Entwicklung einer bio-hybriden Mosquito-Stinger-basierten Rasterkraftmikroskopie-Sonde

Summary

Quantitative und kontrollierte Untersuchungen des Stichverhaltens von Insekten sind entscheidend, um wirksame Strategien zur Bekämpfung vektorübertragener Krankheiten zu entwickeln. In diesem Zusammenhang wird ein Verfahren zur Herstellung einer biohybriden Rasterkraftmikroskopie (AFM)-Sonde vorgestellt.

Abstract

Mücken, die aufgrund ihrer Fähigkeit, Krankheiten zu übertragen, als die tödlichsten Tiere für den Menschen berüchtigt sind, stellen eine ständige Herausforderung für die öffentliche Gesundheit dar. Die derzeit angewandte primäre Präventionsstrategie sind chemische Repellentien, die sich oft als unwirksam erweisen, da Mücken schnell Resistenzen entwickeln. Daher ist die Erfindung neuer Präventionsmethoden von entscheidender Bedeutung. Eine solche Entwicklung hängt von einem gründlichen Verständnis des Stechverhaltens von Mücken ab, was einen Versuchsaufbau erfordert, der tatsächliche Stichszenarien mit kontrollierbaren Testparametern und quantitativen Messungen genau nachbildet. Um diese Lücke zu schließen, wurde eine biohybride Rasterkraftmikroskopie-Sonde (AFM) entwickelt, deren Spitze ein biologischer Stachel – genauer gesagt ein Mückenlabrum – ist. Diese Bio-Hybrid-Sonde, die mit Standard-AFM-Systemen kompatibel ist, ermöglicht eine nahezu authentische Simulation des Penetrationsverhaltens von Mücken. Diese Methode stellt einen Fortschritt in der quantitativen Erforschung von Stichmechanismen dar und führt möglicherweise zur Schaffung wirksamer Barrieren gegen vektorübertragene Krankheiten (VBDs) und eröffnet neue Wege im Kampf gegen durch Stechmücken übertragene Krankheiten.

Introduction

Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) berichtete, dass vektorübertragene Krankheiten (VBDs) über 17 % aller Infektionskrankheiten ausmachen, die weltweit mehr als 7.00.000 Todesfälle pro Jahr verursachen. Als tödlichstes Tier der Welt verbreiten Mücken beispielsweise zahlreiche Krankheitserreger wie Dengue, Malaria und Zika durch blutsaugende Gliederfüßer, was jedes Jahr zu 700 Millionen Infektionen führt¹. Die Erforschung der Entwicklung wirksamer Maßnahmen zur Vorbeugung von VBDs ist von entscheidender Bedeutung, einschließlich der Nachahmung des Penetrationsverhaltens von Mücken, um ihre Stichmechanismen zu untersuchen, und der Untersuchung potenzieller Barrieren, um ihre Wirksamkeit bei der Verhinderung des Eindringens zu beweisen. Eine zentrale Herausforderung besteht darin, geeignete Ansätze für die Durchführung solcher Untersuchungen zu entwickeln. In der Literatur wurden Anstrengungen unternommen, einschließlich der Entwicklung von mikroskaligen Nadeln, die der Geometrie eines Mückenstichs ähneln; Viele der Materialien, die zur Herstellung dieser Mikronadeln verwendet werden (d. h. viskoelastische Materialien², Silikon (Si), Glas, Keramik³ usw.), haben jedoch andere mechanische Eigenschaften als das biologische Material des Rüssels der Mücke. Die technischen Materialien können spröde und anfällig für Bruch und Knicken^{sein 3,4}, während der Rüssel der Mücke einem Bruch oder Knicken besser standhalten^{kann 4}. Der Vorteil einer Bio-Hybrid-Sonde, die das Labrum einer Mücke anstelle von technischen Materialien verwendet, besteht darin, dass sie den Piercing-Mechanismus von Mücken genauer darstellen kann. Außerdem müssen spezielle Werkzeuge in Mikronadeln integriert werden, um quantitative Studien durchzuführen, wie z. B. die genaue Messung von Kraft⁵, die mit kundenspezifischen Setups mit speziell entwickelten Mikronadeln nicht leicht zu erreichen ist.

Der auf der Rasterkraftmikroskopie (AFM) basierende Ansatz ist insofern vielversprechend, als er mit einem Cantilever-Ansatz mit einer ultrafeinen Spitze arbeitet, die sorgfältig in der Nähe der Oberfläche einer Probe positioniert wird. Die Spitze kann entweder über eine Oberfläche scannen oder in eine Oberfläche gedrückt werden, wobei sie aufgrund ihrer Wechselwirkungen mit einer Probe⁶ unterschiedliche Anziehungs- oder Abstoßungskräfte erfährt. Diese Wechselwirkungen führen zur Ablenkung des Auslegers, die durch die Reflexion eines Laserstrahls von der Oberseite des Auslegers auf einen Photodetektor⁶ verfolgt wird. Die außergewöhnliche Empfindlichkeit des Systems gegenüber Bewegungen ermöglicht es dem AFM, eine Vielzahl von Messungen durchzuführen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf morphologische Kartierungen mit Pikometergenauigkeit, Kraftmessungen von Pikonewton bis Mikronewton und umfassende multiphysikalische Untersuchungen⁷. Zum Beispiel können AFM-Eindrücke durchgeführt werden, um die Reaktion auf die aufgebrachte Kraft einer Probe genau zu beurteilen und auch um die Härte, Elastizität und andere mechanische Eigenschaften einer Probe zu messen, indem sie mit geeigneten analytischen Modellen^{gekoppelt werden 8}. Die Sonde des Rasterfelds besteht am häufigsten aus Silizium (Si) oder Siliziumnitrid (Si₃N₄)⁸ mit einer Länge von 20 bis 300 μm⁹ und einem Spitzenradius in der Größenordnung von mehreren bis zehn Nanometern¹⁰. Der Spitzenradius im Nanometerbereich kann ideal für Anwendungen wie hochauflösende Bildgebung sein. Es besitzt jedoch nicht die Eigenschaften biologischer Stacheln für Studien, die versuchen, das Penetrationsverhalten in Bezug auf Steifigkeit, Radius, Form und Streckungsverhältnis nachzuahmen. Zum Beispiel ist die Mikronadelstruktur einer Mücke der Faszikel, der ein Seitenverhältnis von ~60¹¹ (Länge ~1,5 mm bis 2 mm; Durchmesser ~30 μm)¹² hat. Während man davon ausgehen kann, dass eine herkömmliche AFM-Sonde einem biologischen Stachel wie einem Labrum ähnelt, spiegeln ihre unterschiedlichen Materialeigenschaften und Abmessungen nicht die reale Situation während eines Bisses wider.

