Summary
يحدد هذا البروتوكول الخطوات الأساسية للحصول على أجنة الأسماك الخالية من الجراثيم (GF) والحفاظ عليها من اليرقات حتى مرحلة الأحداث ، بما في ذلك أخذ العينات والكشف عن حالتها العقيمة. يعد استخدام نماذج GF المصابة بالعدوى أمرا مهما لفهم دور الميكروبات في صحة المضيف.
Abstract
يعمل الزرد كنماذج قيمة للبحث في النمو والمناعة وميكروبات الأمعاء بسبب أوجه التشابه الجينومية مع الثدييات ، والأجنة الشفافة التي تم تطويرها في بيئة مشيمية نظيفة نسبيا ، والتطور السريع للغاية لليرقات مقارنة بنماذج القوارض. تعتبر أسماك الزرد الخالية من الجراثيم (Danio rerio) ضرورية لتقييم سمية الملوثات وإنشاء نماذج أمراض شبيهة بالإنسان تتعلق بالوظائف الميكروبية. بالمقارنة مع النماذج التي يتم تربيتها تقليديا (CR) (الأسماك في التربية الشائعة) ، يسمح الزرد GF بمعالجة أكثر دقة للميكروبات المضيفة ، مما يساعد في تحديد العلاقة السببية بين الكائنات الحية الدقيقة والمضيفين. وبالتالي ، فإنها تلعب دورا حاسما في تعزيز فهمنا لهذه العلاقات. ومع ذلك ، عادة ما يتم إنشاء نماذج الزرد GF والبحث عنها خلال مراحل الحياة المبكرة (من الأجنة إلى اليرقات) بسبب القيود في وظيفة المناعة وامتصاص المغذيات. تعمل هذه الدراسة على تحسين توليد وصيانة وتحديد نماذج الزرد GF المبكرة دون تغذية ومع التغذية طويلة الأجل باستخدام أغذية GF (مثل Artemia sp. ، الجمبري الملحي). طوال العملية ، تم إجراء أخذ العينات اليومية والمزرعة وتحديدها من خلال عمليات الكشف المتعددة ، بما في ذلك اللوحات وتسلسل 16S rRNA. تم تسجيل معدل التعقيم والبقاء على قيد الحياة ومؤشرات النمو لسمك الزرد GF لضمان جودة وكمية النماذج التي تم إنشاؤها. الأهم من ذلك ، تقدم هذه الدراسة تفاصيل حول تقنيات العزل البكتيري والعدوى لأسماك GF ، مما يتيح إنشاء نماذج أسماك GF بكفاءة من اليرقات إلى مراحل الأحداث بدعم غذائي من GF. من خلال تطبيق هذه الإجراءات في البحوث الطبية الحيوية ، يمكن للعلماء فهم أفضل للعلاقات بين الوظائف البكتيرية المعوية وصحة المضيف.
Introduction
تلعب الجراثيم (أي العتائق والبكتيريا وحقيقيات النوى والفيروسات) أدوارا حاسمة في الحفاظ على صحة المضيف والمساهمة في تطور الأمراض المختلفة من خلال التأثير على العمليات الفسيولوجية والمرضية من خلال التفاعلات التكافلية داخل الحاجز المعوي والسطح الظهاري ووظائف الميوسين لدى الأفراد1،2،3. يتشكل تكوين الجراثيم عبر مراحل الحياة المختلفة ، من الطفولة إلى الأحداث ، والبلوغ ، والشيخوخة ، بالإضافة إلى وجودها في مواقع مختلفة مثل مواقع الفم والفم والجلد والأمعاء ، بشكل ديناميكي من خلال الموائل والبيئات المتنوعة4. تشارك الجراثيم المعوية في الكائنات الحية في امتصاص العناصر الغذائية ، والاستجابة المناعية ، وغزو مسببات الأمراض ، وتنظيم التمثيل الغذائي ، وما إلى ذلك 5,6. أظهرت الدراسات التي أجريت على المرضى أن الاضطرابات في ميكروبات الأمعاء مرتبطة بالسمنة البشرية واضطرابات النوم والاكتئاب ومرض التهاب الأمعاء (IBD) والأمراض التنكسية العصبية (باركنسون والزهايمر) والشيخوخة وأنواع السرطانالمختلفة 7،8،9. علاوة على ذلك ، تتضمن المسارات التفاعلية بين ميكروبيوتا الأمعاء والمضيفين عوامل التهابية ، وناقلات عصبية ، ومستقلبات ، وحاجز معوي ، وإجهاد تأكسدي ، كما لوحظ في الأبحاث السابقة باستخدام نماذج الفئران والأسماك10،11.
في الآونة الأخيرة ، تم استكشاف العديد من الأساليب أو العلاجات المتعلقة بالبكتيريا ، بما في ذلك البروبيوتيك المحتمل وزرع الجراثيم البرازية (FMT) ، لهذه الاضطرابات في النماذج السريرية والحيوانية. تستند هذه الاستكشافات إلى الاكتشافات المتعلقة بمحور الجراثيم والأمعاء والدماغ / الكبد / الكلى ، والمنتجات المشتقة من الميكروبات ، ونشاط المستقبلات المتغير12،13. ومع ذلك ، فإن تطوير ووظائف وآليات مختلفة لنظام مضيف الميكروبات لا يزال غير مفهوم ومحدد بشكل كامل بسبب تعقيد المجتمع الميكروبي والتحدي المتمثل في توليد نماذج أمراض قوية تشبه الإنسان.
لمعالجة هذه القضايا ، تم اقتراح نماذج حيوانية خالية من الجراثيم (GF) على وجه السرعة فيمنتصف القرن 19 وتم تطويرها بشكل أساسيخلال القرن 20. التحسينات اللاحقة ، بما في ذلك النماذج المعالجة بالمضادات الحيوية و gnotobiotic ، جنبا إلى جنب مع التطورات في تقنيات الكشف عن الميكروبات ومراقبتها ، زادت من إتقان هذه النماذج14،15،16. تقدم GF ، التي تم إنشاؤها عن طريق محو خلفيتها الخاصة وتجنب الميكروبات البيئية ، استراتيجية ممتازة لاستكشاف التفاعلات بين الكائنات الحية الدقيقة ومضيفيها17. من خلال تطبيق النماذج الحيوانية والبروتوكولات المكررة ، نجح الباحثون في تكرار التركيبات الميكروبية المماثلة الموجودة في المرضى في الفئران والأسماك GF. بالإضافة إلى ذلك ، توفر النماذج الحيوانية الأخرى GF ، مثل والدجاج والخنازير ، خيارات متنوعة كمواضيع بحثية18،19،20،21. وقد مكن هذا النهج من إجراء تحقيقات في الآثار العلاجية المحتملة للميكروبات المتعايشة على أمراض مختلفة ، بما في ذلك العلاج المناعي للسرطان لدى البشر16،18. تقدم نماذج GF رؤى أكثر دقة حول خصائص وآليات الاستعمار البكتيري المحدد والهجرة والتكاثر والتفاعل داخل المضيفين. يوفر هذا رؤى جديدة حاسمة حول حدوث وتطور الأمراض المرتبطة بالميكروبات22,23. تطور تاريخ إنشاء وتطبيق أسماك الزرد GF في الأبحاث الميكروبية من تقارير Rawls et al. في عام 2004 و Bates et al. في عام 2006 إلى بروتوكول Melancon et al. في عام 201716،24،25. ومع ذلك ، لا تزال جدوى نماذج GF البالغة أو المتكاثرة عملية طويلة ، مصحوبة بطول العمر المتغير ومعدلات النجاح والتحديات الصحية.
من بين النماذج الحيوانية المختلفة ، تبرز أسماك الزرد (Danio rerio) كأداة حاسمة لكل من البحوث الأساسية والطبية الحيوية نظرا لتشابهها المفيد مع الأعضاء البشرية وعلم الجينوم ، ودورة النمو القصيرة ، والخصوبة العالية ، والأجنة الشفافة19,26. يقدم الزرد ، الذي يعمل كنماذج موثوقة للأمراض البشرية ، تمثيلا مرئيا للعمليات الفسيولوجية والمرضية في الجسم الحي ، مما يوفر نظرة ثاقبة للسمات الجذابة للتفاعلات بين المضيف والميكروب. والجدير بالذكر أن أسماك الزرد تظهر سلالات خلايا متميزة ، مما يسمح بتصوير فسيولوجيا الأمعاء ، والديناميات الميكروبية ، والغدد التناسلية والتطور التناسلي ، ونضج الجهاز المناعي المضيف ، والسلوك ، والتمثيل الغذائي27. تتطور أجنة الزرد داخل الحبال الواقية حتى الفقس ، وتصبح يرقات في 3 أيام بعد الإخصاب (dpf). يبحثون بنشاط عن الطعام عند 5 dpf ويصلون إلى مرحلة النضج الجنسي بعد حوالي 3 أشهر من الإخصاب (mpf) 28. أظهر أول سمكة زرد ناجحة خالية من الجراثيم (GF) ، أبلغ عنها Rawls et al.24 ، أن اليرقات التي تتغذى على الأعلاف المعقمة بعد امتصاص صفار البيض أظهرت نخرا في الأنسجة من 8 dpf والموت الكلي عند 20 dpf. وقد أشار ذلك إلى آثار النظام الغذائي أو أهمية النظر في إمدادات المغذيات الخارجية في التجارب التي تنطوي على أسماك GF طويلة الأجل (>7 dpf)29. حسنت الدراسات اللاحقة بروتوكول توليد أسماك GF ، باستخدام الطعام المعقم والأساليب المتقنة في نماذج الأسماك المختلفة16.
