Summary
Denne protokollen skisserer de primære trinnene for å oppnå bakteriefrie (GF) fiskeembryoer og opprettholde dem fra larver til juvenilstadiet, inkludert prøvetaking og påvisning av deres sterile status. Bruk av GF-modeller med infeksjon er viktig for å forstå mikrobers rolle i vertshelsen.
Abstract
Sebrafisk tjener som verdifulle modeller for forskning på vekst, immunitet og tarmmikrobiota på grunn av deres genomiske likheter med pattedyr, gjennomsiktige embryoer utviklet i et relativt rent korionmiljø og ekstremt rask utvikling av larver sammenlignet med gnagermodeller. Bakteriefri (GF) sebrafisk (Danio rerio) er avgjørende for å evaluere toksisitet av forurensende stoffer og etablere menneskelignende sykdomsmodeller relatert til mikrobielle funksjoner. Sammenlignet med konvensjonelt hevede (CR) modeller (fisk i vanlig husdyrhold), tillater GF sebrafisk mer nøyaktig manipulering av vertsmikrobiotaen, noe som hjelper til med å bestemme årsakssammenhengen mellom mikroorganismer og verter. Følgelig spiller de en kritisk rolle i å fremme vår forståelse av disse forholdene. Imidlertid genereres og forskes GF-sebrafiskmodeller vanligvis i de tidlige livsstadiene (fra embryoer til larver) på grunn av begrensninger i immunfunksjon og næringsopptak. Denne studien optimaliserer generering, vedlikehold og identifisering av tidlige GF sebrafiskmodeller uten fôring og med langtidsfôring ved bruk av GF-mat (som Artemia sp., saltlake reker). Gjennom hele prosessen ble daglig prøvetaking og kultur utført og identifisert gjennom flere deteksjoner, inkludert plater og 16S rRNA-sekvensering. Den aseptiske hastigheten, overlevelsen og utviklingsindeksene til GF sebrafisk ble registrert for å sikre kvaliteten og kvantiteten til de genererte modellene. Det er viktig at denne studien gir detaljer om bakteriell isolasjon og infeksjonsteknikker for GF-fisk, noe som muliggjør effektiv opprettelse av GF-fiskemodeller fra larver til juvenile stadier med GF-matstøtte. Ved å anvende disse prosedyrene i biomedisinsk forskning, kan forskere bedre forstå forholdet mellom tarmbakterielle funksjoner og vertshelse.
Introduction
Mikrobiota (dvs. Archaea, bakterier, eukarya og virus) spiller avgjørende roller i å opprettholde vertshelsen og bidra til utviklingen av ulike sykdommer ved å påvirke fysiologiske og patologiske prosesser gjennom symbiotiske interaksjoner i tarmbarrieren, epiteloverflaten og mucinfunksjonene hos individer 1,2,3. Sammensetningen av mikrobiota på tvers av forskjellige livsstadier, fra barndom til ungdom, voksen alder og aldring, samt dens tilstedeværelse på forskjellige steder som nares, oral, hud og tarmsteder, er dynamisk formet av ulike habitater og miljøer4. Tarmmikrobiota i organismer er involvert i næringsopptak, immunrespons, patogeninvasjon, metabolsk regulering, etc 5,6. Studier på pasienter har vist at forstyrrelser i tarmmikrobiota er relatert til menneskelig fedme, søvnforstyrrelser, depresjon, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), nevrodegenerative sykdommer (Parkinsons, Alzheimers), aldring og forskjellige kreftformer 7,8,9. Videre involverer interaktive veier mellom tarmmikrobiota og verter inflammatoriske faktorer, nevrotransmittere, metabolitter, tarmbarriere og oksidativt stress, som observert i tidligere forskning ved bruk av mus og fiskemodeller 10,11.
Nylig har flere bakterierelaterte tilnærminger eller terapier, inkludert potensielle probiotika og fekal mikrobiotatransplantasjon (FMT), blitt utforsket for disse lidelsene i kliniske og dyremodeller. Disse undersøkelsene er basert på funn relatert til mikrobiota-tarm-hjerne/lever/nyre-aksen, mikrobiota-avledede produkter og endret reseptoraktivitet12,13. Imidlertid er utviklingen, ulike funksjoner og mekanismer i mikrobiota-vertssystemet fortsatt ufullstendig forstått og identifisert på grunn av kompleksiteten i det mikrobielle samfunnet og utfordringen med å generere kraftige menneskelignende sykdomsmodeller.
For å løse disse problemene ble bakteriefrie (GF) dyremodeller raskt foreslått i midtenav det 19. århundre og primært utviklet i løpetav det 20. århundre. Påfølgende forbedringer, inkludert antibiotikabehandlede og gnotobiotiske modeller, sammen med fremskritt innen mikrobiell deteksjon og observasjonsteknologi, perfeksjonerte disse modellene ytterligere 14,15,16. GF-dyr, skapt ved å slette sin egen bakgrunn og unngå miljømikrober, tilbyr en utmerket strategi for å utforske samspillet mellom mikroorganismer og deres verter17. Gjennom bruk av dyremodeller og raffinerte protokoller har forskere vellykket replikert lignende mikrobielle sammensetninger funnet hos pasienter i GF-mus og fisk. I tillegg gir andre GF-dyremodeller, som hunder, kyllinger og griser, forskjellige alternativer som forskningspersoner 18,19,20,21. Denne tilnærmingen har gjort det mulig å undersøke potensielle terapeutiske effekter av kommensale mikrobiomer på ulike sykdommer, inkludert kreftimmunterapi hos mennesker16,18. GF-modeller gir mer nøyaktig innsikt i egenskapene og mekanismene til spesifikk bakteriell kolonisering, migrasjon, multiplikasjon og interaksjon i verter. Dette gir avgjørende ny innsikt i forekomsten og utviklingen av mikrobiota-relaterte sykdommer22,23. Historien om å etablere og anvende GF sebrafisk i mikrobiell forskning har utviklet seg fra rapportene til Rawls et al. i 2004 og Bates et al. i 2006 til Melancon et al. sin protokoll i 2017 16,24,25. Imidlertid er muligheten for voksne eller avl GF-modeller fortsatt en langvarig prosess, ledsaget av variabel levetid, suksessrate og helseutfordringer.
Blant ulike dyremodeller skiller sebrafisk (Danio rerio) seg ut som et kritisk verktøy for både grunnleggende og biomedisinsk forskning på grunn av sin fordelaktige likhet med menneskelige organer og genomikk, kort utviklingssyklus, høy fruktbarhet og gjennomsiktige embryoer19,26. Sebrafisk, som tjener som pålitelige sykdomsmodeller for mennesker, tilbyr en visuell representasjon av fysiologiske og patologiske prosesser in vivo, og gir innsikt i de attraktive egenskapene til vertsmikrobeinteraksjoner. Spesielt viser sebrafisk forskjellige cellelinjer, noe som tillater avbildning av tarmfysiologi, mikrobiell dynamikk, gonader og reproduktiv utvikling, modning av vertsimmunsystemet, oppførsel og metabolisme27. Sebrafiskembryoer utvikler seg innenfor beskyttende korioner til klekking, og blir larver 3 dager etter befruktning (dpf). De jakter aktivt på mat ved 5 dpf og når seksuell modenhet rundt 3 måneder etter befruktning (mpf)28. Den første vellykkede bakteriefrie (GF) sebrafisken, rapportert av Rawls et al.24, viste at larver fôret med autoklavfôr etter at eggeplommeabsorpsjon viste vevnekrose fra 8 dpf og total død ved 20 dpf. Dette indikerte effekten av diett eller viktigheten av å vurdere eksogen næringstilførsel i eksperimenter med langvarig (>7 dpf) GF-fisk29. Etterfølgende studier forbedret genereringsprotokollen til GF-fisk, ved å bruke steril mat og metoder perfeksjonert i forskjellige fiskemodeller16.
