Summary
该协议概述了获得无菌（GF）鱼胚胎并将其从幼虫维持到幼虫阶段的主要步骤，包括取样和检测其不育状态。使用GF模型处理感染对于理解微生物在宿主健康中的作用非常重要。
Abstract
斑马鱼因其与哺乳动物的基因组相似性、在相对干净的绒毛膜环境中发育的透明胚胎以及与啮齿动物模型相比幼虫发育极快，因此可以作为生长、免疫和肠道微生物群研究的宝贵模型。无菌（GF）斑马鱼（Danio rerio）对于评估污染物毒性和建立与微生物功能相关的类人疾病模型至关重要。与传统饲养（CR）模型（共同饲养的鱼类）相比，GF斑马鱼可以更准确地操纵宿主微生物群，有助于确定微生物与宿主之间的因果关系。因此，它们在促进我们对这些关系的理解方面发挥着关键作用。然而，由于免疫功能和营养吸收的限制，GF斑马鱼模型通常是在生命早期（从胚胎到幼虫）生成和研究的。本研究优化了早期GF斑马鱼模型的生成、维持和鉴定，无需摄食和长期使用GF食物（如 卤虫 、盐水虾）摄食。在整个过程中，每天进行采样和培养，并通过多次检测进行鉴定，包括平板和 16S rRNA 测序。记录GF斑马鱼的无菌率、存活率和发育指标，保证所生成模型的质量和数量。重要的是，这项研究提供了关于GF鱼的细菌分离和感染技术的详细信息，使得在GF食物支持下能够有效地创建从幼虫到幼鱼阶段的GF鱼模型。通过在生物医学研究中应用这些程序，科学家们可以更好地了解肠道细菌功能与宿主健康之间的关系。
Introduction
微生物群（即古细菌、细菌、真核菌和病毒）在维持宿主健康方面发挥着至关重要的作用，并通过在肠道屏障、上皮表面和个体粘蛋白功能内的共生相互作用影响生理和病理过程，从而促进各种疾病的发展 1,2,3.从婴儿期到少年期、成年期和衰老等不同生命阶段的微生物群组成，以及其在鼻孔、口腔、皮肤和肠道部位等不同部位的存在，是由不同的栖息地和环境动态塑造的4.生物体中的肠道菌群参与营养吸收、免疫反应、病原体入侵、代谢调节等 5,6.对患者的研究表明，肠道菌群的破坏与人类肥胖、睡眠障碍、抑郁症、炎症性肠病 （IBD）、神经退行性疾病（帕金森氏症、阿尔茨海默氏症）、衰老和各种癌症有关 7,8,9。此外，肠道微生物群和宿主之间的相互作用途径涉及炎症因子、神经递质、代谢物、肠道屏障和氧化应激，正如之前使用小鼠和鱼类模型的研究中观察到的那样10,11。
最近，在临床和动物模型中，已经探索了多种与细菌相关的方法或疗法，包括潜在的益生菌和粪便微生物群移植 （FMT），用于治疗这些疾病。这些探索基于与微生物群-肠-脑/肝/肾轴、微生物群衍生产物和受体活性改变相关的发现12,13。然而，由于微生物群落的复杂性和生成强大的类人疾病模型的挑战，微生物群-宿主系统的发育、各种功能和机制仍未完全理解和识别。
为了解决这些问题，无菌（GF）动物模型在19世纪中叶被紧急提出，并在20世纪主要发展起来。随后的改进，包括抗生素处理和gnotobiotic模型，以及微生物检测和观察技术的进步，进一步完善了这些模型14,15,16。GF动物通过消除自身背景和避免环境微生物而产生，为探索微生物与其宿主之间的相互作用提供了一种极好的策略17。通过应用动物模型和精细的方案，研究人员成功地复制了在GF小鼠和鱼类患者中发现的相似微生物组成。此外，其他GF动物模型，如狗、鸡和猪，作为研究对象提供了多样化的选择18,19,20,21。这种方法使人们能够研究共生微生物组对各种疾病的潜在治疗效果，包括人类癌症免疫疗法16,18。GF模型为特定细菌在宿主内定植、迁移、繁殖和相互作用的特征和机制提供了更准确的见解。这为微生物群相关疾病的发生和发展提供了重要的新见解22,23。GF斑马鱼在微生物研究中的建立和应用的历史从2004年Rawls等人的报告和2006年Bates等人的报告发展到2017年Melancon等人的方案16,24,25。然而，成年或繁殖GF模型的可行性仍然是一个漫长的过程，伴随着可变的寿命、成功率和健康挑战。
在各种动物模型中，斑马鱼（Danio rerio）因其与人体器官和基因组学的有利相似性、发育周期短、繁殖力高和胚胎透明等优点，成为基础和生物医学研究的重要工具19,26。斑马鱼作为可靠的人类疾病模型，提供了体内生理和病理过程的视觉表示，提供了对宿主-微生物相互作用的吸引人特征的见解。值得注意的是，斑马鱼表现出独特的细胞谱系，可以对肠道生理学、微生物动力学、性腺和生殖发育、宿主免疫系统的成熟、行为和新陈代谢进行成像27。斑马鱼胚胎在保护性绒毛膜内发育，直到孵化，在受精后 3 天 （dpf） 成为幼虫。它们在 5 dpf 时积极寻找食物，并在受精后 （mpf） 3 个月左右达到性成熟 28。Rawls 等人 24 报道的首次成功的无菌 （GF） 斑马鱼表明，在卵黄吸收后用高压灭菌饲料喂养的幼虫表现出 8 dpf 的组织坏死和 20 dpf 时的总死亡。这表明了饮食的影响或在涉及长期（>7 dpf）GF鱼的实验中考虑外源性营养供应的重要性29。随后的研究改进了GF鱼的生成方案，采用了在不同鱼类模型中完善的无菌食品和方法16。