ومع ذلك ، فقد ركزت معظم الأبحاث حول نماذج الزرد GF على مراحل الحياة المبكرة ، والتي تنطوي على العدوى البكتيرية عند 5 dpf لمدة 24 ساعة إلى 48 ساعة ، مع العينات التي تم جمعها قبل 7 dpf في ختام التجارب25،30،31. من المعترف به على نطاق واسع أن الكائنات الحية الدقيقة في الكائنات الحية ، بما في ذلك البشر وأسماك الزرد ، يتم استعمارها في بداية الحياة وتتشكل أثناء النمو والتطور. يظل التكوين مستقرا في مراحل البلوغ ، حيث تكون أدوار الجراثيم في المضيف حاسمة طوال الحياة ، خاصة في الشيخوخة ، والتنكس العصبي ، والسمنة المرتبطة بالتمثيل الغذائي ، وجوانب الأمراض المعوية3. وبالتالي ، فإن وجهات النظر من GF ذات البقاء على قيد الحياة لفترة أطول يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لآليات الأدوار الميكروبية في تطوير الأعضاء المضيفة ووظائفها ، مع الأخذ في الاعتبار الجهاز المناعي والتناسلي غير الناضج ليرقات الأسماك في الحياة المبكرة. في حين تم عزل السلالات البكتيرية في أمعاء الزرد وتحديدها في الدراسات السابقة ، مما يوفر إمكانية إصابة النماذج الحيوانية GF لاختيار البروبيوتيك أو وظائف البكتيريا البحثية في المضيف19,25 ، فقد اقتصر توليد وتطبيق نماذج أسماك GF في المقام الأول على مراحل الحياة المبكرة. هذا القيد ، الذي يعزى إلى عملية الإنتاج المعقدة ، وارتفاع تكاليف الصيانة ، والقضايا المرتبطة بالغذاء والمناعة ، يعيق الجهود البحثية الرامية إلى التحقيق في الآثار التنموية والمزمنة للميكروبات في المضيف.
يتأثر معدل البقاء على قيد الحياة والسلوك والنمو والنضج والصحة العامة للأسماك ، خاصة في النماذج الخالية من الجراثيم (GF) ، بشكل كبير بممارسات التغذية ، بما في ذلك تناول التغذية والامتصاص خلال فترة فتح الفم من اليرقات المبكرة إلى الأحداث32،33. ومع ذلك ، فإن أحد التحديات في تربية الأسماك GF هو ندرة النظم الغذائية المعقمة المناسبة ، مما يحد من فعالية الدعم الغذائي للحفاظ على نمو اليرقات وبقائها. يعد حل هذه المشكلة أمرا بالغ الأهمية لاستعادة حياة أسماك GF ، مع الأخذ في الاعتبار آليات الدفاع التنموية وضعف قدرات الهضم بسبب عدم وجود ميكروبيوم معوي. من حيث الغذاء ، يظهر الجمبري الملحي الحي (Artemia sp.) باعتباره النظام الغذائي الأنسب لليرقات المفتوحة الفم للأسماك اليافعة. وقد لوحظ أن الأسماك التي تتغذى على الجمبري الملحي الحي تظهر معدلات نمو وبقاء أعلى مقارنة بتلك التي تتغذى على صفار البيض المطبوخ أو الطعوم الطبيعية والاصطناعيةالأخرى 34. في حين أن نماذج الحياة المبكرة لأسماك GF يمكن أن تعيش مع دعم صفار البيض ويمكن الحفاظ على نماذج يرقات GF بالتغذية المعقمة ، فإن توليد نماذج طويلة الأجل من اليرقات إلى الأحداث والوصول إلى مرحلة النضج الجنسي لا يزال يمثل تحديا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن رقائق الطعام أو المسحوق محدودة بسبب التركيب الغذائي غير المتكافئ ويمكن أن تؤثر على جودة المياه. في المقابل ، يتمتع الأرتيميا الحية بمزايا مثل البقاء على قيد الحياة في كل من المياه المالحة والعذبة ، وصغر الحجم المناسب لليرقات للبالغين ، وسهولة التجميع ، وجودة الفقس الأعلى35. بناء على الطرق السابقة16،24،30 ، قمنا بتبسيط عملية العلاج المعقدة ومعالجتنا لتحدي النظام الغذائي من خلال إنشاء GF Live Artemia sp. بسهولة كغذاء معقم لفترات أطول من أسماك GF المبكرة.
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا محسنا يغطي (1) التوليد ، (2) الصيانة ، (3) تحديد معدل التعقيم ، و (4) الصيانة والتغذية لضمان نمو أسماك الزرد الخالية من الجراثيم (GF) من الأجنة إلى اليرقات ومراحل الأحداث. تقدم النتائج أدلة أولية على فقس وبقاء ونمو وعقم أسماك الزرد GF ، إلى جانب المؤشرات الأساسية ل GF Artemia sp. كغذاء معقم. توفر الخطوات التفصيلية في توليد النماذج وإعداد الأغذية الحية المعقمة دعما تقنيا حاسما لبناء وتطبيق نماذج أسماك GF طويلة الأجل ، بالإضافة إلى GF Artemia sp. في أبحاث التفاعل بين الميكروبات والمضيف. يتناول البروتوكول عزل البكتيريا وتحديدها والعدوى على نماذج أسماك GF ، ويحدد طرق وضع العلامات الفلورية البكتيرية ومراقبة استعمارها في أمعاء الأسماك تحت المجهر. ستخضع أسماك GF أو أسماك gnotobiotic المصابة بعدوى بكتيرية أو نماذج الجراثيم البشرية المنقولة لاكتشافات مختلفة لتوضيح وظائفها وتأثيراتها على مناعة المضيف والهضم والسلوك وتنظيم النسخ والجوانب الأيضية. على المدى الطويل ، يمكن توسيع هذا البروتوكول ليشمل أنواعا مختلفة من الأسماك البرية ، مثل الميداكا البحرية ، وربما ليشمل سلالات الزرد المعدلة وراثيا المختارة الأخرى المرتبطة بأنسجة أو أمراض معينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت تجارب الأسماك وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام في تشونغتشينغ واللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في جامعة تشونغتشينغ الطبية ، الصين ، وكذلك معايير التجارب الصادرة عن مكتب الدولة للجودة والإشراف الفني (معرف الموافقة: GB14922-2001 إلى GBT14927-2001). تم الحصول على الزرد (Danio rerio ، النوع البري ، سلالة AB) من معهد علم الأحياء المائية ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، وتم الاحتفاظ بها في المختبر باتباع الإجراءات المبلغ عنها سابقا36.
1. صيانة الزرد البالغ وجمع الأجنة
ملاحظة: بالاعتماد على التعديلات من الدراسات والتقارير السابقة16،37،38،39 ، تم إجراء صيانة الزرد البالغ وتربية اليرقات والممارسات الخاصة بالنماذج الخالية من الجراثيم (GF) في مختبرنا باتباع الخطوات الموضحة أدناه. تم الحصول على نظام التدفق فائق النقاء للاستزراع السمكي تجاريا (انظر جدول المواد). تخضع المياه ، التي يتم الحفاظ عليها بدرجة حموضة متوازنة وملح وقلويات ، للترشيح أثناء ركوب الدراجات لضمان ظروف نظيفة.
- الحفاظ على الأسماك البالغة مع الإجراء القياسي التالي في نظام الدورة التلقائية (انظر جدول المواد) مع فترة ضوئية من الظلام: الضوء = 10 ساعات: 14 ساعة عند 28 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية وتغذى على الأرتيميا المحتضنة الطازجة. مرتين يوميا.
- ضع الزرد البالغ الناضج جنسيا (ذكر: أنثى = 2: 1) في خزانات بها مياه عذبة ونظيفة في الليلة السابقة.
- دع الأسماك تفرخ في صباح اليوم التالي (حوالي الساعة 8:30 صباحا) تحت التحفيز الضوئي المنتظم في المختبر. بعد 1-2 ساعة ، انقل السمك إلى خزان آخر.
- اجمع الأجنة في الماء من نظام التدوير التلقائي كوسيط تربية في طبق استزراع باستخدام ماصة باستور يمكن التخلص منها.