Imidlertid har det meste av forskningen på GF sebrafiskmodeller fokusert på tidlige livsstadier, som involverer bakteriell infeksjon ved 5 dpf i 24 timer til 48 timer, med prøver samlet inn før 7 dpf ved avslutningen av forsøkene 25,30,31. Det er allment anerkjent at mikrobiota i organismer, inkludert mennesker og sebrafisk, er kolonisert i begynnelsen av livet og formet under vekst og utvikling. Sammensetningen forblir stabil i voksne stadier, med mikrobiotaens roller i verten som avgjørende gjennom livet, spesielt i aldring, neurodegenerativ, metabolsk relatert fedme og tarmsykdomsaspekter3. Dermed kan perspektiver fra GF-dyr med lengre overlevelse gi innsikt i mekanismene for mikrobielle roller i vertsorganutvikling og funksjoner, med tanke på de umodne immun- og reproduksjonssystemene til fiskelarver i tidlig liv. Mens bakteriestammer i sebrafisktarmene har blitt isolert og identifisert i tidligere studier, og gir potensialet for å infisere GF-dyremodeller for å velge probiotika eller forske på bakterielle funksjoner i verten19,25, har generering og anvendelse av GF-fiskemodeller primært vært begrenset til tidlige livsstadier. Denne begrensningen, som tilskrives den komplekse produksjonsprosessen, høye vedlikeholdskostnader og tilhørende problemer med mat og immunitet, hindrer forskningsinnsats for å undersøke utviklingsmessige og kroniske effekter av mikrobiota i verten.
Overlevelsesraten, atferden, veksten, modningen og den generelle helsen til fisk, spesielt i bakteriefrie (GF) modeller, påvirkes betydelig av fôringspraksis, som omfatter næringsinntak og absorpsjon i den munnåpne perioden fra tidlige larver til ungdyr32,33. En av utfordringene i GF-fiskehold er imidlertid mangelen på egnede sterile dietter, noe som begrenser effektiviteten av ernæringsstøtte for å opprettholde larvenes vekst og overlevelse. Å løse dette problemet er avgjørende for å gjenopprette livet til GF-fisk, med tanke på deres utviklingsforsvarsmekanismer og svake fordøyelsesevner på grunn av fraværet av et tarmmikrobiom. Når det gjelder mat, fremstår levende saltlakereker (Artemia sp.) som den mest egnede dietten for munnåpne larver til ungfisk. Det har blitt observert at fisk fôret med levende saltlake reker viser høyere vekst og overlevelse sammenlignet med de som er matet med kokt eggeplomme eller andre naturlige og syntetiske agn34. Mens tidlige livsmodeller av GF-fisk kan overleve med eggeplommestøtte og GF-larvemodeller kan opprettholdes med steril fôring, er det fortsatt utfordrende å generere langsiktige modeller fra larver til ungdyr og nå seksuell modenhet. I tillegg er flak eller pulvermat begrenset av ulik ernæringsmessig sammensetning og kan påvirke vannkvaliteten. I kontrast har levende Artemia fordeler som overlevelse i både salt og ferskvann, liten størrelse egnet for larver til voksne, enkel batching og høyere klekkekvalitet35. Basert på tidligere metoder 16,24,30 har vi forenklet den komplekse behandlingsprosessen og adressert diettutfordringen ved å etablere lett inkubert GF levende Artemia sp. som steril mat av lengre varighet enn GF-fisk i tidlig liv.
Denne studien presenterer en optimalisert protokoll som dekker (1) generasjon, (2) vedlikehold, (3) identifisering av steril hastighet og (4) vedlikehold og fôring for å sikre vekst av bakteriefri (GF) sebrafisk fra embryoer til larver og juvenile stadier. Resultatene gir foreløpige bevis på klekking, overlevelse, vekst og sterilitet av GF sebrafisk, sammen med viktige indekser for GF Artemia sp. som steril mat. De detaljerte trinnene i modellgenerering og tilberedning av sterile levende matvarer gir avgjørende teknisk støtte for å konstruere og anvende langsiktige GF-fiskemodeller, samt GF Artemia sp. i mikrobiota-vertinteraksjonsforskning. Protokollen adresserer bakteriell isolasjon, identifikasjon og infeksjon på GF fiskemodeller, skisserer metoder for bakteriell fluorescensmerking og observerer deres kolonisering i fisketarmene under et mikroskop. GF-fisk, gnotobiotisk fisk med bakteriell infeksjon eller overførte humane mikrobiotamodeller vil gjennomgå forskjellige deteksjoner for å belyse deres funksjoner og effekter på vertsimmunitet, fordøyelse, oppførsel, transkriptomisk regulering og metabolske aspekter. På lang sikt kan denne protokollen utvides til forskjellige villtype fiskearter, som marine medaka, og potensielt til andre utvalgte transgene sebrafisklinjer korrelert med spesifikke vev eller sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fiskeforsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene fra Animal Care and Use Committee of Chongqing og Institutional Animal Care and Use Committee of Chongqing Medical University, Kina, samt standarder for forsøksdyr utstedt av State Bureau of Quality and Technical Supervision (Approval ID: GB14922-2001 til GBT14927-2001). Sebrafisk (Danio rerio, villtype, AB-stamme) ble hentet fra Institutt for hydrobiologi, Det kinesiske vitenskapsakademi, og vedlikeholdt i laboratoriet etter tidligere rapporterte prosedyrer36.
1. Vedlikehold av sebrafisk for voksne og embryoinnsamling
MERK: Ved å trekke på modifikasjoner fra tidligere studier og rapporter 16,37,38,39, ble vedlikehold av voksen sebrafisk, larveoppdrett og praksis for bakteriefrie (GF) modeller i laboratoriet vårt utført ved å følge trinnene som er beskrevet nedenfor. Det ultrarene strømningssystemet for fiskekultur ble kommersielt oppnådd (se materialtabell). Vannet, opprettholdt med en balansert pH, salt og alkali, gjennomgår filtrering under sykling for å sikre rene forhold.
- Oppretthold voksen fisk med følgende standardprosedyre i autosyklussystemet (se materialtabell) med en fotoperiode av mørket: lys = 10 t: 14 timer ved 28 ° C ± 0,5 ° C og matet med fersk inkubert Artemia sp. to ganger daglig.
- Sett den kjønnsmodne voksne sebrafisken (hann: hunn = 2:1) i tanker med friskt og rent vann kvelden før.
- La fisken gyte neste morgen (ca. kl. 08.30) under regelmessig lysstimulering i laboratoriet. Etter 1-2 timer, overfør fisken til en annen tank.
- Samle embryoer i vann fra det automatiske sykkelsystemet som oppdrettsmedium i en kulturskål ved hjelp av en engangs Pasteur-pipette.
2. Generering av GF sebrafisk fra embryoer til larver
MERK: Prosedyren for generering av bakteriefri (GF) fisk er skissert i figur 1, mens de grunnleggende utviklingsindeksene for konvensjonelle (CR) og GF-modeller er presentert i tilleggsfigur 1. Følg trinnene som er beskrevet nedenfor i et stasjonært biologisk sikkerhetsskap eller avtrekk med laminær luftstrøm, ved hjelp av en steril aseptisk teknikk i et rent rom.
- Vask embryoene ved hjelp av fiskekulturen, vann og fjern avføring, urenheter og døde eller ubefruktede egg.
