تطوير مسبار مجهري للقوة الذرية قائم على البعوض الحيوي الهجين القائم على ستينغر
Summary
تعد التحقيقات الكمية والخاضعة للرقابة في سلوكيات لدغات الحشرات ضرورية لوضع استراتيجيات فعالة لمكافحة الأمراض المنقولة بالنواقل. في هذا السياق ، يتم تقديم طريقة لتصنيع مجهر القوة الذرية الهجين الحيوي (AFM).
Abstract
يشكل البعوض ، الذي يشتهر بأنه أكثر فتكا بالبشر بسبب قدرته على نقل الأمراض ، تحديا مستمرا للصحة العامة. وتنطوي استراتيجية الوقاية الأولية المستخدمة حاليا على المواد الطاردة الكيميائية، التي غالبا ما تثبت عدم فعاليتها لأن البعوض يطور مقاومة بسرعة. وبالتالي ، فإن اختراع طرق وقائية جديدة أمر بالغ الأهمية. يتوقف هذا التطور على فهم شامل لسلوكيات لدغ البعوض ، مما يستلزم إعدادا تجريبيا يكرر بدقة سيناريوهات العض الفعلية مع معلمات اختبار يمكن التحكم فيها وقياسات كمية. لسد هذه الفجوة ، تم تصميم مجهر القوة الذرية الهجين الحيوي (AFM) ، والذي يتميز بستينغر بيولوجي – على وجه التحديد ، شفا البعوض – كطرف له. يتيح هذا المسبار الحيوي الهجين ، المتوافق مع أنظمة AFM القياسية ، محاكاة شبه حقيقية لسلوكيات اختراق البعوض. وتمثل هذه الطريقة خطوة إلى الأمام في الدراسة الكمية لآليات العض، مما قد يؤدي إلى إنشاء حواجز فعالة ضد الأمراض المنقولة بالنواقل (VBDs) وفتح سبل جديدة في مكافحة الأمراض التي ينقلها البعوض.
Introduction
أفادت منظمة الصحة العالمية (WHO) أن الأمراض المنقولة بالنواقل (VBDs) تمثل أكثر من 17٪ من جميع الأمراض المعدية ، والتي تسبب أكثر من 7،00،000 حالة وفاة سنويا على مستوى العالم. على سبيل المثال ، باعتباره الأكثر فتكا في العالم ، ينشر البعوض العديد من مسببات الأمراض ، مثل حمى الضنك والملاريا وزيكا ، من خلال المفصليات التي تتغذى على الدم ، مما يؤدي إلى 700 مليون إصابة كل عام1. تعتبر الاستكشافات نحو تطوير تدابير فعالة لمنع VBDs ذات أهمية حاسمة ، بما في ذلك محاكاة سلوكيات اختراق البعوض للتحقيق في آليات العض ودراسات الحواجز المحتملة لإثبات فعاليتها في منع الاختراق. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية في وضع نهج مناسبة لإجراء مثل هذه التحقيقات. وقد بذلت جهود في الأدبيات ، بما في ذلك تطوير إبر صغيرة الحجم تشبه هندسة لدغة البعوض. ومع ذلك ، فإن العديد من المواد المستخدمة في صنع هذه الإبر الدقيقة (أي المواد اللزجةالمرنة 2 ، والسيليكون (Si) ، والزجاج ، والسيراميك3 ، وما إلى ذلك) لها خصائص ميكانيكية مختلفة عن المواد البيولوجية لخرطوم البعوض. يمكن أن تكون المواد الهندسية هشة وعرضة للكسر والالتواء 3,4 ، في حين أن خرطوم البعوض يمكن أن يتحمل الكسر أو التواء بشكل أفضل4. تتمثل فائدة وجود مسبار هجين حيوي يستخدم شفا البعوض بدلا من المواد الهندسية في أنه يمكن أن يكون تمثيلا أكثر دقة لآلية ثقب البعوض. أيضا ، يجب دمج الأدوات المتخصصة مع الإبر الدقيقة لإجراء دراسات كمية ، مثل القياس الدقيق للقوة5 ، والذي لا يمكن تحقيقه بسهولة باستخدام الإعدادات المخصصة باستخدام الإبر الدقيقة الهندسية.