2. توليد الزرد GF من الأجنة إلى اليرقات
ملاحظة: يوضح الشكل 1 الإجراء الخاص بتوليد الأسماك الخالية من الجراثيم (GF) ، بينما يتم عرض المؤشرات التنموية الأساسية للنماذج التقليدية (CR) و GF في الشكل التكميلي 1. يرجى اتباع الخطوات الموضحة أدناه في خزانة السلامة البيولوجية الموضوعة على الطاولة أو غطاء التدفق الصفحي باستخدام تقنية معقمة معقمة في غرفة نظيفة.
- غسل الأجنة باستخدام ماء استزراع الأسماك وإزالة شوائب البراز والبيض الميت أو غير المخصب.
- نقل الأجنة عند 2 hpf إلى أطباق معقمة (حتى 480 جنينا لكل طبق معقم بقطر 10 سم) مملوءة بوسط الزرد الخالي من الجراثيم المضاد الحيوي (AB-GZM ، انظر جدول المواد) محلول وزراعة عند 28.5 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعات.
ملاحظة: يستخدم AB-GZM لعلاج الأجنة لعدة ساعات للقضاء على الكائنات الحية الدقيقة السطحية ، ويستخدم GZM بدون مضادات حيوية لاستزراع أسماك GF في تسلسل فرعي. عادة ، وقت الثقافة المثالي هو 6 ساعات). - استبعد البيض ذو البقع البيضاء أو المظهر الأبيض ، وحدد تلك التي يتم تطويرها عادة ، مع عرض مظاريف شفافة وسليمة لمزيد من المعالجة.
- شطف الأجنة باستخدام AB-GZM ثلاث مرات في غضون 10 دقائق.
- نقع الأجنة في 0.2 جم / لتر من محلول البوفيدون واليود (PVP-I) لمدة 1 دقيقة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: التركيز العالي وأطول من 2 دقيقة سيؤثر على معدل موت وفقس الأجنة. - اغسل الأجنة باستخدام وسط الزرد الخالي من الجراثيم (GZM) ثلاث مرات في غضون 10 دقائق.
- أضف الأجنة إلى محلول عمل هيبوكلوريت الصوديوم (NaClO) ، وقم بتغطية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 50 مل بإحكام ، وقم بالتبييض لمدة 15 دقيقة. خلال هذه الفترة ، قم بتعليق الأجنة في محلول التبييض عن طريق هزها برفق.
- اغسل الأجنة باستخدام GZM ثلاث مرات في غضون 10 دقائق.
- نقل الأجنة إلى ألواح معقمة ذات 6 آبار مع 5 أجنة و 10 مل من GZM لكل بئر. قم بزراعتها في منصة أو حاضنة فائقة النظافة مع فترة ضوئية مظلمة: الضوء = 10 ساعات: 14 ساعة عند 28 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية ، وستؤثر كثافة الثقافة على معدل التعقيم.
- قم بتجديد وسط الاستزراع يوميا عن طريق إزالة GZM المستهلك ، وجمعه كعينات للكشف عن الحالة المعقمة ، وتجديد كل بئر بنفس الحجم من GZM المعقم.
- سجل المؤشرات التنموية الأساسية لأجنة / يرقات GF ، بما في ذلك معدل البقاء على قيد الحياة ، ومعدل الفقس ، ونبضات القلب ، وطول الجسم ووزنه ، إلخ19.
- انقل أسماك GF إلى حاويات مناسبة (أطباق ، قوارير زراعة الخلايا ، أو زجاجات زجاجية ذات أغطية) ذات حجم موسع ، مما يوفر طعاما معقما طوال عملية النمو.
3. صيانة الزرد GF من اليرقات إلى الأحداث
- قم بتجديد GZM دون تغذية قبل 7 dpf واكتشف الحالات المعقمة يوميا (انظر الخطوة 5).
- تغذية يرقات الزرد من 8 dpf إلى مراحل الأحداث مع صفار البيض المعقم (10 ميكرولتر من محلول المخزون المحضر لكل بئر) مرة واحدة يوميا قبل تغيير GZM.
- إطعام صغار GF من 14 dpf مع صفار البيض المعقم الممزوج ب GF Artemia sp. مرة واحدة يوميا (1-3 أرتيميا / يرقات ، انظر الخطوة 4) ، وزيادة كتلة الطعام تدريجيا مع نمو وتطور أسماك GF.
- توفير صفار البيض حتى جميع الأسماك يمكن أن تستهلك الأرتيميا nauplii.
ملاحظة: يجب أن يخضع GF Artemia لاختبار العقم قبل الاستخدام. قم بتقييم عدد الأرتيميا nauplii المتبقي ، ولاحظ التقدم في المطاردة والتقاطه ، وافحص جسم السمكة بالطعام المستهلك للإشارة إلى نجاح التغذية. - من 28 dpf إلى مراحل البلوغ المبكرة ، قم بتغذية GF Artemia مرة واحدة يوميا (3-5 أرتيميا / يرقات) ونظف الأرتيميا غير المستغلة أو الميتة ، والأسماك الميتة في نفايات GZM كعينات يومية.
- أثناء نمو أسماك GF ، قم بتغيير الألواح المكونة من 6 آبار بعد 7 dpf إلى ألواح معقمة أو قوارير زراعة الخلايا من 8 إلى 21 dpf ، ثم إلى زجاجات معقمة بعد 21 dpf. زيادة وسط الاستزراع والكتلة الغذائية وفقا لعدد ووزن أسماك GF في كل حاوية.
- تجديد GZM يوميا وفحص العينات لضمان نجاح نماذج GF.
ملاحظة: يعد الحفاظ على نماذج الأسماك الخالية من الجراثيم (GF) حتى مرحلة البلوغ المبكرة والنضج الجنسي أمرا صعبا ، حيث يبلغ متوسط معدل البقاء على قيد الحياة 30 dpf ، وعادة ما يكون أقل من 10٪. ويعزى ذلك في المقام الأول إلى ضعف المناعة ، وتأخر النمو ، وضعف وظيفة الأمعاء.
4. إعداد GF Artemia nauplii كغذاء معقم لنماذج أسماك GF المزمنة
ملاحظة: تم توضيح طريقة زراعة وتحضير الأرتيميا الخالية من الجراثيم (GF) في الشكل 2. لاحظ أن جميع الخطوات التالية تتم في خزانة السلامة البيولوجية الموضوعة على الطاولة ، باستخدام تقنية معقمة معقمة.
- شطف 0.25 غرام من أكياس الأرتيميا باستخدام 2.4 جم / لتر هيبوكلوريت الصوديوم (NaClO ، انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق.
- قم بتصفية أكياس الأرتيميا المغسولة بفلتر معقم فائق الكثافة (حوالي 170 شبكة في الفتحة) واغسلها بماء معقم عالي النقاء ثلاث مرات ، في كل مرة لمدة 1-2 دقيقة.
- انقل أكياس الأرتيميا المغسولة إلى 100 مل من الماء المالح المعقم بنسبة 2.5٪ ، واخلطها ، وحزمها للفقس المعقم وفقا للخطوات المذكورة أدناه.
- قم بتعبئة محلول خليط أكياس الأرتيميا المعالج سعة 50 مل في زجاجة معقمة بحجم 100 مل ، وقم بإغلاقه بفيلم ، واحتضانه في حاضنة اهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة ، 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة إلى 24 ساعة بالضوء.
- استخرج ما يقرب من 30 مل من فقس Artemia nauplii من الطبقات الوسطى والسفلى باستخدام ماصة باستور يمكن التخلص منها.
ملاحظة: منع البيض العائم والأصداف الفارغة من الوصول إلى الطبقة العليا. يتم عرض مؤشرات الخراجات الأرتيميا الخالية من الجراثيم (GF) و nauplii المحتضنة لمدة 24 ساعة في الشكل 3. - قم بتصفية الأرتيميا بفلتر تعقيم واغسلها في دورق معقم بماء معقم عالي النقاء ثلاث مرات ، حوالي 30 ثانية إلى 1 دقيقة لكل مرة. أخيرا ، أضف 4 مل من الماء المعقم عالي النقاء لتحضير محلول الأرتيميا المختلط.
- باستخدام ماصة باستور التي تستخدم لمرة واحدة ، استرجع أرتيميا السباحة بنشاط من الطبقة العليا ، واغسل ، وقم بإعداد محلول nauplii للتغذية وتحديد التعقيم.
5. تحديد نماذج أسماك GF في مراحل الحياة بأكملها
ملاحظة: طوال مراحل حياة الأسماك الخالية من الجراثيم (GF) بأكملها ، تعد المؤشرات الرئيسية واكتشافات العينات اليومية ضرورية لضمان نجاح النماذج. تلخص هذه الخطوة التصنيف الشائع للعينات والطرق المعتادة لتحديد الهوية (الشكل 4).
- مراقبة وحساب حالة البقاء على قيد الحياة ومعدل يرقات الزرد GF يوميا. في التجارب التي تحسب المعدلات ذات الصلة ، يتم استزراع أسماك GF في 24 أو 48 بئرا مع سمكة واحدة لكل بئر.