- Overfør embryoene ved 2 hpf til steriliserte plater (opptil 480 embryoer per steril tallerken med en diameter på 10 cm) fylt med antibiotika bakteriefritt sebrafiskmedium (AB-GZM, se materialtabell) løsning og kultur ved 28,5 ° C i 6-8 timer.
MERK: AB-GZM brukes til å behandle embryoene i flere timer for å eliminere overflatemikroorganismer, og GZM uten antibiotika brukes til å dyrke GF-fisk i subsekvens. Vanligvis er den perfeksjonerte kulturtiden 6 timer). - Ekskluder egg med hvite flekker eller hvitt utseende, og velg de som normalt er utviklet, og vis gjennomsiktige og intakte konvolutter for videre behandling.
- Skyll embryoene med AB-GZM tre ganger innen 10 minutter.
- Bløtlegg embryoene i 0,2 g / l povidon-jodoppløsning (PVP-I) i 1 min (se materialtabell).
MERK: Høyere konsentrasjon og lengre enn 2 minutter vil påvirke embryoens død og klekkehastighet. - Vask embryoene med bakteriefritt sebrafiskmedium (GZM) tre ganger innen 10 minutter.
- Tilsett embryoer i natriumhypokloritt (NaClO) arbeidsløsning, tett dekke 50 ml mikrosentrifugerør og blekemiddel i 15 minutter. I løpet av denne perioden suspenderer embryoene i blekemiddeloppløsning ved å riste dem forsiktig.
- Vask embryoene med GZM tre ganger innen 10 minutter.
- Overfør embryoene til sterile 6-brønnsplater med 5 embryoer og 10 ml GZM per brønn. Dyrk dem i en ultra-ren plattform eller inkubator med en fotoperiode med mørke: lys = 10 timer: 14 timer ved 28 ° C ± 0,5 ° C.Kulturtettheten vil påvirke sterilhastigheten.
- Forny dyrkningsmediet daglig ved å fjerne den brukte GZM, samle den som prøver for steril statusdeteksjon, og etterfylle hver brønn med samme volum steril GZM.
- Registrer de grunnleggende utviklingsindeksene for GF-embryoer / larver, inkludert overlevelsesrate, klekkefrekvens, hjerteslag, kroppslengde og vekt, etc19.
- Overfør GF-fisken til egnede beholdere (tallerkener, cellekulturflasker eller glassflasker med deksler) med utvidet volum, og gi steril mat gjennom hele vekstprosessen.
3. Vedlikehold av GF sebrafisk fra larver til ungfisk
- Forny GZM uten fôring før 7 dpf og pådag de sterile tilstandene daglig (se trinn 5).
- Fôr sebrafisklarver fra 8 dpf til yngelstadier med steril eggeplomme (10 μL tilberedt stamløsning per brønn) én gang daglig før GZM skiftes.
- Fôr GF-yngel fra 14 dpf med sterilisert eggeplomme blandet med GF Artemia sp. en gang daglig (1-3 Artemia/larver, se steg 4), og øker gradvis matmassen med vekst og utvikling av GF-fisk.
- Gi eggeplomme til all fisk kan konsumere Artemia nauplii.
MERK: GF Artemia bør gjennomgå sterilitetstesting før bruk. Vurder antall Artemia nauplii igjen, observer forfølgelse og fange fremgang, og undersøk fiskekroppen med konsumert mat for å indikere fôringssuksess. - Fra 28 dpf til tidlig voksen stadier, mate GF Artemia en gang daglig (3-5 Artemia / larver) og rengjør uutnyttede eller døde Artemia, og død fisk i avfallet GZM som daglige prøver.
- Under GF fiskevekst, bytt 6-brønnplatene etter 7 dpf til sterile plater eller cellekulturflasker fra 8 til 21 dpf, og deretter til sterile flasker etter 21 dpf. Øk kulturmedium og matmasse i henhold til antall og vekt av GF-fisk i hver beholder.
- Forny GZM daglig og sjekk prøver for å sikre suksess for GF-modeller.
MERK: Å opprettholde bakteriefrie (GF) fiskemodeller til tidlig voksen alder og seksuell modenhet er utfordrende, med en lav gjennomsnittlig overlevelsesrate på 30 dpf, vanligvis mindre enn 10%. Dette tilskrives hovedsakelig svak immunitet, forsinket utvikling og nedsatt tarmfunksjon.
4. Tilberedning av GF Artemia nauplii som steril mat for kroniske GF-fiskemodeller
MERK: Dyrkings- og prepareringsmetoden for bakteriefri (GF) Artemia er skissert i figur 2. Merk at alle de følgende trinnene utføres i et stasjonært biologisk sikkerhetskabinett ved hjelp av en steril aseptisk teknikk.
- Skyll 0,25 g Artemia-cyster med 2,4 g/l natriumhypokloritt (NaClO, se materialfortegnelse) i 5 minutter.
- Filtrer de skyllede Artemia-cystene med et sterilisert ultratett filter (ca. 170 masker i blenderåpning) og vask med sterilisert ultrarent vann tre ganger, hver gang i 1-2 minutter.
- Overfør de vasket Artemia-cystene til 100 ml 2,5% sterilisert saltvann, bland og pakk for aseptisk klekking i henhold til trinnene nevnt nedenfor.
- Pakk den 50 ml behandlede Artemia cyster blandingsoppløsningen i en steril flaske med et volum på 100 ml, forsegle den med film, og inkuber i en ristende inkubator ved 150 rpm, 30 ° C i 18 timer til 24 timer med lys.
- Trekk ut ca. 30 ml klekking av Artemia nauplii fra midtre og nedre lag ved hjelp av en engangs Pasteur-pipette.
MERK: Unngå at flytende egg og tomme skall når det øvre laget. Indeksene for bakteriefrie (GF) artemiacyster og nauplier inkubert i 24 timer er presentert i figur 3. - Filtrer Artemia med et steriliseringsfilter og vask dem i et steriliseringsbeger med sterilisering av ultrarent vann tre ganger, ca. 30 s til 1 min for hver gang. Til slutt tilsettes 4 ml sterilisert ultrarent vann for å forberede Artemia-blandingsløsningen .
- Bruk en engangs Pasteur-pipette, hent aktivt svømmende Artemia fra det øvre laget, vask og klargjør nauplii-løsningen for fôring og aseptisk identifikasjon.
5. Identifisering av GF-fiskemodeller i hele livsstadier
MERK: Gjennom hele livsstadiene til bakteriefri (GF) fisk er nøkkelindekser og daglige prøvepåvisninger avgjørende for å sikre suksess for modellene. Dette trinnet oppsummerer den vanlige klassifiseringen av prøver og de vanlige metodene for identifikasjon (figur 4).
- Observer og tell overlevelsesstatus og rate av GF sebrafisk larver daglig. I eksperimenter som beregner relaterte hastigheter, blir GF-fisk dyrket i 24- eller 48-brønnsplater med en fisk per brønn.
- Overlevelsesrate = (antall levende fisk på observasjonstidspunktet / totalt antall egg) × 100%.
- Sterilitetsgrad = (antall sterile fisk/antall overlevende fisk) × 100%.
MERK: Denne protokollen fokuserer på den sterile hastigheten til levende fisk. Antall steril fisk bestemmes ved å telle vellykket GF-fisk etter flere kontroller blant de levende fiskene. Eventuelle døde fisk eller levende fisk GF-modeller som har mislyktes på grunn av bakteriell tilstedeværelse, elimineres under påfølgende GF-prosedyrer.
- Samle følgende prøver av GF sebrafisk larver.