然而，对 GF 斑马鱼模型的大多数研究都集中在早期生命阶段，涉及细菌感染在 5 dpf 下持续 24 小时至 48 小时，在实验结束时在 7 dpf 之前收集样本 25,30,31。人们普遍认为，包括人类和斑马鱼在内的生物体中的微生物群在生命开始时就被定植，并在生长和发育过程中形成。该成分在成虫阶段保持稳定，宿主体内微生物群的作用在整个生命过程中都至关重要，尤其是在衰老、神经退行性、代谢相关肥胖和肠道疾病方面3.因此，考虑到鱼类幼虫在早期生命中的免疫和生殖系统不成熟，来自存活时间较长的GF动物的观点可以深入了解微生物在宿主器官发育和功能中的作用机制。虽然斑马鱼肠道中的细菌菌株在以前的研究中已被分离和鉴定，为感染 GF 动物模型以选择益生菌或研究宿主中的细菌功能提供了潜力19,25，但 GF 鱼模型的生成和应用主要局限于早期生命阶段。这种局限性归因于复杂的生产过程、高昂的维护成本以及与食物和免疫力相关的问题，阻碍了旨在调查宿主中微生物群的发育和慢性影响的研究工作。
鱼类的存活率、行为、生长、成熟和整体健康状况，尤其是在无菌 （GF） 模型中，受到摄食方式的显着影响，包括从早期幼虫到幼鱼张口期间的营养摄入和吸收32,33。然而，GF鱼类养殖业面临的挑战之一是缺乏合适的不育日粮，这限制了维持幼鱼生长和存活的营养支持的有效性。考虑到GF鱼的发育防御机制和由于缺乏肠道微生物组而导致的消化能力薄弱，解决这个问题对于恢复GF鱼的生命至关重要。在食物方面，活盐水虾（卤虫属）是张口幼鱼到幼鱼最合适的食物。据观察，与用煮熟的蛋黄或其他天然和合成饵料喂养的鱼相比，用活盐水喂养的鱼表现出更高的生长率和成活率34。虽然GF鱼的早期生活模型可以在卵黄支持下生存，而GF幼虫模型可以通过无菌喂养来维持，但从幼虫到幼鱼并达到性成熟的长期模型仍然具有挑战性。此外，片状或粉状食物受到营养成分不均的限制，并可能影响水质。相比之下，活卤虫具有在盐水和淡水中都能存活、体型小、适合幼虫到成虫、易于配料和更高的孵化质量等优点35.在先前方法16、24、30 的基础上，我们简化了复杂的处理过程，并通过建立易于孵育的 GF 活卤虫作为无菌食品，其持续时间比早期 GF 鱼更长，从而解决了饮食挑战。
本研究提出了一个优化的方案，涵盖 （1） 代、（2） 维持、（3） 确定不育率以及 （4） 维持和饲喂，以确保无菌 （GF） 斑马鱼从胚胎生长到幼虫和幼年阶段。研究结果为GF斑马鱼的孵化、存活、生长和不育提供了初步证据，并为GF 卤虫 属作为不育食品提供了重要指标。无菌活食模型生成和制备的详细步骤为构建和应用长期GF鱼模型以及 GF卤虫 属在微生物群-宿主相互作用研究中提供了重要的技术支持。该协议解决了GF鱼模型上的细菌分离，鉴定和感染，概述了细菌荧光标记的方法，并在显微镜下观察它们在鱼肠道中的定植。GF鱼、细菌感染的gnotobiotic鱼或转移的人类微生物群模型将进行各种检测，以阐明其功能和对宿主免疫、消化、行为、转录组调控和代谢方面的影响。从长远来看，该协议可以扩展到不同的野生型鱼类，例如海洋青鳉鱼，并可能扩展到与特定组织或疾病相关的其他选定的转基因斑马鱼品系。
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Protocol
鱼类实验是按照重庆市动物护理和使用专业委员会和重庆医科大学动物护理和使用机构的指导原则以及国家质量技术监督局颁布的实验动物标准（批准号：GB14922-2001-GBT14927-2001）进行的。斑马鱼（Danio rerio，野生型，AB品系）来源于中国科学院水生生物研究所，并按照先前报道的程序在实验室中保存36。
1.成年斑马鱼的维护和胚胎采集
注：借鉴先前研究和报告16,37,38,39的修改，我们实验室中成年斑马鱼的维持，幼虫饲养和无菌（GF）模型的实践是按照下面概述的步骤进行的。用于鱼类养殖的超纯流量系统已获得商业化（见材料表）。水在保持平衡的 pH 值、盐和碱的情况下，在循环过程中经过过滤以确保清洁条件。
- 在自动循环系统中按照以下标准程序（见 材料表）保持成年鱼，光周期为暗：光 = 10 小时：在 28 °C ± 0.5 °C 下 14 小时，并用新鲜孵育的 卤虫 属喂养。 每日两次。
- 前一天晚上将性成熟的成年斑马鱼（雄性：雌性 = 2：1）放入装有新鲜干净水的水箱中。