- معدل البقاء على قيد الحياة = (عدد الأسماك الحية في وقت الملاحظة / إجمالي عدد البيض) × 100٪.
- معدل العقم = (عدد الأسماك العقيمة / عدد الأسماك الباقية) × 100٪.
ملاحظة: يركز هذا البروتوكول على المعدل المعقم للأسماك الحية. يتم تحديد عدد الأسماك المعقمة عن طريق حساب أسماك GF الناجحة بعد فحوصات متعددة بين الأسماك الحية. يتم التخلص من أي أسماك ميتة أو نماذج GF للأسماك الحية التي فشلت بسبب الوجود البكتيري أثناء إجراءات GF اللاحقة.
- اجمع العينات التالية من يرقات الزرد GF.
- وسط استزراع الزرد GF من كل بئر أو حاوية زجاجة.
- طعام الأسماك ، مثل صفار البيض المعقم و GF Artemia.
- وسط النفايات ، بما في ذلك شظايا غشاء البيض بعد الفقس وبقايا الطعام أو البراز خلال فترات التغذية من اليرقات إلى الأسماك اليافعة.
- عينات الأسماك الميتة لتحديد وجود البكتيريا.
- وسط السمك والعوامل المستخدمة في علاج الأجنة كعنصر تحكم معقم.
- عينات من المواد ومنصة التشغيل والحاضنة ، إلخ.
- الكشف عن العينات التي يتم جمعها يوميا باستخدام طرق متعددة.
- أولا ، استخدم طريقة لوحة الانتشار وألواح الاستزراع في حاضنة عند 30 درجة مئوية.
- معطف مع 20-50 ميكرولتر من عينة النفايات المتوسطة على لوحة Trypticase Soy Agar (TSA) (انظر جدول المواد) في ظل الظروف الهوائية.
- معطف مع 20-50 ميكرولتر من عينة النفايات المتوسطة على لوحة TSA تحت الظروف اللاهوائية.
- معطف مع 20-50 ميكرولتر من عينة النفايات المتوسطة على لوحات TSA الدم (انظر جدول المواد) في ظل الظروف الهوائية.
- معطف مع 20-50 ميكرولتر من عينة النفايات المتوسطة على لوحات TSA الدم تحت الظروف اللاهوائية.
- ثانيا ، استخدم طريقة الثقافة السائلة.
- خذ 200 ميكرولتر من العينة في أنابيب هوائية باستخدام وسط مرق ضخ قلب الدماغ (BHI) (انظر جدول المواد) والثقافة في حاضنة الاهتزاز عند 30 درجة مئوية ، 150-180 دورة في الدقيقة.
- أضف 200 ميكرولتر من العينة إلى الأنابيب اللاهوائية مع وسط BHI وثقافة في الحاضنة عند 30 درجة مئوية.
- أضف 200 ميكرولتر من العينة إلى الأنابيب الهوائية باستخدام وسط مرق الصويا Trypticase (TSB) ، ثم استزراعه في حاضنة الاهتزاز عند 30 درجة مئوية ، 150-180 دورة في الدقيقة.
- أضف 200 ميكرولتر من العينة إلى الأنابيب اللاهوائية مع وسط TSB والاستزراع في الحاضنة عند 30 درجة مئوية.
- ثالثا ، استخدم التقنيات الجزيئية - 16s اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
- تحليل عينة مياه الصرف الصحي مع اثنين من أزواج من الاشعال 27F و 1492R ، وكذلك 63F و 1387R (الجدول 1).
ملاحظة: تم تحضير المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا للجدول 2 باستخدام مجموعة بوليميراز الحمض النووي المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) ، وتم إعداد جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل مع البرنامج المحدد في الجدول 3. - بعد اكتمال برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، افحص المنتجات بنسبة 1٪ من هلام الأغاروزالكهربائي 40 عند النطاقات المستهدفة 1465 نقطة أساس (باستخدام البادئات 27F و 1492R) أو 1324 نقطة أساس (باستخدام البادئات 63F و 1387R) لاستنتاج عقم العينات.
- تحليل عينة مياه الصرف الصحي مع اثنين من أزواج من الاشعال 27F و 1492R ، وكذلك 63F و 1387R (الجدول 1).
- أولا ، استخدم طريقة لوحة الانتشار وألواح الاستزراع في حاضنة عند 30 درجة مئوية.
- تسجيل ومراقبة اختبارات العقم ، بما في ذلك ثقافة الألواح والمتوسطة من 24 ساعة إلى 3 أيام و 7 أيام ، والتي لا تشير خلالها أي مستعمرة على الألواح ولا تعكر في السائل إلى البناء الناجح لنماذج GF. راقب وسجل اللوحة والوسط عند 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة و 120 ساعة و 144 ساعة و 168 ساعة.
6. تحديد عينات الأرتيميا GF قبل التغذية على أسماك GF
ملاحظة: للكشف عن عينات الأرتيميا GF ، والتي لا غنى عنها كغذاء حي قبل التغذية على أسماك GF (الشكل 4) ، اتبع الخطوات أدناه.
- جمع عينات من نماذج الأرتيميا GF.
- أكياس الأرتيميا غير المعالجة.
- علاج الخراجات الأرتيميا GF.
- فقس GF الأرتيميا nauplii.
- مياه معقمة عالية النقاء كعنصر تحكم.
- كشف GF الأرتيميا بالطرق التالية.
- استخدم طريقة لوحة الانتشار للكشف عن العينات عن طريق طلائها على ألواح TSA وألواح TSA في الدم في ظل الظروف الهوائية واللاهوائية. احتضانها عند 30 درجة مئوية.
- استخدم وسيطا سائلا للكشف عن العينات في أنابيب TSB وBHI الهوائية واللاهوائية. الثقافة في شاكر عند 150-180 دورة في الدقيقة ، 30 درجة مئوية.
- استخدم مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن وجود البكتيريا في العينات التي تم جمعها باستخدام بادئات الجينات المستهدفة للريبوسوم الريبوسوم 16s 27F و 1492R و 63F و 1387R (الجدول 1). يتم عرض الحجم والبرنامج في الجدول 2 والجدول 3.
- تسجيل النتائج: الكشف عن منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بنسبة 1٪ هلام الأغاروزالكهربائي 40 للنطاقات المستهدفة قياس 1465 bp (باستخدام الاشعال 27F و 1492R) أو 1324 bp (باستخدام البادئات 63F و 1387R). يمكن أن تضمن نتائج الألواح والوسط السائل الحالة المعقمة ل GF Artemia قبل استخدامها كغذاء أسماك GF.
7. عزل وتحديد السلالات البكتيرية المعوية من الزرد
ملاحظة: لاستكشاف وظائف الأمعاء في المختبر وفي الجسم الحي ، من الضروري عزل السلالات البكتيرية من الزرد ، والتي توفر أيضا مصدر الأنواع للبروبيوتيك المحتمل الذي يتم فحصه عن طريق العدوى باستخدام GF (الشكل 5). في هذا البروتوكول ، نصف طريقة التشريح التقليدية للحصول على محتويات الأمعاء ، في حين يمكن أيضا جمع العينات مباشرة من الأسماك الحية المخدرة (البيانات غير معروضة).
- اختر الزرد البالغ السليم واغسله بالماء المعقم. نفذ الخطوات التالية في المقعد النظيف.
- تخدير السمك ب 100 مجم / لتر MS-222 لمدة 5-10 دقائق.
- استخدم 75٪ كحول لعلاج سطح جسم السمكة.
- تشريح أمعاء الأسماك وقذف محتويات الأمعاء باستخدام وسط TSB أو BHI.
- احتضان طاف الأمعاء عن طريق تطبيق TSA ، صفيحة الدم ، TSB ، ووسط BHI في الظروف الهوائية واللاهوائية.
- ترجمة البكتيريا للحصول على سلالة الإشارة وتسجيل خصائص المستعمرات المختلفة.
- قم بتخزين البكتيريا في 30٪ من الجلسرين عند -80 درجة مئوية.
- بعد ذلك ، حدد البكتيريا المعوية عن طريق استخراج الحمض النووي الجينومي وتسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
ملاحظة: تشمل الخطوات الرئيسية لاستخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري الطرد المركزي السائل ، وتفكك RNase A و Protease K ، واستخراج الكحول الإيثيلي ، والشطف ، والذوبان باستخدام مجموعات متوفرة تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). - تحليل تسلسلات 16S باستخدام المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) وأداة البحث عن المحاذاة المحلية الأساسية (BLAST) مع قاعدة بيانات البكتيريا والعتائق40،41 (انظر جدول المواد).
- اختر أفضل البكتيريا والشخصيات المتطابقة لتحديد السلالات المعوية المعزولة على مستوى الجنس.