- Kulturmedium av GF sebrafisk fra hver brønn eller flaskebeholder.
- Fiskemat, som steril eggeplomme og GF Artemia.
- Avfallsmedium, inkludert fragmenter av eggmembran etter klekking og matrester eller avføring i fôringsperiodene fra larver til ungfisk.
- Døde fiskeprøver for å identifisere tilstedeværelse av bakterier.
- Fiskemedium og midler brukt i embryobehandling som steril kontroll.
- Prøver fra materialer, driftsplattform og inkubator, etc.
- Oppdag prøver samlet daglig ved hjelp av flere metoder.
- Bruk først spredningsplatemetoden og dyrkningsplater i en inkubator ved 30 °C.
- Strøk med 20-50 μL avfallsmiddelprøve på Trypticase Soy Agar (TSA)-platen (se materialfortegnelse) under aerobe forhold.
- Frakk med 20-50 μL avfallsmediumprøve på TSA-platen under anaerobe forhold.
- Strøk med 20-50 μL avfallsmiddelprøve på TSA-platene i blodet (se materialfortegnelse) under aerobe forhold.
- Frakk med 20-50 μL avfallsmediumprøve på blodets TSA-plater under anaerobe forhold.
- For det andre, bruk væskekulturmetoden.
- Ta 200 μL prøve i aerobe rør med Brain Heart Infusion Broth (BHI) medium (se materialtabell) og kultur i risteinkubatoren ved 30 °C, 150-180 rpm.
- Tilsett 200 μL prøve i anaerobe rør med BHI-medium og kultur i inkubatoren ved 30 °C.
- Tilsett 200 μL prøve i aerobe rør med Trypticase Soy Broth (TSB) medium, deretter kultur i ristende inkubator ved 30 ° C, 150-180 rpm.
- Tilsett 200 μL prøve i anaerobe rør med TSB-medium og kultur i inkubatoren ved 30 °C.
- For det tredje, bruk molekylære teknikker-16s polymerasekjedereaksjon (PCR) analyse.
- Analyser avløpsvannprøven med to par primere 27F og 1492R, samt 63F og 1387R (tabell 1).
MERK: PCR-masterblandingen ble fremstilt i henhold til tabell 2 ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig DNA-polymerasesett (se materialtabell), og PCR-maskinen ble satt opp med programmet spesifisert i tabell 3. - Etter at PCR-programmet er fullført, undersøk produktene med 1% agarosegelelektroforese40 ved målbånd på 1465 bp (ved bruk av primere 27F og 1492R) eller 1324 bp (ved bruk av primere 63F og 1387R) for å utlede steriliteten til prøvene.
- Analyser avløpsvannprøven med to par primere 27F og 1492R, samt 63F og 1387R (tabell 1).
- Bruk først spredningsplatemetoden og dyrkningsplater i en inkubator ved 30 °C.
- Ta opp og observer sterilitetstester, inkludert plate- og mediumkultur fra 24 timer til 3 dager og 7 dager, hvor ingen koloni på plater og ingen turbiditet i væske indikerer vellykket konstruksjon av GF-modeller. Observer og registrer platen og mediet ved 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer, 120 timer, 144 timer og 168 timer.
6. Identifisering av GF Artemia-prøver før fôring på GF-fisk
MERK: For å oppdage GF Artemia-prøvene , som er uunnværlige som levende mat før fôring på GF-fisk (figur 4), følg trinnene nedenfor.
- Samle prøver av GF Artemia-modeller .
- Ubehandlede Artemia cyster.
- Behandlet GF Artemia cyster.
- Klekket GF Artemia nauplii.
- Sterilisert ultrarent vann som en kontroll.
- Oppdag GF Artemia med følgende metoder.
- Bruk spredningsplatemetoden til å oppdage prøvene ved å belegge dem på TSA-plater og TSA-plater i blodet under aerobe og anaerobe forhold. Inkuber dem ved 30 °C.
- Bruk et flytende medium for å oppdage prøvene i aerobe og anaerobe TSB- og BHI-rør. Kultur i en shaker ved 150-180 o / min, 30 ° C.
- Bruk PCR-analyse for å oppdage tilstedeværelsen av bakterier i prøvene samlet inn ved hjelp av 16s ribosomale RNA-målgener primere 27F og 1492R, 63F og 1387R (tabell 1). Volum og program er vist i tabell 2 og tabell 3.
- Registrer resultatene: Oppdag PCR-produktet med 1% agarosegelelektroforese40 for målbånd som måler 1465 bp (ved bruk av primere 27F og 1492R) eller 1324 bp (ved bruk av primere 63F og 1387R). Resultatene av plater og flytende medium kan sikre steril status for GF Artemia før de brukes som GF fiskemat.
7. Isolering og identifisering av intestinale bakteriestammer fra sebrafisk
MERK: For å utforske tarmfunksjoner in vitro og in vivo, er det nødvendig å isolere bakteriestammer fra sebrafisk, som også gir artskilden for potensielle probiotika screenet ved infeksjon ved bruk av GF-dyr (figur 5). I denne protokollen beskriver vi den tradisjonelle disseksjonsmetoden for å oppnå tarminnhold, mens prøvene også kan samles direkte fra levende bedøvet fisk (data ikke vist).
- Velg sunn voksen sebrafisk og vask dem med sterilt vann. Utfør følgende trinn i den rene benken.
- Bedøv fisken med 100 mg/L MS-222 i 5-10 min.
- Bruk 75% alkohol for å behandle fiskens kroppsoverflate.
- Dissekere fisketarmene og ekstrudere tarminnholdet med TSB eller BHI medium.
- Inkuber tarmsupernatanten ved å påføre TSA, blodplate, TSB og BHI-medium under aerobe og anaerobe forhold.
- Oversett bakteriene for å få signalstammen og registrere egenskapene til forskjellige kolonier.
- Oppbevar bakteriene innen 30% glyserol ved -80 °C.
- Deretter identifiserer du tarmbakteriene ved genomisk DNA-ekstraksjon og PCR-sekvensering.
MERK: Hovedtrinnene i bakteriell genomisk DNA-ekstraksjon inkluderer flytende sentrifugering, RNase A og Protease K-dissosiasjon, etylalkoholekstraksjon, skylling og oppløsning ved bruk av kommersielt tilgjengelige sett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse). - Analyser 16S-sekvensene ved hjelp av National Center for Biotechnology Information (NCBI) og Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) med bakterie- og arkeadatabasen40,41 (se materialfortegnelse).
- Velg de best matchede bakteriene og tegnene for å identifisere de isolerte tarmstammene på slektsnivå.
- Oppdag de metabolske funksjonene til bakteriestammer ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett (se materialfortegnelse).
8. Influensamerking, infeksjon og kolonisering av bakterier i GF sebrafisktarmer
MERK: Før de infiserte GF-sebrafisk, ble de isolerte bakteriene modifisert med fargestoffer og telt, noe som gjorde mikrobiell kolonisering og migrasjon synlig kontinuerlig og in vivo (figur 6).
- Velg potensielle gunstige bakterier eller dominerende stammer med høy overflod i verten for å infisere GF-fiskemodellene.
MERK: Bakteriene som ble brukt i denne studien var Aeromonas sp. og Vibrio sp. (se materialfortegnelse), valgt fra de 8 slektene som ble isolert og identifisert fra voksen villtype sebrafisk i laboratoriet42. - Merk de friske bakteriene med CM-Dil-fargestoffer (se materialtabell) og utsett dem for GF sebrafisk ved 5 dpf med en konsentrasjon på 106-10 8 kolonidannende enheter (CFU) / ml.