- 让鱼在第二天早上（大约上午8：30）在实验室的常规光刺激下产卵。1-2小时后，将鱼转移到另一个鱼缸中。
- 使用一次性巴斯德移液管将胚胎从自动循环系统收集到水中作为培养基在培养皿中。
2. GF斑马鱼从胚胎到幼虫的生成
注： 图1概述了产生无菌（GF）鱼的程序，而传统（CR）和GF模型的基本发育指标则在 补充图1中显示。请在洁净室中使用无菌技术在台式生物安全柜或层流罩中按照下面概述的步骤进行操作。
- 用鱼培养水清洗胚胎，去除粪便、杂质和死卵或未受精卵。
- 将胚胎以2hpf转移到装有抗生素无菌斑马鱼培养基（AB-GZM，参见 材料表）溶液的灭菌板（每个无菌培养皿最多480个胚胎，直径为10cm）溶液，并在28.5°C下培养6-8小时。
注意：AB-GZM用于处理胚胎数小时以消除表面微生物，而不含抗生素的GZM用于在亚序列中培养GF鱼。通常，完美的培养时间为6小时）。 - 排除有白色斑点或白色外观的鸡蛋，并选择那些正常发育的鸡蛋，显示透明和完整的包膜以供进一步加工。
- 在10分钟内使用AB-GZM冲洗胚胎三次。
- 将胚胎浸泡在 0.2 g/L 聚维酮碘溶液 （PVP-I） 中 1 分钟（参见 材料表）。
注意：更高的浓度和超过 2 分钟的时间会影响胚胎的死亡和孵化率。 - 在10分钟内使用无菌斑马鱼培养基（GZM）洗涤胚胎三次。
- 将胚胎加入次氯酸钠（NaClO）工作溶液中，紧紧覆盖50mL微量离心管，漂白15分钟。在此期间，轻轻摇晃胚胎，将胚胎悬浮在漂白剂溶液中。
- 在10分钟内使用GZM洗涤胚胎三次。
- 将胚胎转移到无菌的 6 孔板中，每孔有 5 个胚胎和 10 mL GZM。在光周期为暗的超洁净平台或培养箱中培养它们：光 = 10 小时：28 °C ± 0.5 °C 下 14 小时。
- 每天通过去除用过的 GZM 来更新培养基，将其收集为用于无菌状态检测的样品，并用相同体积的无菌 GZM 补充每个孔。
- 记录GF胚胎/幼虫的基本发育指标，包括存活率、孵化率、心跳、体长和体重等19。
- 将GF鱼转移到合适的容器（培养皿，细胞培养瓶或带盖的玻璃瓶）中，以扩大体积，在整个生长过程中提供无菌食物。
3. GF斑马鱼从幼虫到幼鱼的维护
- 在 7 dpf 之前不进食的情况下更新 GZM，并每天检测无菌状态（参见步骤 5）。
- 在更换GZM之前，每天一次用无菌蛋黄（每孔10μL制备的储备溶液）喂养8 dpf至幼体阶段的斑马鱼幼虫。
- 用灭菌蛋黄与GF 卤虫 混合喂养GF幼鱼，每天一次（1-3只 卤虫/幼虫，见步骤4），随着GF鱼的生长和发育逐渐增加食物量。
- 提供蛋黄，直到所有鱼都可以食用 卤虫无节幼体。
注意：GF 卤虫 应在使用前进行无菌测试。评估剩余的 卤虫无节幼 体数量，观察追捕和捕捉进度，并检查含有食物的鱼体以指示摄食成功。 - 从28 dpf到早期成虫阶段，每天喂食一次GF 卤虫 （3-5只 卤虫/幼虫），并清理未开发或死亡的 卤虫，以及死鱼作为每日样本进入废弃的GZM中。
- 在GF鱼生长期间，将7 dpf后的6孔板更改为无菌板或细胞培养瓶，从8dpf更改为21dpf，然后在21dpf后更改为无菌瓶。根据每个容器中GF鱼的数量和重量增加培养基和食物质量。
- 每天更新GZM并检查样品，以确保GF模型的成功。
注意：在成年早期和性成熟之前保持无菌（GF）鱼类模型具有挑战性，平均存活率低至30 dpf，通常低于10%。这主要归因于免疫力低下、发育迟缓和肠道功能受损。
4. GF卤虫无节幼体作为慢性GF鱼模型不育食品的制备
注：无菌（GF） 卤虫的 培养和制备方法如图 2所示。请注意，以下所有步骤均在台式生物安全柜中使用无菌技术进行。
- 用 2.4 g/L 次氯酸钠（NaClO，参见材料表）冲洗 0.25 g 卤虫囊肿 5 分钟。
- 用灭菌的超致密过滤器（孔径约170目）过滤冲洗过的 卤虫 囊肿，并用灭菌的超纯水洗涤三次，每次1-2分钟。
- 将洗涤过的 卤虫 囊肿转移到 100 mL 2.5% 灭菌盐水中，混合并按照下面提到的步骤包装用于无菌孵化。
- 将50mL处理 的卤虫 囊肿混合溶液装入体积为100mL的无菌瓶中，用薄膜密封，并在150rpm，30°C的振荡培养箱中用光孵育18小时至24小时。
- 使用一次性巴斯德移液管从中间层和下层提取约 30 mL 孵化 卤虫无节幼 体。
注意： 防止漂浮的鸡蛋和空壳到达上层。无菌（GF） 卤虫 囊肿和 无节幼 体孵育24小时的指标如图 3所示。 - 用灭菌过滤器过滤 卤虫 ，并在灭菌烧杯中用灭菌超纯水洗涤它们三次，每次约30秒至1分钟。最后，加入 4 mL 灭菌超纯水以制备 卤虫 混合溶液。