- الكشف عن الوظائف الأيضية للسلالات البكتيرية باستخدام مجموعات متاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
8. تسمية الإنفلونزا والعدوى واستعمار البكتيريا في أمعاء الزرد GF
ملاحظة: قبل إصابة الزرد GF ، تم تعديل البكتيريا المعزولة بالأصباغ وعدها ، مما يجعل الاستعمار الميكروبي والهجرة مرئيا بشكل مستمر وفي الجسم الحي (الشكل 6).
- اختر البكتيريا المفيدة المحتملة أو السلالات السائدة ذات الوفرة العالية في المضيف لإصابة نماذج أسماك GF.
ملاحظة: كانت البكتيريا المستخدمة في هذه الدراسة هي Aeromonas sp. و Vibrio sp. (انظر جدول المواد) ، تم اختيارها من 8 أجناس تم عزلها وتحديدها من الزرد البري البالغ فيالمختبر 42. - قم بتسمية البكتيريا الطازجة بأصباغ CM-Dil (انظر جدول المواد) وقم بتعريضها لسمك الزرد GF عند 5 dpf بتركيز 106-10 8 وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) / مل.
- راقب التألق تحت المجهر الفلوري مع تكبير 3× للإشارة إلى استعمار وتوزيع البكتيريا في أمعاء يرقات الزرد GF من 6 dpf و 14 dpf.
- عد يدويا عدد البكتيريا في أسماك GF حسب ثقافة الطبق في كل نقطة زمنية.
- الكشف عن المستعمرات والتسلسلات للتأكد من نجاح العدوى مع السلالات البكتيرية المستهدفة.
- اجمع عينات من أسماك GF المصابة بعدوى بكتيرية للمقايسات اللاحقة ، بما في ذلك السلوك العصبي ، والمؤشرات التنموية ، والتحليل النسيجي المرضي ، وقياسات الهرمونات ، إلخ43،44،45.
ملاحظة: يجب استعادة البكتيريا المستخدمة في تجربة العدوى حديثا واستزراعها حديثا بواسطة الوسط السائل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن إنتاج نماذج أسماك الزرد GF بكفاءة من خلال الاستفادة من البيض الوفير الذي تنتجه أزواج من أسماك الزرد ، مع تحسين البروتوكول بناء على نماذج أسماك GF السابقة35. يمكن للوحة واحدة مكونة من 6 آبار زراعة ما يقرب من 30-48 جنينا / يرقة ، مما يسمح بجمع بيانات وافرة وتحليل إحصائي. بعد المعالجة المعقمة ، يتم استزراع أجنة GF في حاضنة نظيفة حتى تفقس اليرقات في 48-72 ساعة ، ويتم تغيير GZM يوميا مع الكشف عن العينات التي تم جمعها ، وهو أمر بالغ الأهمية للحفاظ على حالة خالية من الجراثيم (الشكل 1). بعد 7 dpf ، يجب تحضير طعام صفار البيض والأرتيميا الحية لليرقات إلى مراحل الأحداث. أثناء نمو الأسماك وتطورها ، يجب تنظيم حجم وحاوية وكثافة GZM أو تغييرها في الوقت المناسب لتجنب الموت وفشل الحالة المعقمة. إذا لم يظهر الاكتشاف أي تلوث بكتيري ، فيمكن الحفاظ على نماذج GF الناجحة كنماذج مزمنة من الأحداث إلى مرحلة البلوغ المبكر ، ولكن معدل البقاء على قيد الحياة أقل بكثير في الممارسة العملية. أخيرا ، يمكن قياس معدل العقم ، ومعدل البقاء على قيد الحياة ، ومؤشر التنمية ، والسلوك ، والتحليل النسيجي المرضي ، وملف النسخ لنماذج أسماك GF و CR لاستكشاف تأثير الميكروبات وحقول فحص الأدوية. في هذه الدراسة ، تمت مقارنة مؤشرات النمو الرئيسية (الشكل التكميلي 1) ، وكان معدل فقس أسماك GF أقل بنسبة 45.7٪ من أسماك CR ، مع 60٪ عند 72 hpf. كانت معدلات ضربات القلب ليرقات GF عند 7 dpf أقل بكثير عند 18.2 نبضة / 10 ثانية مقارنة بأسماك CR مع 22.6 نبضة / 10 ثانية ، ولكن لم يكن هناك فرق بين المجموعتين عند 14 dpf بمعدلات 23.5-23.8 نبضة / 10 ثانية. وكان معدل بقاء أسماك الذرة عند 7 dpf هو نفسه بالنسبة لأسماك CR بنسبة 86.7٪ ، ولكنه انخفض إلى 60٪ عند 14 dpf مقارنة ب 80٪ لأسماك CR. ومع ذلك ، انخفضت معدلات البقاء على قيد الحياة لكل من أسماك GF و CR إلى 25٪ -10٪ بعد فترة فتح الفم عندما اكتسبوا قدرات أو عادات التغذية. كان الفشل في الحفاظ على الحالة المعقمة للأسماك أحد أسباب انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة. لذلك فإن التغذية وصيانة المغذيات من مراحل الأحداث إلى مرحلة البلوغ المبكر تمثل تحديات حاسمة في الاستزراع السمكي.
عامل رئيسي آخر يؤثر على نمو وتطور الأسماك هو التغذية. في هذه الدراسة ، نستكشف طرقا متعددة للحصول على GF Artemia كغذاء حي ليرقات الزرد GF طويلة الأجل للأحداث والبالغين (العملية الموضحة في الشكل 2). نظرا للاستخدام اليومي للأغذية لأسماك GF ، يجب أن يكون البروتوكول الأمثل ل GF Artemia سهلا وموفرا للوقت واقتصاديا في الممارسة العملية. بعد مقارنة الحركة النشطة وموت / جمود النوبلي الذي لاحظه المجهر ، وخصائص النوبلي ، والبيض غير المفقس ، والقشرة ، تم إتقان الطريقة. بعد الحضانة اليومية ، لوحظت وقياس مؤشرات الأرتيميا GF الطازجة التي تم الحصول عليها من الزجاجات ، بما في ذلك معدل الفقس والبقاء والتشوه ، وطول ووزن nauplii ، تحت المجهر (الشكل 3). بعد العلاج ، كان معدل فقس أكياس الأرتيميا مرتفعا ، بمتوسط 88.15٪ ، وكان بقاء نوبلي السباحة 77.83٪ ، وكان معدل التشوه 1.87٪. كان طول جسم النوبلي 546.70 ميكرومتر ، وكان مؤشر وزن الجسم 3.80 مجم / 100 ، وهي مناسبة لصيد الأسماك وتغذيتها من فترة فتح شهر اليرقات إلى مراحل الأحداث والبالغين.
يعد اكتشاف أسماك GF و GF Artemia مهما أيضا لصيانة النموذج. وفقا لجمع العينات وطرق الاختبار المتعددة ، يمكن أن توفر النتائج نجاح أجنة الزرد المعالجة وأكياس الأرتيميا في الصفيحة المستزرعة والوسط السائل (الشكل 4). يجب الكشف عن العينات المختلفة التي يتم جمعها يوميا على أنها معقمة في جميع طرق الاختبار ، والتي يمكن أن تشير بعد ذلك إلى نماذج GF في وقت التجميع. يجب الكشف عن الأرتيميا GF قبل التغذية على أسماك GF ، أو يجب أن تشير نتائج الحاضنة واللوحة المتوسطة إلى الحالة المعقمة للنوبلي الحي الطازج. وهذا هو ، زراعة GF Artemia من الخراجات على لوحات TSA أو TSB أو BHI الزجاج السائل المتوسط في حضانة هز ، والتي يمكن استخدامها لتوليد GF Artemia والتحقق المعقم في نفس الوقت. يمكن أن يستوعب بروتوكول GF Artemia عددا محدودا من اليرقات للتغذية. أثناء عملية التغذية ، كان من الواضح أن مادة الأرتيميا GF تسبح داخل GZM ثم تم التقاطها واستهلاكها بواسطة يرقات أسماك GF.
تشمل تطبيقات نماذج أسماك GF مجالات مختلفة في علم الأحياء والطب ، مما يسمح بالتحقيق في الوظائف الميكروبية ، والنمو والتطور ، وآليات المرض ، وفحص البروبيوتيك أو الأدوية ، من بين أمور أخرى46. في هذه الدراسة ، على سبيل المثال ، تم عزل اثنين من البكتيريا المعوية الرئيسية ، Aeromonas sp. و Vibrio sp. ، من الزرد. تم إجراء خصائص المستعمرة وتحديد هويتها ، وتم قياس وظائف التمثيل الغذائي المتعددة في المختبر باستخدام مجموعات متاحة تجاريا (الشكل 5). تم عزل هذه البكتيريا وتحديدها بتسلسل 16S ، وتم تقديم نتائج الانفجار في تقرير سابق42. تمكن السلالات البكتيرية التي تم تحديدها من إجراء بحث علمي حول تأثير الميكروبات المفردة أو المركبة على صحة المضيف من خلال إصابة نماذج أسماك GF. تسمح شفافية يرقات الأسماك بمراقبة الخلايا البكتيرية الموسومة بالتألق باستخدام أصباغ CM-Dil ، مما يكشف عن الاستعمار والتوزيع في أمعاء أسماك GF (كما هو موضح في الشكل 6). بعد العدوى البكتيرية عند 5 dpf ، يمكن تصوير يرقات الزرد GF باستخدام مجهر مضان ومراقبتها باستمرار من 6 إلى 14 dpf ، مما يوفر نظرة ثاقبة للوظائف الميكروبية جنبا إلى جنب مع مؤشرات النمو والتغيرات النسيجية المرضية والتغيرات الجزيئية47.