- Observer fluorescensen under fluorescerende mikroskop med 3× forstørrelse for å indikere kolonisering og fordeling av bakterier i tarmen til GF sebrafisklarver fra 6 dpf og 14 dpf.
- Tell antall bakterier i GF fisk manuelt etter platekultur på hvert tidspunkt.
- Oppdag koloniene og sekvensene for å sikre at infeksjonen var vellykket med målbakteriestammene.
- Samle prøver av GF-fisk med bakteriell infeksjon for påfølgende analyser, inkludert nevroadferd, utviklingsindekser, histopatologisk analyse og hormonmålinger, etc 43,44,45.
MERK: Bakteriene som brukes i infeksjonsforsøket skal være nylig gjenopprettet og nydyrket av det flytende mediet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GF-sebrafiskmodellene kan effektivt produseres ved å utnytte de rike eggene som gytes av par sebrafisk, med protokollen optimalisert basert på tidligere GF-fiskemodeller35. En enkelt 6-brønns plate kan dyrke omtrent 30-48 embryoer / larver, noe som muliggjør rikelig datainnsamling og statistisk analyse. Etter steril behandling dyrkes GF-embryoene i en ren inkubator til klekking til larver ved 48-72 timer, og endres GZM daglig med påvisning av innsamlede prøver, noe som er avgjørende for å opprettholde den bakteriefrie tilstanden (figur 1). Etter 7 dpf bør maten av eggeplomme og levende Artemia være forberedt på larver til juvenile stadier. Under vekst og utvikling av fisk bør volum, beholder og tetthet av GZM reguleres eller endres i tide for å unngå død og svikt i steril status. Hvis deteksjonen ikke viser bakteriell forurensning, kan de vellykkede GF-modellene opprettholdes som kroniske fra ungdom til tidlig voksen alder, men overlevelsesraten er mye lavere i praksis. Til slutt kan sterilfrekvensen, overlevelsesraten, utviklingsindeksen, atferden, histopatologisk analyse og transkripsjonsprofilen til GF- og CR-fiskemodeller måles for å utforske påvirkning av mikrobiota og stoffskjermfelt. I denne studien ble de viktigste utviklingsindeksene sammenlignet (tilleggsfigur 1), og klekkefrekvensen av GF-fisk var 45,7% lavere enn CR-fisk, med 60% ved 72 hpf. Hjertefrekvensen til GF-larver ved 7 dpf var signifikant lavere ved 18,2 slag/10 s sammenlignet med CR-fisk med 22,6 slag/10 s, men det var ingen forskjell mellom de to gruppene ved 14 dpf med frekvenser på 23,5-23,8 slag/10 s. Overlevelsesraten for GF-fisk ved 7 dpf var den samme som for CR-fisk på 86,7%, men sank til 60% ved 14 dpf sammenlignet med 80% for CR-fisk. Imidlertid ble overlevelsesraten for både GF og CR fisk redusert til 25% -10% etter munnåpningsperioden da de oppnådde fôringsevner eller vaner. Manglende opprettholdelse av steril status hos fisk var en av årsakene til lavere overlevelse. Derfor er fôring og vedlikehold av næringsstoffer fra ungfisk til tidlig voksen alder kritiske utfordringer i fiskekultur.
En annen viktig faktor som påvirker vekst og utvikling av fisk er fôring. I denne studien undersøker vi flere metoder for å få GF Artemia som levende mat for langsiktige GF sebrafisklarver til ungfisk og voksne (prosess vist i figur 2). På grunn av den daglige bruken av mat til GF-fisk, bør den optimaliserte protokollen for GF Artemia være enkel, tidsbesparende og økonomisk i praksis. Etter å ha sammenlignet den aktive bevegelsen og død / immobilitet av nauplii observert av mikroskopet, egenskaper av nauplii, uklekkede egg og skall, blir metoden perfeksjonert. Etter daglig inkubasjon ble indeksene for fersk GF Artemia oppnådd fra flasker, inkludert klekking, overlevelse og deformitetsrate, og lengden og vekten av nauplii, observert og målt under mikroskopet (figur 3). Etter behandling var klekkefrekvensen av Artemia-cyster høy, med et gjennomsnitt på 88,15%, overlevelsen av svømmende nauplii var 77,83%, og misdannelsesraten var 1,87%. Kroppslengden på nauplii var 546,70 μm, og kroppsvektsindeksen var 3,80 mg/100, som egner seg for fangst og fôring av fisk fra larvenes månedsåpne periode til ung- og voksenstadier.
Deteksjon av GF-fisk og GF Artemia er også viktig for modellvedlikehold. Ifølge prøveinnsamling og flere testmetoder kan resultatene gi suksess for behandlede sebrafiskembryoer og Artemia-cyster i dyrket plate og væskemedium (figur 4). De forskjellige prøvene som samles inn daglig, skal detekteres som sterile i alle testmetoder, som deretter kan indikere GF-modellene på innsamlingstidspunktet. GF Artemia bør oppdages før fôring på GF-fisk, eller plate- og mediuminkubatorresultatene skal referere til den sterile tilstanden til fersk levende nauplii. Det vil si dyrke GF Artemia fra cyster på TSA-plater eller TSB eller BHI flytende medium glass i ristinkubasjon, som kan brukes til å generere GF Artemia og steril verifisering samtidig. GF Artemia-protokollen kan imøtekomme et begrenset antall larver til fôring. Under fôringsprosessen var det tydelig at GF Artemia svømte i GZM og deretter ble fanget og konsumert av GF fiskelarver.
Anvendelsene av GF-fiskemodeller involverer ulike felt innen biologi og medisin, noe som gjør det mulig å undersøke mikrobielle funksjoner, vekst og utvikling, sykdomsmekanismer og probiotisk eller medikamentell screening, blant annet46. I denne studien ble for eksempel to store tarmbakterier, Aeromonas sp. og Vibrio sp., isolert fra sebrafisk. Kolonikarakteristika og identifikasjon ble utført, og multiple metabolske funksjoner ble målt in vitro ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett (figur 5). Disse bakteriene ble isolert og identifisert med 16S-sekvensering, og eksplosjonsresultatene ble presentert i en tidligere rapport42. De identifiserte bakteriestammene muliggjør vitenskapelig forskning på virkningen av en enkelt eller kombinert mikrobiota på vertshelsen ved å infisere GF-fiskemodellene. Gjennomsiktigheten av fiskelarver tillater observasjon av fluorescensmerkede bakterieceller ved bruk av CM-Dil-fargestoffer, som avslører kolonisering og distribusjon i tarmene til GF-fisk (vist i figur 6). Etter bakteriell infeksjon ved 5 dpf kan GF-sebrafisklarver avbildes med fluorescensmikroskop og kontinuerlig observeres fra 6 til 14 dpf, noe som gir innsikt i mikrobielle funksjoner kombinert med utviklingsindekser, histopatologiske endringer og molekylære endringer47.