Um quantitative Untersuchungen des Penetrationsverhaltens zu ermöglichen, das biologische Bisse von Insekten oder anderen Tieren mit Stacheln nachahmt, wird hier ein Verfahren zur Herstellung von bio-hybriden AFM-Auslegern mit einem biologischen Stachel als Spitze entwickelt. Als Fallstudie wurde erfolgreich ein AFM-Ausleger demonstriert, an dem die Spitze eines Mückenlabrums befestigt war. Unter Berücksichtigung vorhandener Informationen aus der Literatur über die typischen Einstichkräfte, mit denen eine Mücke die Haut eines Opfers durchdringt^12,13, kann dieser biohybride AFM-Cantilever möglicherweise eine nahezu reale Nachahmung von Mückenstichen unter einem regulären AFM ermöglichen. Das Protokoll der Nutzung mikrobiologischer Stacheln zur Herstellung von biohybriden AFM-Auslegern kann auch auf die Entwicklung anderer scharfer stachelbasierter biohybrider AFM-Ausleger für quantitative Untersuchungen einer Vielzahl von Beißmechanismen angewendet werden.

Terminologien
Ein Schema eines Rüssels und seiner interessierenden Komponenten ist in Abbildung 1 dargestellt, und ihre Definitionen sind: (1) Rüssel: ein Körperteil aus dem Mund einer Mücke, der es der Mücke ermöglicht, sich selbst zu ernähren, mit einer Kern-Schale-Struktur, die aus dem Faszikel (Kern) und dem Labium (Schale) besteht, (2) Labium: die dunkle und stumpfe äußere Hülle eines Rüssels², (3) Faszikel: eine Gruppe schlanker Nadeln, die sich im Inneren des Labiums befinden, darunter zwei Oberkiefer, zwei Mandibeln, ein Hypopharynx und ein Labrum², (4) Hypopharynx: verantwortlich für die Sekretion von Speichel in den Blutkreislauf des Wirts², (5) Maxillae: gezacktes Element, das den Ernährungsmechanismus unterstützt², (5) Mandibeln: ähnlich wie der Oberkiefer helfen sie der Mücke beim Fressmechanismus und haben eine scharfe Spitze², (6) Labrum: das Hauptglied für das Eindringen in die Haut des Opfers, das viel größer ist als der Oberkiefer, der Mandibeln und der Hypopharynx. Es verfügt auch über sensorische Strukturen, die es ihm ermöglichen, Blutgefäße und interne Kanäle unter der Haut zu finden², (7) Manipulator: eine Anordnung mit drei Freiheitsgraden und einer Genauigkeit im Mikrometerbereich für die Positionierung, die eine Bewegung in XYZ-Richtung ermöglicht, (8) Klemmbaugruppe: eine maßgeschneiderte 2-teilige Klemme, die am Manipulator montiert wird und zum Klemmen des spitzenlosen AFM-Auslegers während des Experiments verwendet wird.

Protocol

Bei der für dieses Protokoll verwendeten Mückenart handelt es sich um ein nicht infiziertes adultes Weibchen von Aedes aegypti (A. aegypti), das eingefroren und in einem Gefrierschrank bei -20 °C gelagert wurde. Die Spezies wurde vom NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center für den Vertrieb über BEI Resources, NIAID, NIH, zur Verfügung gestellt: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Die für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind…

Representative Results

Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder der hergestellten Bio-Hybrid-AFM-Sonde sind in Abbildung 7 zu sehen. Das Ende des Labrums wurde erfolgreich mit dem kipplosen Auslegerbalken verklebt. Aufgrund der natürlichen Krümmung der Mückenstiche und der manuellen Bedienung des vorgestellten Protokolls ist es äußerst schwierig, einen Ausleger mit einer Stingerspitze zu erhalten, die perfekt senkrecht zum Ausleger steht. Der außermittige Winkel zwischen dem Stinger und einer imaginären …

Discussion

Schritt 1 des Protokolls dient dazu, die biologische Probe von dem unerwünschten Labium zu reinigen. Um dies zu erreichen, wird ein Schnitt am Labium gemacht, nicht aber am Faszikel, der direkt unter dem Labium aufliegt (Abbildung 1). Da Faszikel und Labium an ihrer Grenzfläche nicht miteinander verbunden sind (d.h. das Labium kann frei entlang des Faszikels gleiten und wird nur durch seine Befestigung am Mückenkopf an Ort und Stelle gehalten), soll der durchgeführte Schnitt einen Teil d…

Materials

5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Width: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.