الشكل 1: بروتوكول أسماك الزرد GF من الأجنة إلى اليرقات والأحداث. تشمل الخطوات الرئيسية في توليد أسماك الزرد GF ما يلي: (1) جمع الأجنة من الزرد من النوع البري ووضعها في AB-GZM. (2) شطف العلاج بعوامل PVP-I و NaClO لضمان العقم الكامل. (3) استزراع أجنة / يرقات GF في ألواح ذات 6 آبار مع GZM ، وتجديد الوسط يوميا. (4) تنظيم ظروف الاستزراع من أجل النمو والتطور الأمثل. (5) أخذ العينات في مراحل النمو المختلفة ، يليها اختبار العقم باستخدام طرق الألواح والوسط السائل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بروتوكول تحضير الأرتيميا GF كغذاء حي لأسماك GF. تشمل الخطوات الرئيسية ما يلي: (1) شطف علاج أكياس الأرتيميا للعقم الكامل. (2) إعداد الخراجات GF في المتوسطة. (3) الحضانة في محلول ملحي لمدة 24 ساعة لتعزيز الفقس. (4) ترشيح الفقس الفاشل والبيض الفارغ لجمع النوبلي النشط. (5) غسل nauplii التي تم جمعها لإزالة الحطام ، وضمان أغذية حية عالية الجودة وخالية من الملوثات. (6) اختبار عقم الأرتيميا GF قبل تغذية يرقات الأسماك GF. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مؤشرات أكياس الأرتيميا GF و nauplii المحتضنة لمدة 24 ساعة. (أ) أكياس الأرتيميا غير المعالجة مع فيلم النجاسة (شريط المقياس: 500 ميكرومتر). (ب) أكياس الأرتيميا المعالجة بسطح محدب قليلا بعد امتصاص الماء ومظهر أنظف (شريط المقياس: 500 ميكرومتر). (ج) الفحص المجهري للغشاء البريطاني الأرتيميا نوبلي الحي المحتضن حديثا (شريط المقياس: 2000 ميكرومتر) و (د) التكبير بشريط مقياس 1000 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: الكشف المعقم عن أسماك GF في كل مرحلة من مراحل الحياة والأرتيميا GF. (أ) اختبارات معقمة لعينات أسماك CR و GF باستخدام الوسط السائل TSB و BHI ، TSA ، وألواح الدم في الظروف الهوائية واللاهوائية. (ب) اختبارات معقمة لأكياس الأرتيميا غير المعالجة ، وأكياس الأرتيميا GF ، والنوبلي باستخدام الوسط السائل TSB و BHI ، TSA ، وألواح الدم في ظل الظروف الهوائية واللاهوائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: عزل البكتيريا المعوية والتعرف عليها في الزرد. (أ) السلالات البكتيرية ، خصائص المستعمرات ، خرائط تسلسل 16S (أمثلة: Aeromonas sp. و Vibrio sp.). (ب) انضمام الجنس و NCBI. ج: الوظائف الأيضية للبكتيريا المعزولة من أمعاء الزرد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: عدوى واستعمار سلالات بكتيريا الأمعاء في أسماك الزرد GF. (أ) استعادة السلالات البكتيرية المعزولة والمحددة لتجارب العدوى. (ب) وضع العلامات على البكتيريا ذات الأصباغ الفلورية وإصابة يرقات الزرد GF عند 5 dpf. التكبير: 1x. (C) مراقبة توزيع واستعمار البكتيريا (Vibrio sp.) في أنسجة الأمعاء في الجسم الحي. التكبير: 3x. (د) عد وحدات CFU للبكتيريا (Aeromonas sp. و Vibrio sp.) في كل يرقة سمكية عن طريق أخذ العينات اليومية. تعرض البيانات متوسط ± التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الاشعال | التسلسلات (5'-3') | طول المنتج |
| 27 فهرنهايت | AGAGTTTGATCMTGGCTCAG | 1465 BP |
| 1492 ص | ACGGYTACCTTGTTACGACTT | |
| 63 فهرنهايت | CAGGCCTAACACATGCAAGTC | 1324 حصان |
| 1387R | GGGCGGWGTGTACAAGGC |
الجدول 1: الاشعال المستخدمة للكشف عن البكتيريا.
| مكونات | الوحدات | الحجم (ميكرولتر) |
| تاك الحمض النووي البلمرة | 2.5 وحدة / ميكرولتر | 0.1 |
| 10× عازلة (ملغ2+) | --- | 2.1 |
| خليط dNTP | 2.5 مللي متر | 1.6 |
| التمهيدي 27F | 10 ميكرومتر | 1 |
| التمهيدي 1492R | 10 ميكرومتر | 1 |
| خال من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي H2O | --- | 13.2 |
| قالب الحمض النووي | --- | 1 |
| الحجم الكلي | --- | 20 |
الجدول 2: التركيز النهائي وحجم المكونات لكل تفاعل.
| درج | درجة الحرارة | الوقت | دورات |
| تمسخ أولي | 95 درجة مئوية | 4 دقائق | -- |
| تمسخ | 94 درجة مئوية | 1 دقيقة | 35 |
| الصلب | 55 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| امتداد | 72 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| التمديد النهائي | 72 درجة مئوية | 10 دقائق | -- |
| مسك | 4 درجة مئوية | ∞ | -- |
الجدول 3: برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم جين 16S rRNA.
الشكل التكميلي 1: المؤشرات التنموية الحرجة لنماذج الزرد GF و CR. (أ) معدل فقس أسماك الزرد CR و GF عند 72 hpf ، و (B) نبضات القلب / 10 s من أسماك CR و GF عند 7 dpf و 14 dpf. انخفضت معدلات البقاء على قيد الحياة (٪) من أسماك CR و GF من 7 أيام و 14 يوما بنسبة 86٪ ، 60٪ -80٪ إلى 10٪ -25٪ عند 30٪ dpf. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكولات أسماك GF وإعداد الطعام GF
خلال توليد نماذج أسماك GF ، تم تضمين العديد من الخطوات الحاسمة ، بما في ذلك تحضير المواد المعقمة ، وتعقيم الأجنة ، والتجديد اليومي ل GZM ، وجمع العينات المختلفة ، والفحص المعقم لكل عينة باستخدام طرق متعددة. من بين هذه الخطوات ، يعد العلاج الأولي للأجنة أمرا أساسيا وحاسما لنجاح نماذج GF. تعتبر عوامل التحكم وتركيزاتها وأوقات المعالجة ضرورية لتحقيق معدلات التعقيم المثلى ونجاح الفقس. من الضروري توخي الحذر عند التعامل مع أجنة أسماك GF إلى اليرقات ، بما في ذلك التغييرات المتوسطة اليومية وضمان تعقيم المواد والمنصات تماما باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو التعقيم عند إزالة الألواح من الحاضنة. تعد مراقبة ظروف درجات الحرارة ووقت التشغيل خلال فصل الشتاء أمرا ضروريا لمنع موت اليرقات الناجم عن انخفاض درجات الحرارة في المقاعد النظيفة.
يجب أن يخضع صفار البيض المعقم والأرتيميا GF للكشف قبل إطعامهما للصيد بعد 7 dpf لضمان حالتهما المعقمة لنماذج GF طويلة الأجل. خلال فترة التغذية ، يعد تنظيف بقايا الطعام أمرا مهما كجزء من العينات التي يتم جمعها للكشف عنها عند تجديد وسط النفايات. يجب تعديل الحاوية وحجم GZM وكتلة الطعام جنبا إلى جنب مع مراحل النمو والتطور لمنع فقدان أسماك GF بسبب البيئة المحيطة المحدودة وقضايا جودة المياه. وتساهم المراقبة والتعديلات المنتظمة في هذه البارامترات في نجاح صيانة نماذج أسماك المعامل العالمي.
تعديلات وأهمية هذه البروتوكولات
تضمن العملية المبسطة المكونة من ثلاث خطوات لتوليد أجنة أسماك الزرد GF ، والتي تتضمن عوامل وتركيزات وأوقات تعرض محسنة لمحاليل AB-GZM و PVP-I و NaClO ، معدلا معقم مرتفعا وتطورا صحيا للنماذج. بالإضافة إلى ذلك ، تم إتقان طرق الكشف المعقمة للعينات اليومية لتشمل الألواح ومزارع الوسط السائل في ظل الظروف الهوائية واللاهوائية ، إلى جانب التقنيات الجزيئية باستخدام الاشعال البكتيرية الشائعة. تهدف التجارب الإضافية في اختبار الملوثات البكتيرية والفطرية إلى تحسين ملوثات العوازل والاختبار المعقم خلال تقنيات GF الحيوانية48.