Figur 1: Protokoll for GF sebrafisk fra embryoer til larver og ungdyr. Viktige trinn i genereringen av GF sebrafisk inkluderer: (1) Innsamling av embryoer fra villtype sebrafisk og plassering i AB-GZM. (2) Skyll behandlingen med PVP-I og NaClO-midler for å sikre fullstendig sterilitet. (3) Dyrkning av GF-embryoer/larver i 6-brønnsplater med GZM, som fornyer mediet daglig. (4) Regulering av kulturforhold for optimal vekst og utvikling. (5) Prøvetaking på ulike utviklingsstadier, etterfulgt av sterilitetstesting ved bruk av plate- og væskemediummetoder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Protokoll for GF Artemia-tilberedning som levende mat til GF-fisk. Viktige trinn inkluderer: (1) Skyll behandling av Artemia cyster for fullstendig sterilitet. (2) Fremstilling av GF-cyster i mediet. (3) Inkubasjon i en saltløsning i 24 timer for å fremme klekking. (4) Filtrering av mislykket klekking og tomme egg for å samle aktive nauplii. (5) Vask innsamlet nauplii for å fjerne rusk, og sikre høy kvalitet og forurensningsfri levende mat. (6) Sterilitetstesting av GF Artemia før fôring til GF fiskelarver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Indekser av GF Artemia cyster og nauplii inkubert i 24 timer. (A) Ubehandlet Artemia cyster med urenhetsfilm (skala bar: 500 μm). (B) Behandlede Artemia-cyster med en svakt konveks overflate etter vannabsorpsjon og et renere utseende (skalastang: 500 μm). (C) Mikroskopisk undersøkelse av fersk inkubert levende GF Artemia nauplii (skala bar: 2000 μm) og (D) forstørrelse med en skala bar på 1000 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Steril påvisning av GF-fisk i hvert livsstadium og GF Artemia. (A) Sterile tester av CR- og GF-fiskeprøver ved bruk av TSB og BHI flytende medium, TSA og blodplater under aerobe og anaerobe forhold. (B) Sterile tester av ubehandlede Artemia-cyster , GF Artemia-cyster og nauplier ved bruk av TSB og BHI flytende medium, TSA og blodplater under aerobe og anaerobe forhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Isolering og identifisering av tarmbakterier hos sebrafisk. (A) Bakteriestammer, karakteristika ved kolonier, 16S sekvenseringskart (eksempler: Aeromonas sp. og Vibrio sp.). (B) Slekt og NCBI-tiltredelse. (C) Metabolske funksjoner av bakterier isolert fra sebrafiskens tarm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Infeksjon og kolonisering av tarmbakteriestammer i GF sebrafisk. (A) Gjenoppretting av isolerte og identifiserte bakteriestammer for infeksjonseksperimenter. (B) Merking av bakterier med fluorescerende fargestoffer og infeksjon av GF sebrafisk larver ved 5 dpf. Forstørrelse: 1x. (C) Observasjon av distribusjon og kolonisering av bakterier (Vibrio sp.) i tarmvev in vivo. Forstørrelse: 3x. (D) Telling av CFU av bakterier (Aeromonas sp. og Vibrio sp.) i hver fiskelarve ved daglig prøvetaking. Data presenterer betyr ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Primere | Sekvenser (5'-3') | Produktets lengde |
| 27F | AGAGTTTGATCMTGGCTCAG | 1465 bp |
| 1492R | ACGGYTACCTTGTTACGACTT | |
| 63F | CAGGCCTAACACATGCAAGTC | 1324 bp |
| 1387R | GGGCGGWGTGTACAAGGC |
Tabell 1: Primere brukt til bakteriedeteksjon.
| Komponenter | Enheter | Volum (μL) |
| Taq DNA-polymerase | 2,5 U/μL | 0.1 |
| 10× Buffer (Mg2+) | --- | 2.1 |
| dNTP-blanding | 2,5 mM | 1.6 |
| Primer 27F | 10 μM | 1 |
| Primer 1492R | 10 μM | 1 |
| DNA/RNA fri H2O | --- | 13.2 |
| Mal DNA | --- | 1 |
| Totalt volum | --- | 20 |
Tabell 2: Endelig konsentrasjon og volum av komponenter per reaksjon.
| Skritt | Temperatur | Tid | Sykluser |
| Første denaturering | 95 °C | 4 min | -- |
| Denaturering | 94 °C | 1 min | 35 |
| Annealing | 55 °C | 1 min | |
| Forlengelse | 72 °C | 1 min | |
| Endelig forlengelse | 72 °C | 10 min | -- |
| Holde | 4 °C | ∞ | -- |
Tabell 3: PCR-program for amplifisering av 16S rRNA-genet.
Tilleggsfigur 1: De kritiske utviklingsindeksene til GF- og CR-sebrafiskmodeller. (A) Klekkehastigheten for CR og GF sebrafisk ved 72 hpf, og (B) hjerteslag / 10 s av CR og GF fisk ved 7 dpf og 14 dpf. Overlevelsesraten (%) for CR- og GF-fisk gikk ned fra 7 dager og 14 dager med 86%, 60%-80% til 10%-25% ved 30 dpf. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn innenfor protokollene for GF fisk og GF matlaging
Under genereringen av GF-fiskemodeller var flere kritiske trinn involvert, inkludert fremstilling av sterile materialer, sterilisering av embryoer, daglig fornyelse av GZM, innsamling av forskjellige prøver og steril undersøkelse av hver prøve ved hjelp av flere metoder. Blant disse trinnene er den første behandlingen av embryoer grunnleggende og avgjørende for suksessen til GF-modellene. Kontrollmidler, deres konsentrasjoner og behandlingstider er avgjørende for å oppnå optimale steriliseringshastigheter og klekkesuksess. Nøye oppmerksomhet er nødvendig ved håndtering av GF-fiskeembryoer til larver, som involverer daglige mediumendringer og sikrer at materialer og plattformer steriliseres grundig ved hjelp av ultrafiolett lys eller autoklavering når plater fjernes fra inkubatoren. Overvåking av temperaturforhold og driftstid om vinteren er viktig for å forhindre larvedød forårsaket av lavere temperaturer i rene benker.
Steril eggeplomme og GF Artemia bør påvises før de fôres til fisk etter 7 dpf for å sikre steril tilstand for langsiktige GF-modeller. I fôringsperioden er rengjøring av matrester viktig som en del av prøvene som samles inn for påvisning ved fornyelse av avfallsmediet. Beholderen, volumet av GZM og matmassen bør justeres sammen med vekst- og utviklingsstadiene for å forhindre tap av GF-fisk på grunn av begrensede omgivelser og vannkvalitetsproblemer. Regelmessig overvåking og justeringer i disse parameterne bidrar til vellykket vedlikehold av GF fiskemodeller.
Modifikasjoner og betydningen av disse protokollene
Den forenklede tretrinnsprosessen for generering av GF-sebrafiskembryoer, som involverer optimaliserte midler, konsentrasjoner og eksponeringstider for AB-GZM-, PVP-I- og NaClO-løsninger, sikrer en høy steril hastighet og sunn utvikling av modeller. I tillegg har de sterile deteksjonsmetodene for daglige prøver blitt perfeksjonert for å inkludere plater og flytende mediumkulturer under aerobe og anaerobe forhold, sammen med molekylære teknikker ved bruk av vanlige bakterielle primere. Videre erfaringer med testing for bakterielle og soppforurensninger tar sikte på å optimalisere isolatorforurensninger og steril testing under GF dyreteknikker48.
Den spesifikke protokollen for GF Artemia nauplii som levende mat til fiskemodeller har blitt undersøkt i vår studie, og et patent ble gitt til PPJ og DSP av China National Intellectual Property Administration (nr. ZL202210482684.8). Langsiktige GF-fiskemodeller er konsekvent begrenset av utilstrekkelig og uegnet ernæring, noe som forverrer svakheter i tarmfunksjoner relatert til fordøyelse og absorpsjon. Som en troverdig matkilde for medaka- og sebrafiskmodeller i forskjellige livsstadier, bør GF Artemia sp. være enkel å tilberede med en enkel prosedyre, kort inkubasjonstid og sanntids steril deteksjon for daglig bruk. I denne metoden skylles normale Artemia-cyster i en tilstrekkelig konsentrasjon av NaClO til å være aseptisk og inkuberes deretter i en filmbelagt flaske, så vel som på en plate og i et flytende medium for deteksjon. Dette støtter nyklekking nauplii for GF fiskefôring. Den sterile hastigheten og klekkehastigheten til Artemia, samt kroppslengden, vekten og aktiviteten til, er utmerket, noe som indikerer tilgjengelige applikasjoner i praksis.