- 使用一次性巴斯德移液管，从上层取出活跃游泳的 卤虫 ，洗涤并准备 无节幼 体溶液用于喂养和无菌鉴定。
5. GF鱼全生命周期模型的鉴定
注：在无菌（GF）鱼的整个生命周期阶段，关键指标和每日样本检测对于确保模型的成功至关重要。此步骤总结了样品的常见分类和常用的鉴定方法（图4）。
- 每天观察并统计GF斑马鱼幼虫的存活状况和率。在计算相关速率的实验中，GF鱼在24孔或48孔板中养殖，每孔一条鱼。
- 成活率=（观察时活鱼数/卵总数）×100%。
- 不育率=（不育鱼数/存活鱼数）×100%。
注：该协议侧重于活鱼的不育率。不育鱼的数量是通过在活鱼中多次检查后计算成功的GF鱼来确定的。任何因细菌存在而失败的死鱼或活鱼 GF 模型都会在随后的 GF 程序中被消除。
- 收集以下GF斑马鱼幼虫样本。
- 来自每个孔或瓶子容器的GF斑马鱼培养基。
- 鱼食，如无菌蛋黄和GF 卤虫。
- 废物介质，包括孵化后的卵膜碎片和幼鱼到幼鱼在摄食期间的食物残渣或粪便。
- 死鱼样本，用于识别细菌的存在。
- 用于胚胎处理的鱼培养基和试剂作为无菌对照。
- 来自材料、操作平台和培养箱等的样品
- 使用多种方法检测每天收集的样本。
- 首先，使用铺展板法并在30°C的培养箱中培养板。
- 在有氧条件下，将 20-50 μL 废培养基样品涂在胰蛋白酶大豆琼脂 （TSA） 板上（参见 材料表）。
- 在厌氧条件下，在 TSA 板上涂有 20-50 μL 废培养基样品。
- 在有氧条件下，将 20-50 μL 废培养基样品涂在血液 TSA 板上（参见 材料表）。
- 在厌氧条件下将 20-50 μL 废培养基样品涂在血液 TSA 板上。
- 第二，采用液体培养法。
- 将 200 μL 样品放入装有脑心输液 （BHI） 培养基（参见 材料表）的需氧管中，并在 30 °C、150-180 rpm 的振荡培养箱中培养。
- 将200μL样品加入装有BHI培养基的厌氧管中，并在30°C的培养箱中培养。
- 将 200 μL 样品加入装有胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB） 培养基的需氧管中，然后在 30 °C、150-180 rpm 的振荡培养箱中培养。
- 将 200 μL 样品加入装有 TSB 培养基的厌氧管中，并在 30 °C 的培养箱中培养。
- 第三，采用分子技术-16s聚合酶链反应（PCR）测定。
- 用两对引物 27F 和 1492R 以及 63F 和 1387R 分析废水样品（表 1）。
注：PCR预混液是根据 表2 使用市售的DNA聚合酶试剂盒（参见 材料表）制备的，PCR机的设置程序为表 3中指定的程序。 - PCR程序完成后，通过1%琼脂糖凝胶电泳40 在1465bp（使用引物27F和1492R）或1324bp（使用引物63F和1387R）的目标条带上检查产物，以推断样品的无菌性。
- 用两对引物 27F 和 1492R 以及 63F 和 1387R 分析废水样品（表 1）。
- 首先，使用铺展板法并在30°C的培养箱中培养板。
- 记录并观察无菌测试，包括24小时至3天和7天的平板和培养基培养，在此期间，平板上没有菌落，液体中没有浊度，表明GF模型的成功构建。在24小时，48小时，72小时，96小时，120小时，144小时和168小时观察并记录板和培养基。
6. 在以GF鱼为食之前鉴定GF 卤虫 样本
注意：要检测GF 卤虫 样本，在喂养GF鱼之前作为活食是必不可少的（图4），请按照以下步骤操作。
- 收集 GF 卤虫 模型样本。
- 未经治疗 的卤虫 囊肿。
- 治疗过GF 卤虫 囊肿。
- 孵化的 GF卤虫无节幼体。
- 灭菌超纯水作为对照。
- 使用以下方法检测GF 卤虫 。
- 在有氧和厌氧条件下，使用扩散板法通过将它们涂覆在 TSA 板和血液 TSA 板上来检测样品。将它们在30°C下孵育。
- 使用液体培养基检测好氧和厌氧 TSB 和 BHI 管中的样品。在振荡器中以150-180rpm，30°C培养。
- 使用PCR测定法检测使用16s核糖体RNA靶基因引物27F和1492R，63F和1387R收集的样品中是否存在细菌（表1）。音量和程序如 表2 和 表3所示。
- 记录结果：通过1%琼脂糖凝胶电泳40 检测PCR产物，用于测量1465 bp（使用引物27F和1492R）或1324 bp（使用引物63F和1387R）的靶带。平板和液体培养基的方法可以保证 GF卤虫 在用作GF鱼食前的无菌状态。
7. 斑马鱼肠道细菌菌株的分离鉴定