يعد النهج القائم على مجهر القوة الذرية (AFM) واعدا من حيث أنه يعمل من خلال استخدام ناتئ بطرف فائق الدقة يتم وضعه بعناية بالقرب من سطح العينة. يمكن للطرف إما أن يمسح عبر أو يضغط باتجاه / إلى سطح ، ويواجه قوى جذب أو تنافر متفاوتة بسبب تفاعلاته مع العينة6. تؤدي هذه التفاعلات إلى انحراف الكابولي ، والذي يتم تتبعه من خلال انعكاس شعاع الليزر من أعلى الكابولي على كاشف ضوئي6. تمكن الحساسية الاستثنائية لحركة النظام AFM من إجراء مجموعة متنوعة من القياسات ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر رسم الخرائط المورفولوجية بدقة picometer ، وقياسات القوة التي تتراوح من piconewtons إلى micronewtons ، والتحقيقات الشاملة متعددةالفيزياء 7. على سبيل المثال ، يمكن إجراء المسافات البادئة AFM لتقييم الاستجابة بدقة للقوة المطبقة للعينة وأيضا لقياس الصلابة والمرونة والخصائص الميكانيكية الأخرى للعينة عن طريق الاقتران بالنماذج التحليلية المناسبة8. يتكون مسبار AFM بشكل شائع من السيليكون (Si) أو نيتريد السيليكون (Si3N4)8 بطول 20-300 ميكرومتر9 ونصف قطر طرف بترتيب عدة إلى عشرات النانومتر10. يمكن أن يكون نصف قطر طرف مقياس النانومتر مثاليا لتطبيقات مثل التصوير عالي الدقة. ومع ذلك ، فإنه لا يمتلك خصائص اللسعات البيولوجية للدراسات التي تحاول تقليد سلوكيات الاختراق من حيث الصلابة ونصف القطر والشكل ونسبة العرض إلى الارتفاع. على سبيل المثال ، بنية الإبرة الدقيقة للبعوض هي الكراسة ، التي لها نسبة عرض إلى ارتفاع ~ 6011 (الطول ~ 1.5 مم إلى 2 مم ؛ القطر ~ 30 ميكرومتر) 12. في حين يمكن افتراض أن مسبار AFM التقليدي يشبه اللدغة البيولوجية مثل الشفا ، فإن خصائصه وأبعاده المادية المميزة لن تعكس الوضع الحقيقي أثناء اللدغة.
لتمكين التحقيقات الكمية لسلوكيات الاختراق التي تحاكي اللدغات البيولوجية للحشرات أو الأخرى مع اللاسعات ، هنا ، عملية لتصنيع ناتئ AFM الهجين الحيوي مع ستينغر بيولوجي حيث يتم تطوير طرفه. كدراسة حالة ، تم بنجاح عرض ناتئ AFM مع طرف شفا البعوض المرفقة. من خلال تسخير المعلومات الموجودة من الأدبيات حول قوى الإدخال النموذجية التي تستخدمها البعوضة لاختراق جلد الضحية12,13 ، يمكن أن يسمح ناتئ AFM الهجين الحيوي هذا بتقليد شبه حقيقي لدغات البعوض تحت AFM العادي. يمكن أيضا تطبيق بروتوكول الاستفادة من اللاسعات البيولوجية الدقيقة لتصنيع ناتئات AFM الهجينة بيولوجيا لتطوير ناتئ AFM الحيوي الهجين الحاد الآخر القائم على ستينغر لإجراء تحقيقات كمية لمجموعة متنوعة من آليات العض.
