i figur 21.
Figur 1: Festet Xenopus. En moden hunn X. tropicalis festet gjennom hvert lem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bukveggen. Den ventrale huden til en X. tropicalis-hunn er kuttet i klaffer, noe som gjør linea alba og coracoid bein synlige. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Perikard omsluttet hjerte. Toppen av hjerteventrikkelen gripes gjennom perikardiet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Hjerteventrikkel og arteriell trunk. Ventrikkelen til en perfusert X laevis, blir grepet, og viser sin feste til arteriell stamme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Hjertediagram. Et diagram over de relevante strukturene i hjertet med en stiplet linje som indikerer hvor du skal ta prøver av ventrikkelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Hepatopankreatisk diagram. Et diagram over de 3 i leveren, bukspyttkjertelen og tilhørende organer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Hepatopankreasorganer. En perfusert, albino X. laevis hann med 3 av lever, bukspyttkjertel og tilhørende organer merket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Cystiske og leverkanaler. Den venstre leverlappen løftes for å vise cystiske og leverkanaler i perfuserte X. laevis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Leverprøvetaking. Den venstre leverlappen til en uperfundert X. tropicalis er kuttet under festene til levergangene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Eggstokkfeste. Med eggstokklappene på sine respektive sider er kontinuiteten til germinalepitelet til bukhinneveggen (over nyrene) synlig. To hvite stiplede linjer indikerer hvor disse festene skal kuttes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Fjerning av eggstokker. Eggstokken til en uperfundert X. laevis, trekkes bort fra de sammenkoblede nyrene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: Mesenterisnitt. Det coelomiske hulrommet til en uperfusert X. laevis, etter prøvetaking av hjerteventrikkel og venstre i leveren samt fjerning av eggstokken. En hvit stiplet linje indikerer hvor hepatopankreasbåndet og kanalen skal kuttes, mens en grønn stiplet linje indikerer hvor bukspyttkjertelen skal kuttes fra leverens mediale. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 13: Prøvetaking av bukspyttkjertelen. Bukspyttkjertelen til en uperfundert X. laevis blir ertet av magen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 14: Fjerning av organer. (A) Urinblæren til en uperfusert X. laevis trekkes bort fra cloaca med en stiplet linje som indikerer hvor den skal kuttes. (B) Tykktarmen til en uperfundert X. laevis blir trukket bort fra cloacaen med en stiplet linje som indikerer hvor den skal kuttes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 15: Prøvetaking av fettkropp. Fettlegemene, festet til bukhinnen i den øvre enden av de sammenkoblede nyrene, trekkes ut av det coelomiske hulrommet med en stiplet linje som viser hvor de skal kuttes. Legg merke til at ved siden av dette vedlegget har denne hannen X. tropicalis 1 testikel samt et par distinkte vestigiale eggledere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 16: Fjerning av eggleder. Egglederen til en perfusert X. laevis trekkes bort fra den sammenkoblede nyren, noe som gjør den klare bukhinnen synlig. En stiplet linje indikerer hvor bukhinnen skal snittes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 17: Prøvetaking av nyrer. De sammenkoblede nyrene til en uperfundert X. laevis løftes ut av det coelomiske hulrommet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 18: Trimming av nyrene. (A) En ventral visning av en uperfundert kvinnelig X. laevis sammenkoblede nyre med tilhørende peritoneale organer festet. (B) Den samme nyren med tilhørende organer fjernet, men med noe peritonealvev igjen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 19: Fjerning av testikkeler. De sammenkoblede nyrene til uperfundert X. tropicalis med en testik er fjernet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 20: Hudprøvetaking. (A) Høyre ben på en X. tropicalis med en stiplet linje som indikerer hudområdet som skal prøves. (B) Høyre ben på en X. tropicalis med en hudprøve fjernet over tibiofibula. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 21: Representative resultater av organprøvetaking. Prøver av hjerteventrikkel, lever, bukspyttkjertel, fettkropp, sammenkoblet nyre og hud tatt fra en perfusert og uperfundert albino X. laevis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden denne protokollen tar sikte på å maksimere friskheten, kan noen prøver inneholde uønsket vev. For eksempel prøvetas hepatopankreaskanalen og noe mesenterium med bukspyttkjertelen, og noe peritonealvev, binyrer og urinledere vil alltid bli prøvetatt med de sammenkoblede nyrene. Hvis friskhet ikke er et problem, kan mer presis prøvetaking oppnås ved hjelp av modifiserte teknikker.
Utseendet og plasseringen av organer er sammenlignbare mellom kjønn og arter av Xenopus. Fargen på vevet varierer imidlertid betydelig basert på om dyrene har blitt perfusert eller ikke. Det er av denne grunn at bilder av både perfuserte og ikke-perfuserte dyr er inkludert.
En begrensning ved denne protokollen er at hastighet og reproduserbarhet prioriteres fremfor å samle inn prøver som best representerer helheten av ønsket vev. For eksempel kan ikke delen av venstre av leveren som er prøvetatt her, tilstrekkelig representere alle tre av levervev. Hvis det er feil i prøvetakingen, påvirkes mulighetene for feilsøking av potensialet for variasjon mellom ulike deler av vevet. For eksempel er det ikke kjent om høyre leverlapp, riktig fettkropp eller en annen del av huden vil være funksjonelle alternativer til ønsket vev. I disse tilfellene bør skjønn brukes, basert på forskningens behov, før du erstatter deler av vev.
En annen begrensning ved denne protokollen er at hvis dyrene som prøves har drastiske anatomiske defekter eller klinisk signifikante helseproblemer, kan det hende at organene i det coelomiske hulrommet ikke vises som beskrevet her. Det er funnet granulomer i vevet til frosker infisert med Mycobacterium spp.11,12, og tidligere tilfeller av ovarialt hyperstimuleringssyndrom ser ut til å føre til en unormal presentasjon av organer13.
Selv om denne metoden er utviklet for laboratorie-Xenopus, er det betydelige likheter i utseendet til disse organene i mange ikke-caecilianske amfibier og lemmede14. Prøvetakingsdelen av denne protokollen kan enkelt modifiseres for andre modeller, for eksempel axolotler eller den grønne anolen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIHs OD-stipend R24OD031956. Vi takker Samantha Jalbert, Jill Ralston og Cora Anderson for deres hjelp og støtte, samt vår redaktør og anonyme fagfellevurderere for deres nyttige tilbakemeldinger
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying Glass with LED Light and Stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable Transfer Pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection Tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Iridectomy Scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Sodium Bicarbonate, Powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen Forceps, Serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for Dissecting | Fisher Scinetific | S99385 |
References
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R.
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a Frog (Rana sp.). Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. JoVE. (issue), e65287 (2023).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Trott, K. A., et al. Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis). Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).
- Fremont-Rahl, J. J., et al. Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs. Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).
- Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol. Herpetol. , 35-81 (2009).