注：为了探索 体外 和 体内的肠道功能，有必要从斑马鱼中分离细菌菌株，斑马鱼也为使用GF动物的感染筛选的潜在益生菌提供了物种来源（图5）。在该协议中，我们描述了传统的解剖方法来获得肠内容物，而样本也可以直接从活的麻醉鱼中收集（数据未显示）。
- 选择健康的成年斑马鱼，并用无菌水清洗。在洁净工作台上执行以下步骤。
- 用 100 mg/L MS-222 麻醉鱼 5-10 分钟。
- 使用 75% 的酒精处理鱼的体表。
- 解剖鱼肠并用TSB或BHI培养基挤出肠内容物。
- 在有氧和厌氧条件下，通过应用 TSA、血板、TSB 和 BHI 培养基孵育肠道上清液。
- 翻译细菌以获得信号菌株并记录不同菌落的特征。
- 将细菌储存在-80°C的30%甘油中。
- 然后，通过基因组DNA提取和PCR测序鉴定肠道细菌。
注：细菌基因组DNA提取的主要步骤包括液体离心，RNase A和蛋白酶K解离，乙醇提取，冲洗和溶解，按照制造商的说明使用市售试剂盒（参见 材料表）。 - 使用美国国家生物技术信息中心 （NCBI） 和基本局部比对搜索工具 （BLAST） 与细菌和古细菌数据库40,41 分析 16S 序列（参见材料表）。
- 选择最匹配的细菌和性状，以在属水平上鉴定分离的肠道菌株。
- 使用市售试剂盒检测细菌菌株的代谢功能（参见 材料表）。
8. 流感标签、感染和细菌在GF斑马鱼肠道中的定植
注意：在感染GF斑马鱼之前，用染料修饰分离的细菌并进行计数，使微生物定植和迁移在 体内 连续可见（图6）。
- 选择宿主中潜在的有益细菌或丰度高的优势菌株来感染GF鱼模型。
注：本研究中使用的细菌是 气单胞菌 属和 弧菌 属（见 材料表），选自实验室中从成年野生型斑马鱼中分离和鉴定的 8 个属42。 - 用CM-Dil染料标记新鲜细菌（参见材料表），并将它们暴露于浓度为10 6-108菌落形成单位（CFU）/ mL的5 dpf的GF斑马鱼中。
- 在荧光显微镜下用3×放大倍数观察荧光，以指示细菌在6 dpf和14 dpf的GF斑马鱼幼虫肠道中的定植和分布。
- 在每个时间点通过平板培养手动计算GF鱼中的细菌数量。
- 检测菌落和序列，以确保目标细菌菌株感染成功。
- 收集细菌感染的GF鱼样本进行后续检测，包括神经行为、发育指标、组织病理学分析和激素测量等43,44,45。
注意：感染实验中使用的细菌应为新回收的细菌，并通过液体培养基新鲜培养。
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Representative Results
GF斑马鱼模型可以通过利用成对的斑马鱼产卵来有效地生产，并根据以前的GF鱼模型35优化了协议。单个 6 孔板可培养约 30-48 个胚胎/幼虫，可进行充足的数据收集和统计分析。无菌处理后，将GF胚胎在干净的培养箱中培养至48-72小时孵化为幼虫，并每天检测收集的样品以改变GZM，这对于保持无菌状态至关重要（图1）。7 dpf后，应为幼虫至幼虫阶段准备蛋黄和活 卤虫 的食物。在鱼类生长发育过程中，应及时调节或改变GZM的体积、容器和密度，以避免死亡和不育状态的失败。如果检测结果显示没有细菌污染，成功的GF模型可以从幼年到成年早期保持慢性模式，但在实践中存活率要低得多。最后，通过测量GF和CR鱼模型的不育率、存活率、发育指标、行为、组织病理学分析、转录谱等指标，探讨微生物群落和药物筛选领域的影响。本研究比较了关键发育指标（附图1），GF鱼的孵化率比CR鱼低45.7%，72 hpf时为60%。GF幼鱼在7 dpf时的心率为18.2次/10 s，而CR鱼的心率为22.6次/10 s，但在14 dpf时，两组的心率为23.5-23.8次/10 s，差异无统计学意义。GF鱼在7 dpf时的存活率与CR鱼的存活率为86.7%相同，但在14 dpf时存活率下降到60%，而CR鱼的存活率为80%。然而，GF鱼和CR鱼在获得摄食能力或习性的张口期后存活率均下降到25%-10%。未能保持鱼类的不育状态是存活率低的原因之一。因此，从幼鱼期到成鱼早期的摄食和营养维持是鱼类养殖的关键挑战。
影响鱼类生长发育的另一个关键因素是饲料。在这项研究中，我们探索了多种方法，以获得GF 卤虫 作为长期GF斑马鱼幼虫到幼鱼和成虫的活食（过程如图 2所示）。由于 GF 鱼每天都要使用食物，因此 GF 卤虫的 优化方案在实践中应该是简单的、省时的和经济的。在比较了显微镜观察的 无节幼体 的主动运动和死亡/不动、 无节幼体、未孵化的卵和壳的特征后，完善了该方法。每日孵育后，在显微镜下观察和测量从瓶子中获得的新鲜GF 卤虫 的指标，包括孵化率、存活率和畸形率，以及 无节幼体的长度和重量（图3）。处理后 卤虫 囊肿孵化率较高，平均为88.15%，游泳 无节幼 体存活率为77.83%，畸形率为1.87%。 无节幼 体体长为546.70 μm，体重指数为3.80 mg/100，适用于幼鱼月开放期至幼鱼期、成鱼期的捕捞摄食。