المصطلحات
يظهر الشكل 1 مخططا للخرطوم ومكوناته ذات الأهمية ، وتعريفاتها هي (1) خرطوم: جزء من الجسم من فم البعوض يسمح للبعوض بإطعام نفسه ، مع بنية قشرة أساسية تتكون من الكراسة (النواة) والشفة (القشرة) ، (2) الشفرين: الغطاء الخارجي الداكن وغير الحاد للخرطوم2، (3) الكراسة: مجموعة من الإبر النحيلة الموجودة داخل الشفرين ، بما في ذلك اثنين من الفك العلوي ، واثنين من الفك السفلي ، والبلعوم السفلي ، والشفا2 ، (4) Hypopharynx: المسؤول عن إفراز اللعاب في مجرى دم المضيف2 ، (5) الفك العلوي: عضو مسنن يساعد في آلية التغذية2 ، (5) الفك السفلي: على غرار الفك العلوي ، فهي تساعد البعوض في آلية التغذية ولها طرف حاد2، (6) الشفا: العضو الرئيسي لاختراق جلد الضحية ، وهو أكبر بكثير من الفك العلوي والفك السفلي والبلعوم السفلي. كما أن لديها هياكل حسية تسمح لها بالعثور على الأوعية الدموية والقنوات الداخلية تحت الجلد2 ، (7) مناول: تجميع بثلاث درجات من الحرية ودقة مقياس ميكرون لتحديد المواقع ، مما يسمح بالحركة في اتجاهات XYZ ، (8) تجميع المشبك: مشبك مكون من جزأين مصنوع خصيصا مثبت على المناور المستخدم لربط ناتئ AFM بدون طرف أثناء التجربة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تهدف الخطوة 1 من البروتوكول إلى تنظيف العينة البيولوجية من الشفرين غير المرغوب فيهما. لتحقيق ذلك ، يتم إجراء شق على الشفرين ، ولكن ليس على الكراسة ، التي تقع مباشرة تحت الشفرين (الشكل 1). نظرا لأن الملزمة والشفرين لا يتم ربطهما معا عند واجهتهما (أي أن الشفرين حر في الانزلاق عل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بالدعم التمويلي المقدم من صندوق الحدود الجديدة في الأبحاث (NFRF) في كندا ، وبرنامج اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) ، ومنح تدريب الماجستير في Fonds de Recherche du Québec Nature et Technologies (FRQNT). يود المؤلفون أيضا أن يشكروا مجموعة البروفيسور Yaoyao Zhao في McGill على دعمهم الفني في طباعة 3D لبعض المكونات.
Materials
| 5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers | Excelta | N/A | For manipulating/dissecting the proboscis. |
| C-4D Probe station | Everbeing Int’l Corp | N/A | Used for AFM assembly. |
| Tipless Tapping Mode Cantilever | NanoAndMore USA | TL-NCH | AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Width: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm) |
| UV Expoxy | Let's resin | ALR00146 | For stinger attachment. |
References
- World Health Organization. Global vector control response 2017–2030. World Health Organization. , (2017).
- Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. Lessons from mosquitoes’ painless piercing. J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).
- Ma, G., Wu, C. Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review. Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).
- Kong, X., Wu, C. Micronano structure and mechanics behavior of mosquito’s proboscis biomaterials with applications to microneedle design. Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).
- Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement. Sci Rep. 10 (1), 12248 (2020).
- Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. Introduction to Scanning Probe Microscopy. Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).
- García, R., Peréz, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
- Thurner, P. J. Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone. WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).
- Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).
- Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology. Meas Sci Technol. 28 (1), 012001 (2017).
- Kong, X. Q., Wu, C. W. Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system. Phys Rev E. 82 (1), 011910 (2010).
- Kong, X. Q., Wu, C. W. Measurement and prediction of insertion force for the mosquito. J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).
- Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design. Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001 (2008).
- Dai, G., et al. Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures. Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).
