Summary

Разработка биогибридного зонда атомно-силовой микроскопии на основе укуса комара

Published: April 26, 2024
doi:

Summary

Количественные и контролируемые исследования поведения насекомых при укусах имеют решающее значение для разработки эффективных стратегий борьбы с трансмиссивными болезнями. В этом контексте представлен способ изготовления биогибридного зонда для атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Abstract

Комары, печально известные как самые смертоносные животные для человека из-за их способности передавать болезни, представляют собой постоянную проблему для общественного здравоохранения. Основная стратегия профилактики, используемая в настоящее время, включает химические репелленты, которые часто оказываются неэффективными, поскольку комары быстро развивают резистентность. Следовательно, изобретение новых методов профилактики имеет решающее значение. Такое развитие зависит от глубокого понимания поведения комаров, требующих экспериментальной установки, которая точно воспроизводит реальные сценарии укусов с контролируемыми параметрами тестирования и количественными измерениями. Чтобы восполнить этот пробел, был разработан зонд биогибридной атомно-силовой микроскопии (АСМ) с биологическим жалом, а именно губой комара в качестве наконечника. Этот биогибридный зонд, совместимый со стандартными системами АСМ, позволяет практически точно моделировать поведение комаров. Этот метод знаменует собой шаг вперед в количественном изучении механизмов укусов, потенциально ведущий к созданию эффективных барьеров против трансмиссивных болезней (ВБД) и открывающий новые возможности в борьбе с болезнями, передаваемыми комарами.

Introduction

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщила, что трансмиссивные болезни (ВБД) составляют более 17% всех инфекционных заболеваний, которые вызывают более 7 000 000 смертей в год во всем мире. Например, будучи самым смертоносным животным в мире, комары распространяют многочисленные патогены, такие как лихорадка денге, малярия и вирус Зика, через кровососущих членистоногих, что приводит к 700 миллионам инфекций каждый год. Исследования в направлении разработки эффективных мер по предотвращению ВБД имеют решающее значение, включая имитацию поведения комаров при проникновении для изучения механизмов их укуса и изучение потенциальных барьеров, чтобы доказать их эффективность в предотвращении проникновения. Одна из ключевых задач заключается в разработке надлежащих подходов к проведению таких расследований. В литературе были предприняты усилия, в том числе разработка микромасштабных игл, напоминающих геометрию жала комара; однако многие материалы, используемые для изготовления этих микроигл (т.е. вязкоупругие материалы2, кремний (Si), стекло, керамика3 и т.д.), имеют другие механические свойства, чем биологический материал хоботка комара. Инженерные материалы могут быть хрупкими и склонными к разрушению и изгибу 3,4, в то время как хоботок комара может лучше выдерживать перелом или коробление4. Преимущество наличия биогибридного зонда, использующего губу комара вместо инженерных материалов, заключается в том, что он может быть более точным представлением механизма прокалывания комаров. Кроме того, специализированные инструменты должны быть интегрированы с микроиглами для выполнения количественных исследований, таких как точное измерение силы5, что нелегко достижимо при индивидуальной настройке с использованием специальных микроигл.

Подход, основанный на атомно-силовой микроскопии (АСМ), является многообещающим в том смысле, что он работает с использованием кантилевера с ультратонким наконечником, который аккуратно расположен близко к поверхности образца. Наконечник может либо сканировать поперек, либо прижиматься к поверхности, испытывая различные силы притяжения или отталкивания из-за его взаимодействия с образцом6. Эти взаимодействия приводят к отклонению консоли, которое отслеживается отражением лазерного луча от верхней части консоли на фотодетектор6. Исключительная чувствительность системы к движению позволяет АСМ проводить широкий спектр измерений, включая, помимо прочего, морфологическое картирование с точностью пикометра, измерения сил в диапазоне от пиконьютонов до микроньютонов и комплексные мультифизические исследования7. Например, вдавливание АСМ может быть выполнено для точной оценки реакции на приложенную силу образца, а также для измерения твердости, эластичности и других механических свойств образца путем сопряжения с соответствующими аналитическими моделями8. Зонд АСМ чаще всего изготавливается из кремния (Si) или нитрида кремния (Si3N4)8 длиной 20-300 мкм9 и радиусом наконечника порядка нескольких до десятков нанометров10. Радиус наконечника в нанометровом масштабе может быть идеальным для таких приложений, как визуализация с высоким разрешением; однако он не обладает характеристиками биологических жал для исследований, которые пытаются имитировать поведение проникновения с точки зрения жесткости, радиуса, формы и соотношения сторон. Например, микроигольчатая структура комара представляет собой пучок, который имеет соотношение сторон ~6011 (длина ~ 1,5 мм до 2 мм; диаметр ~ 30 мкм)12. Хотя можно предположить, что обычный зонд АСМ напоминает биологическое жало, такое как лабрум, его отличительные свойства материала и размеры не будут отражать реальную ситуацию во время укуса.