Betydningen av disse modifikasjonene i GF fisk og GF matprotokoller fordeler forskere i å generere modeller på embryoer, larver, juvenile stadier, og til og med tidlige voksne og voksne stadier i marine og ferskvannsmodus. Langsiktige GF-dyr vil gi tillatelse som in vivo-modeller i forskning på legemiddelscreening og mikrobielle funksjoner under vertsvekst og utvikling, spesielt i modenhet av immunitet og relaterte tarmcellelinjer. For eksempel har sebrafisklarver bare medfødt immunitet i den første uken, og utvikler deretter det adaptive immunitetssystemet under 7-21 dpf, sammen med tymusmodenhet31,49. Videre kan GF fiskemodeller gi muligheten til å analysere bakterie-bakterier og mikrobiota-vert interaksjoner med levende observasjon av dynamiske koloniserings- og migrasjonsprosesser i organismer 50,51.
Begrensninger av metoden
Dyrking av GF-fisk fra ungfisk til tidlige voksne (28 dpf-2.5 mpf) og seksuelt modne voksne (>2.5 mpf) er fortsatt utfordrende på grunn av økt dødelighet og risikoen for bakteriell forurensning under modellvedlikehold. Disse begrensningene skyldes først og fremst fraværet av egnede autokultursystemer for fisk som lever i et GF-miljø. Disse systemene bør omfatte ren luft, vann og et matsystem for effektivt å opprettholde dyrene og deres miljøer, og sikre fullstendig isolasjon fra eksterne mikroorganismer. I motsetning til andre GF dyremodeller som mus og kyllinger52, er det utfordrende å skaffe GF sebrafisk gjennom anatomiske operasjoner fra CR-foreldrene på grunn av deres vannvaner og naturlige befruktningsstil.
Å behandle voksne dyr som helt blottet for intestinal mikrobiota er også utfordrende. Selv om antibiotikabehandling kan indusere en tilstand som ligner på spesifikke patogenfrie (SPF) dyr, karakterisert ved en redusert mikrobiota oppdaget i fekale prøver, er det fortsatt vanskelig å oppnå ekte GF-voksenfiskmodeller. Utfordringene med å etablere og vedlikeholde GF-modeller, spesielt under overgangen fra ungdom til langsiktige tilstander, er betydelige. Betydningen av GF-avkom, som GF F1 eller F2 egg fra voksen GF-fisk, i mikrobiell forskning er anerkjent. Å overvinne utfordringer med å etablere og vedlikeholde langsiktige voksne GF-fiskemodeller krever imidlertid betydelig tid.
Det er verdt å merke seg at gnotobiotisk sebrafisk med spesifikk bakteriell kolonisering er utviklet, som viser kronisk overlevelse basert på GF-modeller. Likevel er det fortsatt usikkert om disse modellene kan tjene som levedyktige alternativer til GF-modeller innen bakteriell infeksjon og biomedisinsk forskning.
Fremtidige anvendelser av GF fiskemodeller
I denne studien har vi raffinert protokollen for å generere GF sebrafiskmodeller, som går fra embryoer til ungfisk. Denne fremgangen har betydelige anvendelser innen utviklingsbiologi, immunologi, menneskelig sykdomsforskning og organogenese. Gjennom masseisolering og identifikasjon utforsker studien funksjonene, mekanismene og tarmavledede metabolitter av enkelte bakteriestammer. Undersøkelsen innebærer å infisere GF sebrafiskmodeller etter at ventilen åpner trinn47,53. I tillegg letter merkede bakterier med fluorescens observasjonen av kolonisering og distribusjon i levende GF-larver, fri for andre mikrobielle påvirkninger54. Lignende GF-fiskemodeller, som marine eller ferskvannsmedaka, kan opprettes ved hjelp av sammenlignbare metoder med forskjellige midler eller middels endringer.
For å undersøke menneskelige sykdomsmekanismer bruker studien FMT-metoder, overføring av prøver fra pasienter eller donorer til friske dyr eller GF-modeller55. I motsetning til konvensjonelt oppdrettede (CR) dyr, gir GF-modeller robust bevis på mikrobielle funksjoner, påvirkninger eller responser i verten, spesielt når de kombineres med bakteriofager for å regulere målbakterier i mikrobiota46.
Oppsummert tjener GF sebrafisk som kraftige modeller for å vurdere bakteriell sikkerhet, legemiddeleffektivitet, toksisitet av forurensende stoffer eller sammensatt interferens på grunn av deres følsomme og rene tarmmiljø. Fremtidig utforskning av GF-fiskeapplikasjoner bør omfatte ulike felt, med behov for å lage voksne GF-fiskemodeller for en dypere forståelse av mikrobielle funksjoner på tvers av ulike livsstadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Protokollen til GF Artemia har blitt gitt som et patent av China National Intellectual Property Administration, som vil avlaste den begrensede bruken av metoden etter å ha fått tillatelse fra forfatterne. Forfatterne erklærer at de ikke har andre konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker oppriktig støtten fra Chongqing Medical University Talent Project (nr. R4014 til DSP og R4020 til PPJ), National Natural Science Foundation of China (NSFC, No.32200386 til PPJ), Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP), og Program for Kina-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration av Chinese Academy of Sciences (CAS) / Kina-Sri Lanka Joint Center for utdanning og forskning ved CAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB-GZM | Amphotericin:Solarbio; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. | Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313. |
49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL). |
| 1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes | biosharp | BS-15-M | To collect samples, and hold agents |
| 2.4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution. |
| 6-well plates, 24-, 48- well plates | LABSELECT | 11112 | To culture fish |
| Aeronomas | NCBI database | No.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
| Anaerobic TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system. |
| Anaerobic work station | GENE SCIENCE | E200G | Bacterial isolation, sterile testing |
| Analysis | GraphPad Prism 5 | v6.07 | To analysis the data |
| API 20 E kits | BioMerieux SA, France | No.1005915090 | Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism |
| Artemia (Brine shrimp) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | Aquamaster brand | Artemia cysts, and brine shrimp eggs |
| Auto cycle system for fish culture | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Maintain the fish |
| Autoclave | Zeal Way | G154DWS | Prepare the materials |
| BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder. |
| BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Biochemical incubator | LongYue Co., Ltd | SPX | For fish and plates |
| Biosafety cabinet | Haier | HR40-IIA2 | Sterile treatment and testing |
| Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water. |
| Blood plates | sheep blood:Solarbio | Cat. NO. TX0030 | Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates. |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | To culture fish |
| CM-Dil dyes | Molecular Probes | Cat#C7000 | To label the bacteria |
| Constant temperature shaking incubator | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Bacterial culture |
| Database | NCBI | Bacteria and Archaea database | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ |
| Disposable Pasteur pipette | biosharp | bs-xh-03l | Used to change water, and transfer eggs |
| Disposable petri dish | biosharp | BS-90-D | To culture fish |
| DNA kits | Solaribio | Cat#D1600 | Bacterial genomic DNA extraction kits |
| Electric pipette | SCILOGEX | Levo me | Change water |
| Exiguobacterium | NCBI database | No.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
| GZM | Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L. |
| Laboratory pure water system | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Prepare the agents |
| Microscope | Nikon | SMZ18 | With fluorescent light to observe fish larvae |
| PCR kits | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA Polymerase kit |
| Pipette | LABSELECT | sp-013-10 | Change water |
| Povidone iodine (PVP-I) | Aladdin | Lot#H1217005 | Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water. |
| Timing converter | PinYi Co., Ltd | AL-06 | To regulate the light |
| TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder. |
| TSB Aerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl. |
| TSB Anaerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Ultra-clean workbench | Airtech | SW-CJ-2FD | Sterile treatment and testing |
| Ultra-pure flow system for fish culture | Marine Biological Equipment company | No Cat | Produce water for fish |
| Vibrio | NCBI database | No.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
References
- Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118 (2021).
- Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbiol. 11 (4), 227-238 (2013).
- Kim, S., Jazwinski, S. M. The gut microbiota and healthy aging: A mini-review. Gerontology. 64 (6), 513-520 (2018).
- Milani, C., et al. The first microbial colonizers of the human gut: Composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota. Microbiol Mol Biol Rev. 81 (4), e00036 (2017).
- De Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: Mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Shi, N., Li, N., Duan, X., Niu, H. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system. Mil Med Res. 4 (1), 14 (2017).
- Liu, B. N., Liu, X. T., Liang, Z. H., Wang, J. H.
- Aron-Wisnewsky, J., Warmbrunn, M. V., Nieuwdorp, M., Clément, K. Metabolism and metabolic disorders and the microbiome: The intestinal microbiota associated with obesity, lipid metabolism, and metabolic health-pathophysiology and therapeutic strategies. Gastroenterology. 160 (2), 573-599 (2021).
- Chen, Y. W., Zhou, J. H., Wang, L. Role and mechanism of gut microbiota in human disease. Front Cell Infect Microbiol. 11, 625913 (2021).
- Hao, W. Z., Li, X. J., Zhang, P. W., Chen, J. X. A review of antibiotics, depression, and the gut microbiome. Psychiatry Res. 284, 112691 (2020).
- Nadal, A. L., et al. gut immunity: Using the zebrafish model to understand fish health. Front Immunol. 11, 114 (2020).
- Asadi, A., et al. Obesity and gut-microbiota-brain axis: A narrative review. J Clin Lab Anal. 36 (5), e24420 (2022).
- Mlynarska, E., et al. The role of the microbiome-brain-gut axis in the pathogenesis of depressive disorder. Nutrients. 14 (9), 1921 (2022).
- Yu, Y. J., Raka, F., Adeli, K. The role of the gut microbiota in lipid and lipoprotein metabolism. J Clin Med. 8 (12), 2227 (2019).
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. J Microbiol Biotechnol. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Melancon, E., et al. Best practices for germ-free derivation and gnotobiotic zebrafish husbandry. Methods Cell Biol. 138, 61-100 (2017).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods Mol Biol. 1438, 123-135 (2016).
- Wang, X. N., Wu, C. W., Wei, H. Humanized germ-free mice for investigating the intervention effect of commensal microbiome on cancer immunotherapy. Antioxid Redox Signal. 37 (16), 1291-1302 (2022).
- Jia, P. P., et al. Role of germ-free animal models in understanding interactions of gut microbiota to host and environmental health: A special reference to zebrafish. Environ Pollut. 279, 116925 (2021).
- Gootenberg, D. B., Turnbaugh, P. J. Companion animals symposium: Humanized animal models of the microbiome. J Anim Sci. 89 (5), 1531-1537 (2011).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Kamareddine, L., Najjar, H., Sohail, M. U., Abdulkader, H., Al-Asmakh, M. The microbiota and gut-related disorders: Insights from animal models. Cells. 9 (11), 2401 (2020).
- Rogala, A. R., Oka, A., Sartor, R. B. Strategies to dissect host-microbial immune interactions that determine mucosal homeostasis vs. Intestinal inflammation in gnotobiotic mice. Front Immunol. 11, 214 (2020).
- Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4596-4601 (2004).
- Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev Biol. 297 (2), 374-386 (2006).
- Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
- Xia, H., et al. Zebrafish: An efficient vertebrate model for understanding role of gut microbiota. Mol Med. 28 (1), 161 (2022).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: Staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat Protoc. 3 (12), 1862-1875 (2008).
- Shan, Y., et al. Immersion infection of germ-free zebrafish with listeria monocytogenes induces transient expression of innate immune response genes. Front Microbiol. 6, 373 (2015).
- Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. A. Zebrafish axenic larvae colonization with human intestinal microbiota. Zebrafish. 15 (2), 96-106 (2018).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
- Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
- Nascimento, M. D., Schorer, M., Dos Santos, J. C. E., Rocha, M. S. A., Pedreira, M. M. Live and frozen Artemia nauplii for catfish (steindachner, 1876) larvae in different salinities. Trop Anim Health Prod. 52 (2), 653-659 (2020).
- Jia, P. P., et al. Breaking the mold: The first report on germ-free adult marine medaka (oryzias melastigma) models. bioRxiv. , (2023).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. JoVE. (69), e4196 (2012).
- Wilson, C.
- Aleström, P. a-O., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C.
- Nursyirwani, N., et al. Phenotype and genotype of lactic acid bacteria (lab) isolated from the tiger grouper Epinephelus fuscoguttatus alimentary tract. F1000Res. 6, 1984 (2017).
- Karolenko, C., Desilva, U., Muriana, P. M. Microbial profiling of biltong processing using culture-dependent and culture-independent microbiome analysis. Foods. 12 (4), 844 (2023).
- Jia, P. P., et al. Chronic exposure to graphene oxide (go) induced inflammation and differentially disturbed the intestinal microbiota in zebrafish. Environ Sci Nano. 6 (8), 2452-2469 (2019).
- Sun, B. L., et al. Probiotic supplementation mitigates the developmental toxicity of perfluorobutanesulfonate in zebrafish larvae. Sci Total Environ. 799, 149458 (2021).
- Qian, H. F., Liu, G. F., Lu, T., Sun, L. W. Developmental neurotoxicity of microcystis aeruginosa in the early life stages of zebrafish. Ecotoxicol Environ Saf. 151, 35-41 (2018).
- Bertotto, L. B., Catron, T. R., Tal, T. Exploring interactions between xenobiotics, microbiota, and neurotoxicity in zebrafish. Neurotoxicology. 76, 235-244 (2020).
- Jia, P. P., et al. Bacteriophage-based techniques for elucidating the function of zebrafish gut microbiota. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (7-8), 2039-2059 (2023).
- Xin, G. Y., et al. Gut bacteria vibrio sp. And aeromonas sp. Trigger the expression levels of proinflammatory cytokine: First evidence from the germ-free zebrafish. Fish Shellfish Immunol. 106, 518-525 (2020).
- Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109 (2023).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, danio rerio: A gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Rolig, A. S., Parthasarathy, R., Burns, A. R., Bohannan, B. J. M., Guillemin, K. Individual members of the microbiota disproportionately modulate host innate immune responses. Cell Host Microbe. 18 (5), 613-620 (2015).
- Stressmann, F. A., et al. Mining zebrafish microbiota reveals key community-level resistance against fish pathogen infection. ISME J. 15 (3), 702-719 (2021).
- Guitton, E., et al. Production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies. JoVE. (160), e61148 (2020).
- Rea, V., Bell, I., Ball, T., Van Raay, T. Gut-derived metabolites influence neurodevelopmental gene expression and wnt signaling events in a germ-free zebrafish model. Microbiome. 10 (1), 132 (2022).
- Russo, P., et al. Zebrafish gut colonization by mcherry-labelled lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3479-3490 (2015).
- Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Ley, R. E., Gordon, J. I. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection. Cell. 127 (2), 423-433 (2006).