GF鱼和 GF卤虫的 检测对于模型的维护也很重要。根据样品收集和多种测试方法，结果可以提供处理过的斑马鱼胚胎和 卤虫 囊肿在培养板和液体培养基中的成功率（图4）。在所有测试方法中，每天收集的各种样品都应被检测为无菌，这可以在收集时指示 GF 模型。在饲喂GF鱼之前，应检测GF 卤虫 ，或者平板和培养基培养箱的结果应参考新鲜活 无节幼体的无菌状态。即在TSA板上的囊肿或在摇动孵育的TSB或BHI液体培养基玻璃中培养GF 卤虫 ，可同时用于产生 GF卤虫 和无菌验证。GF 卤虫方案 可以容纳有限数量的幼虫进行喂养。在摄食过程中，很明显，GF 卤虫 在GZM内游动，然后被GF鱼幼虫捕获并食用。
GF FISH模型的应用涉及生物学和医学的各个领域，可以研究微生物功能、生长发育、疾病机制以及益生菌或药物筛选等46。例如，在这项研究中，从斑马鱼中分离出两种主要的肠道细菌， 气单胞菌 属和 弧 菌属。进行菌落特征和鉴定，并使用市售试剂盒 在体外 测量多种代谢功能（图5）。这些细菌被分离出来，并用16S测序进行鉴定，原始细胞的结果在之前的报告42中进行了介绍。鉴定出的细菌菌株通过感染GF鱼模型，使科学研究能够对单一或组合微生物群对宿主健康的影响进行科学研究。鱼幼虫的透明度允许使用CM-Dil染料观察荧光标记的细菌细胞，揭示了GF鱼肠道中的定植和分布（ 如图6所示）。在 5 dpf 的细菌感染后，可以使用荧光显微镜对 GF 斑马鱼幼虫进行成像，并在 6 至 14 dpf 范围内连续观察，从而结合发育指标、组织病理学变化和分子改变提供对微生物功能的见解47。
图1：GF斑马鱼从胚胎到幼虫和幼鱼的方案。 GF斑马鱼生成的关键步骤包括：（1）从野生型斑马鱼中收集胚胎并放入AB-GZM中。（2）用PVP-I和NaClO试剂冲洗处理，确保完全无菌。（3） 用 GZM 在 6 孔板中培养 GF 胚胎/幼虫，每天更新培养基。（4）调节培养条件，以实现最佳生长发育。（5） 在各个发育阶段取样，然后使用平板和液体培养基方法进行无菌测试。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：GF 卤虫制备 作为 GF 鱼活食的方案。 关键步骤包括：（1）冲洗 卤虫 囊肿的处理以完全无菌。（2）培养基中GF囊肿的制备。（3）在盐溶液中孵育24小时，以促进孵化。（4）过滤孵化失败的鸡蛋和空蛋，以收集活跃的 无节幼体。（5）清洗收集的 无节幼 体，清除杂物，确保高质量和无污染的活体食品。（6）在喂食GF鱼幼虫之前对GF 卤虫 进行无菌测试。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：孵育 24 小时的 GF 卤虫 囊肿和 无节幼 体的指标。 （A） 未经处理的 卤虫 囊肿与杂质膜（比例尺：500 μm）。（B） 处理过的 卤虫 囊肿，吸水后表面略凸，外观更干净（比例尺：500μm）。（C） 新鲜孵育的活 GF 卤虫无节 幼体 （比例尺： 2000 μm） 和 （D） 放大倍数，比例尺为 1000 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：GF 鱼在每个生命阶段和 GF 卤虫的无菌检测。 （A） 在有氧和厌氧条件下使用 TSB 和 BHI 液体培养基、TSA 和血板对 CR 和 GF 鱼样品进行无菌测试。（B） 在有氧和厌氧条件下使用 TSB 和 BHI 液体培养基、TSA 和血板对未经处理的 卤虫 囊肿、GF 卤虫 囊肿和 无节 幼体进行无菌测试。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：斑马鱼肠道细菌的分离和鉴定。 （A）细菌菌株，菌落特征，16S测序图（例如： 气单胞菌 属和 弧 菌属）。（B） 属和NCBI种质。（C）从斑马鱼肠道中分离出的细菌的代谢功能。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：GF 斑马鱼中肠道细菌菌株的感染和定植。 （A） 用于感染实验的分离和鉴定细菌菌株的回收。（B） 用荧光染料标记细菌并在 5 dpf 时感染 GF 斑马鱼幼虫。放大倍率：1x。 （C）观察细菌（弧菌 属）在 体内肠道组织中的分布和定植。放大倍数：3x。 （D） 通过每日取样计数每个鱼幼虫中细菌（气单胞菌 属和弧 菌 属）的 CFU。数据表示 SEM ±平均值. 请点击这里查看此图的较大版本.