تم التحقيق في البروتوكول المحدد ل GF Artemia nauplii كغذاء حي لنماذج الأسماك في دراستنا ، وتم منح براءة اختراع ل PPJ و DSP من قبل الإدارة الوطنية الصينية للملكية الفكرية (No. ZL202210482684.8). إن نماذج أسماك GF طويلة الأجل مقيدة باستمرار بالتغذية غير الكافية وغير المناسبة ، مما يؤدي إلى تفاقم نقاط الضعف في وظائف الأمعاء المتعلقة بالهضم والامتصاص. كمصدر غذائي موثوق لنماذج medaka و zebrafish في مراحل الحياة المختلفة ، يجب أن يكون GF Artemia sp. سهل التحضير من خلال إجراء بسيط ووقت حضانة قصير واكتشاف معقم في الوقت الفعلي للاستخدام اليومي. في هذه الطريقة ، يتم شطف أكياس الأرتيميا الطبيعية بتركيز كاف من كلوريد الصوديوم لتكون معقمة ثم يتم تحضينها في زجاجة مغلفة بالفيلم ، وكذلك على طبق وفي وسط سائل للكشف. هذا يدعم nauplii الفقس الطازج لتغذية الأسماك GF. معدل العقم ومعدل الفقس من الأرتيميا ، وكذلك طول الجسم والوزن والنشاط ، ممتازة ، مما يشير إلى التطبيقات المتاحة في الممارسة العملية.
إن أهمية هذه التعديلات في أسماك GF وبروتوكولات الغذاء GF تفيد الباحثين في توليد نماذج في الأجنة واليرقات ومراحل الأحداث وحتى مراحل البالغين والبالغين المبكرة في الأنواع البحرية والمياه العذبة. ستوفر GF طويلة الأجل الإذن كما هو الحال في نماذج الجسم الحي في الأبحاث حول فحص الأدوية والوظائف الميكروبية أثناء نمو المضيف وتطوره ، خاصة في نضج المناعة وخطوط الخلايا المعوية ذات الصلة. على سبيل المثال ، تمتلك يرقات الزرد مناعة فطرية فقط في الأسبوع الأول ، ثم تطور نظام المناعة التكيفي خلال 7-21 dpf ، جنبا إلى جنب مع نضج الغدة الصعترية31,49. علاوة على ذلك ، يمكن أن توفر نماذج أسماك GF إمكانية تحليل تفاعلات البكتيريا والبكتيريا والميكروبات المضيفة مع الملاحظة الحية لعمليات الاستعمار الديناميكي والهجرة في الكائنات الحية50,51.
حدود الطريقة
لا يزال استزراع أسماك GF من الأحداث إلى البالغين الأوائل (28 dpf-2.5 mpf) والبالغين الناضجين جنسيا (>2.5 mpf) يمثل تحديا بسبب زيادة الوفيات وخطر التلوث البكتيري أثناء صيانة النموذج. وتنشأ هذه القيود في المقام الأول من عدم وجود أنظمة مناسبة للاستزراع الذاتي للأسماك التي تعيش في بيئة GF. يجب أن تشمل هذه الأنظمة الهواء النظيف والماء ونظام غذائي للحفاظ على وبيئاتها بشكل فعال ، مما يضمن العزل التام عن الكائنات الحية الدقيقة الخارجية. على عكس النماذج الحيوانية الأخرى مثل الفئران والدجاج52 ، فإن الحصول على أسماك الزرد GF من خلال العمليات التشريحية من آباء CR يمثل تحديا بسبب عاداتهم المائية وأسلوب الإخصاب الطبيعي.
إن معاملة البالغة على أنها خالية تماما من الجراثيم المعوية أمر صعب أيضا. في حين أن العلاج بالمضادات الحيوية قد يحفز حالة مماثلة لحيوانات معينة خالية من مسببات الأمراض (SPF) ، تتميز بانخفاض الجراثيم المكتشفة في عينات البراز ، فإن تحقيق نماذج الأسماك البالغة الحقيقية GF لا يزال صعبا. إن التحديات التي ينطوي عليها إنشاء نماذج GF والحفاظ عليها ، خاصة أثناء الانتقال من الأحداث إلى الدول طويلة الأجل ، كبيرة. يتم الاعتراف بأهمية نسل GF ، مثل بيض GF F1 أو F2 من أسماك GF البالغة ، في الأبحاث الميكروبية. ومع ذلك، فإن التغلب على التحديات في إنشاء وصيانة نماذج أسماك GF البالغة على المدى الطويل يتطلب وقتا طويلا.
تجدر الإشارة إلى أنه تم تطوير أسماك الزرد gnotobiotic مع استعمار بكتيري محدد ، مما يدل على البقاء المزمن على أساس نماذج GF. ومع ذلك ، لا يزال من غير المؤكد ما إذا كانت هذه النماذج يمكن أن تكون بمثابة بدائل قابلة للتطبيق لنماذج GF في العدوى البكتيرية والبحوث الطبية الحيوية.
التطبيقات المستقبلية لنماذج أسماك GF
في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين بروتوكول توليد نماذج الزرد GF ، والتقدم من الأجنة إلى الأحداث. يحمل هذا التقدم تطبيقات مهمة في علم الأحياء التنموي ، وعلم المناعة ، وأبحاث الأمراض البشرية ، وتكوين الأعضاء. من خلال العزلة الجماعية وتحديد الهوية ، تستكشف الدراسة الوظائف والآليات والمستقلبات المشتقة من الأمعاء للسلالات البكتيرية المفردة. يتضمن التحقيق إصابة نماذج الزرد GF بعد فتح فتحة التهويةالمرحلة 47,53. بالإضافة إلى ذلك ، تسهل البكتيريا الموسومة ذات التألق مراقبة الاستعمار والتوزيع في يرقات GF الحية ، الخالية من التأثيرات الميكروبية الأخرى54. يمكن إنشاء نماذج أسماك GF مماثلة ، مثل medaka البحرية أو المياه العذبة ، باستخدام طرق قابلة للمقارنة مع عوامل مختلفة أو تغييرات متوسطة.
للتحقيق في آليات الأمراض البشرية ، تستخدم الدراسة طرق FMT ، ونقل العينات من المرضى أو المتبرعين إلى السليمة أو نماذجGF 55. على عكس التي يتم تربيتها تقليديا (CR) ، تقدم نماذج GF دليلا قويا على الوظائف الميكروبية أو التأثيرات أو الاستجابات في المضيف ، خاصة عندما تقترن بالبكتيريا لتنظيم البكتيريا المستهدفة في الجراثيم46.
باختصار ، يعمل الزرد GF كنماذج قوية لتقييم السلامة البكتيرية ، أو فعالية الدواء ، أو سمية الملوثات ، أو التداخل المركب ، بسبب بيئتها المعوية الحساسة والنقية. يجب أن يشمل الاستكشاف المستقبلي لتطبيقات أسماك GF مجالات مختلفة ، مع الحاجة إلى إنشاء نماذج أسماك GF البالغة لفهم أعمق للوظائف الميكروبية عبر مراحل الحياة المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تم منح بروتوكول GF Artemia كبراءة اختراع من قبل الإدارة الوطنية الصينية للملكية الفكرية ، والتي ستخفف من الاستخدام المقيد للطريقة بعد الحصول على إذن المؤلفين. يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح منافسة أو مالية أخرى.