Чтобы обеспечить количественные исследования проникающего поведения, имитирующего биологические укусы насекомых или других животных с жалами, здесь разработан процесс изготовления биогибридных консолей AFM с биологическим жалом в качестве наконечника. В качестве примера была успешно продемонстрирована консоль AFM с прикрепленным кончиком губы комара. Используя существующую информацию из литературы о типичных силах введения, которые комар использует для прокалывания кожи жертвы12,13, этот биогибридный кантилевер АСМ потенциально может обеспечить почти реальную имитацию укусов комаров при обычном АСМ. Протокол использования микробиологических стингеров для изготовления биогибридных консолей АСМ также может быть применен для разработки других биогибридных кантилеверов АСМ на основе острых жал для количественных исследований различных механизмов укуса.

Термины
Схема хоботка и его компонентов, представляющих интерес, показана на рисунке 1, и их определения следующие: (1) Хоботок: часть тела комара изо рта, которая позволяет комару питаться, со структурой сердцевины и раковины, состоящей из пучка (сердцевины) и лабиума (раковины), (2) Губа: темный и тупой внешний покров хоботка2, (3) Пучок: группа тонких игл, содержащихся внутри половых губ, включая две верхние челюсти, две челюсти, гипофаринкс и губу2, (4) Гипофаринкс: отвечает за секрецию слюны в кровоток хозяина2, (5) Верхние челюсти: зубчатый член, помогающий в механизме питания2, (5) Нижние челюсти: подобно верхней челюсти, они помогают комару в механизме питания и имеют острый кончик2, (6) Губа: основной элемент для проникновения в кожу жертвы, который намного больше, чем верхние челюсти, мандибулы и глотка. Он также имеет сенсорные структуры, которые позволяют ему находить кровеносные сосуды и внутренние каналы под кожей2, (7) Манипулятор: узел с тремя степенями свободы и точностью в микронном масштабе для позиционирования, позволяющий двигаться в направлениях XYZ, (8) Зажим в сборе: изготовленный на заказ зажим из 2 частей, установленный на манипуляторе, используемом для зажима консольного АСМ без наконечника во время эксперимента.

Protocol

Вид комаров, используемый для этого протокола, представляет собой неинфицированную взрослую самку Aedes aegypti (A. aegypti), полученную в замороженном виде и хранящуюся в морозильной камере при температуре -20 °C. Вид был предоставлен Ресурсным центром NIH/NIAID по исследованию филяриатозны…

Representative Results

Изображения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) изготовленного биогибридного зонда АСМ можно найти на рисунке 7. Конец лабрума был успешно приклеен к консольной балке без опрокидывания. Из-за естественной кривизны жал комаров и ручного управления представленным…

Discussion

Шаг 1 протокола предназначен для очистки биологического образца от нежелательной половой губы. Для этого делается разрез на половой губе, но не на пучке, которая находится непосредственно под половой губой (рис. 1). Поскольку пучок и губа не соединены вместе на их стыке (т….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают признательность за финансовую поддержку со стороны канадского Фонда новых рубежей в исследованиях (NFRF), программы Discovery Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) и магистерских стипендий Фонда исследований природы и технологий Квебека (FRQNT). Авторы также хотели бы поблагодарить группу профессора Яо Яо Чжао в Университете Макгилла за их техническую поддержку в 3D-печати некоторых компонентов.

Materials

 5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers Excelta N/A For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station Everbeing Int’l Corp  N/A Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever NanoAndMore USA TL-NCH AFM cantilever used for mounting the labrum.
Specs are shown here:

Shape: Beam
Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m)
Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz)
Length: 125 µm (115 – 135 µm)
Width: 30 µm (22.5 – 37.5 µm)
Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm)
UV Expoxy Let's resin ALR00146 For stinger attachment.

References

  1. World Health Organization. Global vector control response 2017–2030. World Health Organization. , (2017).
  2. Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. Lessons from mosquitoes’ painless piercing. J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).
  3. Ma, G., Wu, C. Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review. Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).
  4. Kong, X., Wu, C. Micronano structure and mechanics behavior of mosquito’s proboscis biomaterials with applications to microneedle design. Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).
  5. Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement. Sci Rep. 10 (1), 12248 (2020).
  6. Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. Introduction to Scanning Probe Microscopy. Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).
  7. García, R., Peréz, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
  8. Thurner, P. J. Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone. WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).
  9. Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).
  10. Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology. Meas Sci Technol. 28 (1), 012001 (2017).
  11. Kong, X. Q., Wu, C. W. Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system. Phys Rev E. 82 (1), 011910 (2010).
  12. Kong, X. Q., Wu, C. W. Measurement and prediction of insertion force for the mosquito. J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).
  13. Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design. Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001 (2008).
  14. Dai, G., et al. Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures. Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).

Play Video

Cite This Article
Ljubich, N. J., Puma, J., Zhang, Z. X., Li, J., Cao, C. Development of a Bio-Hybrid Mosquito Stinger-Based Atomic Force Microscopy Probe. J. Vis. Exp. (206), e66675, doi:10.3791/66675 (2024).

View Video