| 引 | 序列（5'-3'） | 产品长度 |
| 27楼 | AGAGTTTGATCMTGGCTCAG | 1465 基点 |
| 1492R型 | ACGGYTACCTTGTTACGACTT | |
| 63楼 | CAGGCCTAACACATGCAAGTC | 1324 基点 |
| 1387R型 | GGGCGGWGTGTACAAGGC |
表1：用于细菌检测的引物。
| 组件 | 单位 | 体积 （μL） |
| Taq DNA聚合酶 | 2.5 U/μL | 0.1 |
| 10×缓冲液（Mg2+） | --- | 2.1 |
| dNTP混合物 | 2.5毫米 | 1.6 |
| 底漆 27F | 10微米 | 1 |
| 底漆 1492R | 10微米 | 1 |
| 不含 DNA/RNA 的 H2O | --- | 13.2 |
| 模板 DNA | --- | 1 |
| 总体积 | --- | 20 |
表 2：每个反应的组分的最终浓度和体积。
| 步 | 温度 | 时间 | 周期 |
| 初始变性 | 95 摄氏度 | 4 分钟 | -- |
| 变性 | 94 摄氏度 | 1 分钟 | 35 |
| 退火 | 55 摄氏度 | 1 分钟 | |
| 外延 | 72 摄氏度 | 1 分钟 | |
| 最终延期 | 72 摄氏度 | 10 分钟 | -- |
| 拿 | 4 摄氏度 | ∞ | -- |
表3：用于扩增16S rRNA基因的PCR程序。
附图 1：GF和CR斑马鱼模型的关键发育指标。 （A） CR和GF斑马鱼在72 hpf和7 dpf和14 dpf时的孵化率，（B） CR和GF鱼的心跳/10 s。CR和GF鱼的存活率（%）从7 d和14 d下降，分别为86%、60%-80%下降到30 dpf时的10%-25%。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
GF鱼类和GF食品制备协议中的关键步骤
在GF鱼模型的生成过程中，涉及几个关键步骤，包括无菌材料的制备、胚胎的灭菌、GZM的每日更新、各种样品的收集以及使用多种方法对每个样品进行无菌检查。在这些步骤中，胚胎的初始处理对于GF模型的成功是基础和决定性的。控制药剂、药剂浓度和处理时间对于实现最佳灭菌率和孵化成功率至关重要。在将GF鱼胚胎处理到幼虫时，需要特别注意，包括每天更换培养基，并确保在从培养箱中取出板时，使用紫外线或高压灭菌对材料和平台进行彻底灭菌。在冬季监测温度条件和运行时间对于防止在洁净的工作台上因温度较低而导致幼虫死亡至关重要。
不育蛋黄和 GF 卤虫 应在 7 dpf 后喂食鱼类之前进行检测，以确保其长期 GF 模型的无菌状态。在进料期间，清洁食物残渣作为收集样品的一部分非常重要，以便在更新废物介质时进行检测。GZM的容器、体积和食物质量应随着生长和发育阶段进行调整，以防止由于有限的环境和水质问题而导致的GF鱼损失。定期监测和调整这些参数有助于GF鱼类模型的成功维护。
这些协议的修改和意义
生成 GF 斑马鱼胚胎的简化三步过程，涉及优化的 AB-GZM、PVP-I 和 NaClO 溶液的试剂、浓度和暴露时间，确保了高无菌率和模型的健康开发。此外，日常样品的无菌检测方法已经完善，包括在好氧和厌氧条件下的板和液体培养基培养物，以及使用常见细菌引物的分子技术。在细菌和真菌污染物检测方面的进一步经验旨在优化 GF 动物技术过程中的隔离器污染物和无菌检测48.
我们的研究已经研究了 GF卤虫无节幼 体作为鱼类模型活食的具体方案，并授予PPJ和DSP专利（No.ZL202210482684.8）. 长期的GF鱼模型一直受到营养不足和不适当的限制，加剧了与消化和吸收相关的肠道功能的弱点。作为青鳉鱼和斑马鱼模型在不同生命阶段的可靠食物来源，GF 卤虫 属应易于制备，程序简单，孵育时间短，实时无菌检测，适合日常使用。在该方法中，将正常 的卤虫 囊肿在足够浓度的NaClO中冲洗以无菌，然后在薄膜包衣瓶中孵育，以及在板和液体培养基中进行检测。这支持了用于 GF 鱼饲喂的新鲜孵化无 节幼 体。 卤虫的不育率和孵化率，以及体长、体重和活动度都非常好，表明在实践中有可用的应用。
这些修饰在GF鱼和GF食品协议中的重要性有利于研究人员在胚胎、幼虫、幼虫阶段，甚至海洋和淡水模式物种的早期成虫和成虫阶段生成模型。长期GF动物将作为体内模型提供许可，用于药物筛选和宿主生长发育过程中的微生物功能研究，特别是在免疫和相关肠道细胞系的成熟度方面。例如，斑马鱼幼虫仅在第一周具有先天免疫力，然后在 7-21 dpf 期间发展适应性免疫系统，以及胸腺成熟31,49。此外，GF鱼类模型可以通过实时观察生物体中的动态定植和迁移过程来分析细菌-细菌和微生物群-宿主相互作用的可能性50,51。
该方法的局限性
从幼鱼到早期成鱼（28 dpf-2.5 mpf）和性成熟成鱼（>2.5 mpf）的GF鱼养殖仍然具有挑战性，因为在模型维护过程中死亡率增加和细菌污染风险。这些局限性主要是由于缺乏适合生活在GF环境中的鱼类的自养系统。这些系统应包括清洁的空气、水和食品系统，以有效维护动物及其环境，确保与外部微生物完全隔离。与小鼠和鸡52 等其他 GF 动物模型不同，由于它们的水生习性和自然受精方式，通过 CR 亲本的解剖手术获得 GF 斑马鱼具有挑战性。
将成年动物视为完全没有肠道微生物群也具有挑战性。虽然抗生素治疗可能会诱导类似于特定无病原体 （SPF） 动物的状态，其特征是在粪便样本中检测到的微生物群减少，但实现真正的 GF 成年鱼模型仍然很困难。建立和维护GF模型所涉及的挑战，特别是在从青少年状态到长期状态的过渡期间，是巨大的。GF后代，例如来自成年GF鱼的GF F1或F2卵，在微生物研究中的重要性已得到承认。然而，克服在建立和维持长期成年GF鱼模型方面的挑战需要大量的时间。
值得注意的是，已经开发出具有特定细菌定植的gnotobiotic斑马鱼，显示出基于GF模型的慢性存活率。然而，在细菌感染和生物医学研究中，这些模型是否可以作为GF模型的可行替代方案仍然不确定。
GF鱼模型的未来应用
在这项研究中，我们改进了生成GF斑马鱼模型的方案，从胚胎到幼体。这一进展在发育生物学、免疫学、人类疾病研究和器官发生方面具有重要应用。通过大规模分离和鉴定，该研究探索了单一细菌菌株的功能、机制和肠道来源的代谢产物。调查涉及在通风口打开阶段47,53 后感染 GF 斑马鱼模型。此外，具有荧光的标记细菌有助于观察活 GF 幼虫中的定植和分布，不受其他微生物影响54。类似的GF鱼模型，如海洋或淡水青鳉鱼，可以使用具有各种药剂或培养基变化的可比方法创建。
为了探索人类疾病机制，该研究采用 FMT 方法，将患者或供体的样本转移到健康动物或 GF 模型55。与传统饲养 （CR） 动物不同，GF 模型为宿主中的微生物功能、影响或反应提供了强有力的证据，特别是当与噬菌体结合以调节微生物群中的靶细菌时46。
总之，GF斑马鱼因其敏感和纯净的肠道环境，在评估细菌安全性、药物有效性、污染物毒性或化合物干扰方面具有很强的模型作用。未来对GF鱼应用的探索应涵盖各个领域，需要创建成年GF鱼模型，以更深入地了解不同生命阶段的微生物功能。
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Disclosures
GF 卤虫 的方案已被中国国家知识产权局授予专利，在获得作者许可后，将解除该方法的使用限制。提交人声明，他们没有其他竞争利益或经济利益。
Acknowledgments
我们衷心感谢重庆医科大学人才项目（项目编号：R4014，项目编号：R4020）、国家自然科学基金项目（国家自然科学基金项目，编号：32200386）、重庆市博士后创新导师工作室（X7928 DSP）、中国科学院中斯水技术研究示范联合中心项目/中科院中斯联合教育研究中心等项目的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB-GZM | Amphotericin:Solarbio; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. | Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313. |