Acknowledgments
نشكر بصدق الدعم المقدم من مشروع المواهب بجامعة تشونغتشينغ الطبية (رقم R4014 إلى DSP و R4020 إلى PPJ) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، رقم 32200386 إلى PPJ) ، واستوديو تشونغتشينغ للابتكار بعد الدكتوراه (X7928 DSP) ، وبرنامج المركز الصيني السريلانكي المشترك لأبحاث تكنولوجيا المياه ومظاهرة من قبل الأكاديمية الصينية للعلوم (CAS) / المركز المشترك بين الصين وسريلانكا للتعليم والبحث من قبل CAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB-GZM | Amphotericin:Solarbio; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. | Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313. |
49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL). |
| 1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes | biosharp | BS-15-M | To collect samples, and hold agents |
| 2.4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution. |
| 6-well plates, 24-, 48- well plates | LABSELECT | 11112 | To culture fish |
| Aeronomas | NCBI database | No.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
| Anaerobic TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system. |
| Anaerobic work station | GENE SCIENCE | E200G | Bacterial isolation, sterile testing |
| Analysis | GraphPad Prism 5 | v6.07 | To analysis the data |
| API 20 E kits | BioMerieux SA, France | No.1005915090 | Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism |
| Artemia (Brine shrimp) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | Aquamaster brand | Artemia cysts, and brine shrimp eggs |
| Auto cycle system for fish culture | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Maintain the fish |
| Autoclave | Zeal Way | G154DWS | Prepare the materials |
| BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder. |
| BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Biochemical incubator | LongYue Co., Ltd | SPX | For fish and plates |
| Biosafety cabinet | Haier | HR40-IIA2 | Sterile treatment and testing |
| Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water. |
| Blood plates | sheep blood:Solarbio | Cat. NO. TX0030 | Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates. |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | To culture fish |
| CM-Dil dyes | Molecular Probes | Cat#C7000 | To label the bacteria |
| Constant temperature shaking incubator | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Bacterial culture |
| Database | NCBI | Bacteria and Archaea database | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ |
| Disposable Pasteur pipette | biosharp | bs-xh-03l | Used to change water, and transfer eggs |
| Disposable petri dish | biosharp | BS-90-D | To culture fish |
| DNA kits | Solaribio | Cat#D1600 | Bacterial genomic DNA extraction kits |
| Electric pipette | SCILOGEX | Levo me | Change water |
| Exiguobacterium | NCBI database | No.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
| GZM | Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L. |
| Laboratory pure water system | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Prepare the agents |
| Microscope | Nikon | SMZ18 | With fluorescent light to observe fish larvae |
| PCR kits | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA Polymerase kit |
| Pipette | LABSELECT | sp-013-10 | Change water |
| Povidone iodine (PVP-I) | Aladdin | Lot#H1217005 | Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water. |
| Timing converter | PinYi Co., Ltd | AL-06 | To regulate the light |
| TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder. |
| TSB Aerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl. |
| TSB Anaerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Ultra-clean workbench | Airtech | SW-CJ-2FD | Sterile treatment and testing |
| Ultra-pure flow system for fish culture | Marine Biological Equipment company | No Cat | Produce water for fish |
| Vibrio | NCBI database | No.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
References
- Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118 (2021).
- Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbiol. 11 (4), 227-238 (2013).
- Kim, S., Jazwinski, S. M. The gut microbiota and healthy aging: A mini-review. Gerontology. 64 (6), 513-520 (2018).
- Milani, C., et al. The first microbial colonizers of the human gut: Composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota. Microbiol Mol Biol Rev. 81 (4), e00036 (2017).
- De Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: Mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Shi, N., Li, N., Duan, X., Niu, H. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system. Mil Med Res. 4 (1), 14 (2017).
- Liu, B. N., Liu, X. T., Liang, Z. H., Wang, J. H.
- Aron-Wisnewsky, J., Warmbrunn, M. V., Nieuwdorp, M., Clément, K. Metabolism and metabolic disorders and the microbiome: The intestinal microbiota associated with obesity, lipid metabolism, and metabolic health-pathophysiology and therapeutic strategies. Gastroenterology. 160 (2), 573-599 (2021).
- Chen, Y. W., Zhou, J. H., Wang, L. Role and mechanism of gut microbiota in human disease. Front Cell Infect Microbiol. 11, 625913 (2021).
- Hao, W. Z., Li, X. J., Zhang, P. W., Chen, J. X. A review of antibiotics, depression, and the gut microbiome. Psychiatry Res. 284, 112691 (2020).
- Nadal, A. L., et al. gut immunity: Using the zebrafish model to understand fish health. Front Immunol. 11, 114 (2020).
- Asadi, A., et al. Obesity and gut-microbiota-brain axis: A narrative review. J Clin Lab Anal. 36 (5), e24420 (2022).
- Mlynarska, E., et al. The role of the microbiome-brain-gut axis in the pathogenesis of depressive disorder. Nutrients. 14 (9), 1921 (2022).
- Yu, Y. J., Raka, F., Adeli, K. The role of the gut microbiota in lipid and lipoprotein metabolism. J Clin Med. 8 (12), 2227 (2019).
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. J Microbiol Biotechnol. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Melancon, E., et al. Best practices for germ-free derivation and gnotobiotic zebrafish husbandry. Methods Cell Biol. 138, 61-100 (2017).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods Mol Biol. 1438, 123-135 (2016).
- Wang, X. N., Wu, C. W., Wei, H. Humanized germ-free mice for investigating the intervention effect of commensal microbiome on cancer immunotherapy. Antioxid Redox Signal. 37 (16), 1291-1302 (2022).
- Jia, P. P., et al. Role of germ-free animal models in understanding interactions of gut microbiota to host and environmental health: A special reference to zebrafish. Environ Pollut. 279, 116925 (2021).
- Gootenberg, D. B., Turnbaugh, P. J. Companion animals symposium: Humanized animal models of the microbiome. J Anim Sci. 89 (5), 1531-1537 (2011).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Kamareddine, L., Najjar, H., Sohail, M. U., Abdulkader, H., Al-Asmakh, M. The microbiota and gut-related disorders: Insights from animal models. Cells. 9 (11), 2401 (2020).
- Rogala, A. R., Oka, A., Sartor, R. B. Strategies to dissect host-microbial immune interactions that determine mucosal homeostasis vs. Intestinal inflammation in gnotobiotic mice. Front Immunol. 11, 214 (2020).
- Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4596-4601 (2004).
- Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev Biol. 297 (2), 374-386 (2006).
- Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
- Xia, H., et al. Zebrafish: An efficient vertebrate model for understanding role of gut microbiota. Mol Med. 28 (1), 161 (2022).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: Staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat Protoc. 3 (12), 1862-1875 (2008).
- Shan, Y., et al. Immersion infection of germ-free zebrafish with listeria monocytogenes induces transient expression of innate immune response genes. Front Microbiol. 6, 373 (2015).
- Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. A. Zebrafish axenic larvae colonization with human intestinal microbiota. Zebrafish. 15 (2), 96-106 (2018).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
- Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
- Nascimento, M. D., Schorer, M., Dos Santos, J. C. E., Rocha, M. S. A., Pedreira, M. M. Live and frozen Artemia nauplii for catfish (steindachner, 1876) larvae in different salinities. Trop Anim Health Prod. 52 (2), 653-659 (2020).
- Jia, P. P., et al. Breaking the mold: The first report on germ-free adult marine medaka (oryzias melastigma) models. bioRxiv. , (2023).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. JoVE. (69), e4196 (2012).
- Wilson, C.
- Aleström, P. a-O., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C.
- Nursyirwani, N., et al. Phenotype and genotype of lactic acid bacteria (lab) isolated from the tiger grouper Epinephelus fuscoguttatus alimentary tract. F1000Res. 6, 1984 (2017).
- Karolenko, C., Desilva, U., Muriana, P. M. Microbial profiling of biltong processing using culture-dependent and culture-independent microbiome analysis. Foods. 12 (4), 844 (2023).
- Jia, P. P., et al. Chronic exposure to graphene oxide (go) induced inflammation and differentially disturbed the intestinal microbiota in zebrafish. Environ Sci Nano. 6 (8), 2452-2469 (2019).
- Sun, B. L., et al. Probiotic supplementation mitigates the developmental toxicity of perfluorobutanesulfonate in zebrafish larvae. Sci Total Environ. 799, 149458 (2021).
- Qian, H. F., Liu, G. F., Lu, T., Sun, L. W. Developmental neurotoxicity of microcystis aeruginosa in the early life stages of zebrafish. Ecotoxicol Environ Saf. 151, 35-41 (2018).
- Bertotto, L. B., Catron, T. R., Tal, T. Exploring interactions between xenobiotics, microbiota, and neurotoxicity in zebrafish. Neurotoxicology. 76, 235-244 (2020).
- Jia, P. P., et al. Bacteriophage-based techniques for elucidating the function of zebrafish gut microbiota. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (7-8), 2039-2059 (2023).
- Xin, G. Y., et al. Gut bacteria vibrio sp. And aeromonas sp. Trigger the expression levels of proinflammatory cytokine: First evidence from the germ-free zebrafish. Fish Shellfish Immunol. 106, 518-525 (2020).
- Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109 (2023).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, danio rerio: A gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Rolig, A. S., Parthasarathy, R., Burns, A. R., Bohannan, B. J. M., Guillemin, K. Individual members of the microbiota disproportionately modulate host innate immune responses. Cell Host Microbe. 18 (5), 613-620 (2015).
- Stressmann, F. A., et al. Mining zebrafish microbiota reveals key community-level resistance against fish pathogen infection. ISME J. 15 (3), 702-719 (2021).
- Guitton, E., et al. Production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies. JoVE. (160), e61148 (2020).
- Rea, V., Bell, I., Ball, T., Van Raay, T. Gut-derived metabolites influence neurodevelopmental gene expression and wnt signaling events in a germ-free zebrafish model. Microbiome. 10 (1), 132 (2022).
- Russo, P., et al. Zebrafish gut colonization by mcherry-labelled lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3479-3490 (2015).
- Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Ley, R. E., Gordon, J. I. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection. Cell. 127 (2), 423-433 (2006).