49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL). |
| 1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes | biosharp | BS-15-M | To collect samples, and hold agents |
| 2.4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution. |
| 6-well plates, 24-, 48- well plates | LABSELECT | 11112 | To culture fish |
| Aeronomas | NCBI database | No.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
| Anaerobic TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system. |
| Anaerobic work station | GENE SCIENCE | E200G | Bacterial isolation, sterile testing |
| Analysis | GraphPad Prism 5 | v6.07 | To analysis the data |
| API 20 E kits | BioMerieux SA, France | No.1005915090 | Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism |
| Artemia (Brine shrimp) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | Aquamaster brand | Artemia cysts, and brine shrimp eggs |
| Auto cycle system for fish culture | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Maintain the fish |
| Autoclave | Zeal Way | G154DWS | Prepare the materials |
| BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder. |
| BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Biochemical incubator | LongYue Co., Ltd | SPX | For fish and plates |
| Biosafety cabinet | Haier | HR40-IIA2 | Sterile treatment and testing |
| Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water. |
| Blood plates | sheep blood:Solarbio | Cat. NO. TX0030 | Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates. |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | To culture fish |
| CM-Dil dyes | Molecular Probes | Cat#C7000 | To label the bacteria |
| Constant temperature shaking incubator | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Bacterial culture |
| Database | NCBI | Bacteria and Archaea database | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ |
| Disposable Pasteur pipette | biosharp | bs-xh-03l | Used to change water, and transfer eggs |
| Disposable petri dish | biosharp | BS-90-D | To culture fish |
| DNA kits | Solaribio | Cat#D1600 | Bacterial genomic DNA extraction kits |
| Electric pipette | SCILOGEX | Levo me | Change water |
| Exiguobacterium | NCBI database | No.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
| GZM | Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L. |
| Laboratory pure water system | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Prepare the agents |
| Microscope | Nikon | SMZ18 | With fluorescent light to observe fish larvae |
| PCR kits | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA Polymerase kit |
| Pipette | LABSELECT | sp-013-10 | Change water |
| Povidone iodine (PVP-I) | Aladdin | Lot#H1217005 | Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water. |
| Timing converter | PinYi Co., Ltd | AL-06 | To regulate the light |
| TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder. |
| TSB Aerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl. |
| TSB Anaerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Ultra-clean workbench | Airtech | SW-CJ-2FD | Sterile treatment and testing |
| Ultra-pure flow system for fish culture | Marine Biological Equipment company | No Cat | Produce water for fish |
| Vibrio | NCBI database | No.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
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