Desarrollo de una sonda de microscopía de fuerza atómica biohíbrida basada en un aguijón de mosquitos
Summary
Las investigaciones cuantitativas y controladas sobre los comportamientos de picadura de insectos son cruciales para diseñar estrategias efectivas para combatir las enfermedades transmitidas por vectores. En este contexto, se introduce un método para fabricar una sonda de microscopía de fuerza atómica (AFM) biohíbrida.
Abstract
Los mosquitos, conocidos por ser los animales más mortíferos para los humanos debido a su capacidad de transmitir enfermedades, representan un desafío persistente para la salud pública. La estrategia de prevención primaria que se utiliza actualmente consiste en el uso de repelentes químicos, que a menudo resultan ineficaces ya que los mosquitos desarrollan resistencia rápidamente. En consecuencia, la invención de nuevos métodos preventivos es crucial. Tal desarrollo depende de una comprensión profunda de los comportamientos de picadura de mosquitos, lo que requiere una configuración experimental que replique con precisión escenarios reales de picaduras con parámetros de prueba controlables y mediciones cuantitativas. Para cerrar esta brecha, se diseñó una sonda de microscopía de fuerza atómica (AFM) biohíbrida, con un aguijón biológico, específicamente, un labrum de mosquitos, como punta. Esta sonda biohíbrida, compatible con los sistemas AFM estándar, permite una simulación casi auténtica de los comportamientos de penetración de los mosquitos. Este método supone un paso adelante en el estudio cuantitativo de los mecanismos de picadura, lo que podría conducir a la creación de barreras eficaces contra las enfermedades transmitidas por vectores (VBD) y abrir nuevas vías en la lucha contra las enfermedades transmitidas por mosquitos.
Introduction
La Organización Mundial de la Salud (OMS) informó que las enfermedades transmitidas por vectores (VBD) representan más del 17% de todas las enfermedades infecciosas, que causan más de 7.00.000 muertes por año en todo el mundo. Por ejemplo, como el animal más mortífero del mundo, los mosquitos propagan numerosos patógenos, como el dengue, la malaria y el zika, a través de los artrópodos que se alimentan de sangre, lo que resulta en 700 millones de infeccionescada año. Las exploraciones hacia el desarrollo de medidas efectivas para prevenir las VBD son de crucial importancia, incluida la imitación de los comportamientos de penetración de los mosquitos para investigar sus mecanismos de picadura y estudios de barreras potenciales para demostrar su eficacia en la prevención de la penetración. Un desafío clave es desarrollar enfoques adecuados para llevar a cabo tales investigaciones. Se han realizado esfuerzos en la literatura, incluido el desarrollo de agujas a microescala que se asemejan a la geometría de un aguijón de mosquito; sin embargo, muchos de los materiales utilizados para fabricar estas microagujas (es decir, materiales viscoelásticos2, silicio (Si), vidrio, cerámica3, etc.) tienen propiedades mecánicas diferentes a las del material biológico de la probóscide del mosquito. Los materiales de ingeniería pueden ser frágiles y propensos a fracturarse y pandearse 3,4, mientras que la probóscide del mosquito puede resistir mejor la fractura o el pandeo4. La ventaja de tener una sonda biohíbrida que utiliza el labrum de un mosquito en lugar de materiales de ingeniería es que puede ser una representación más precisa del mecanismo de perforación de los mosquitos. Además, se deben integrar herramientas especializadas con microagujas para realizar estudios cuantitativos, como la medición precisa de la fuerza5, que no se puede lograr fácilmente con configuraciones personalizadas que utilizan microagujas diseñadas.
El enfoque basado en la microscopía de fuerza atómica (AFM) es prometedor porque funciona mediante el empleo de un voladizo con una punta ultrafina que se coloca cuidadosamente cerca de la superficie de una muestra. La punta puede escanear a través o ser presionada hacia/dentro de una superficie, experimentando diferentes fuerzas de atracción o repulsión debido a sus interacciones con una muestra6. Estas interacciones conducen a la deflexión del voladizo, que es rastreada por el reflejo de un rayo láser desde la parte superior del voladizo en un fotodetector6. La excepcional sensibilidad al movimiento del sistema permite a AFM realizar una amplia gama de mediciones, que incluyen, entre otras, el mapeo morfológico con precisión de pisómetro, mediciones de fuerza que van desde piconewtons hasta micronewtons, e investigaciones multifísicas exhaustivas7. Por ejemplo, las indentaciones de AFM se pueden realizar para evaluar con precisión la respuesta a la fuerza aplicada de una muestra y también para medir la dureza, elasticidad y otras propiedades mecánicas de una muestra mediante el acoplamiento con modelos analíticos apropiados8. La sonda del AFM está hecha más comúnmente de silicio (Si) o nitruro de silicio (Si3N4)8 con una longitud de 20-300 μm9 y un radio de punta del orden de varios a decenas de nanómetros10. El radio de la punta a escala nanométrica puede ser ideal para aplicaciones como imágenes de alta resolución; Sin embargo, no posee las características de los aguijones biológicos para los estudios que intentan imitar los comportamientos de penetración en términos de rigidez, radio, forma y relación de aspecto. Por ejemplo, la estructura de la microaguja de un mosquito es el fascículo, que tiene una relación de aspecto de ~6011 (longitud ~1,5 mm a 2 mm; diámetro ~30 μm)12. Si bien se puede suponer que una sonda AFM convencional se asemeja a un aguijón biológico como un labrum, sus distintas propiedades y dimensiones del material no reflejarán la situación real durante una mordedura.
Para permitir investigaciones cuantitativas de comportamientos de penetración que imitan mordeduras biológicas de insectos u otros animales con aguijones, aquí se desarrolla un proceso para fabricar voladizos AFM biohíbridos con un aguijón biológico como punta. Como caso de estudio, se demostró con éxito un voladizo de AFM con la punta de un labrum de mosquitos adherida. Aprovechando la información existente de la literatura sobre las fuerzas de inserción típicas que utiliza un mosquito para perforar la piel de una víctima12,13, este voladizo de AFM biohíbrido puede permitir potencialmente la imitación casi real de las picaduras de mosquitos bajo una AFM regular. El protocolo de aprovechamiento de aguijones microbiológicos para fabricar voladizos AFM biohíbridos también se puede aplicar al desarrollo de otros voladizos AFM biohíbridos basados en aguijones afilados para investigaciones cuantitativas de una variedad de mecanismos de mordida.
Terminologías
En la Figura 1 se muestra un esquema de una probóscide y sus componentes de interés, y sus definiciones son (1) Probóscide: una parte del cuerpo de la boca de un mosquito que permite que el mosquito se alimente a sí mismo, con una estructura núcleo-concha compuesta por el fascículo (núcleo) y el labio (caparazón), (2) Labio: la cubierta exterior oscura y roma de una probóscide2, (3) Fascículo: un grupo de agujas delgadas contenidas en el interior del labio, incluyendo dos maxilares, dos mandíbulas, una hipofaringe y un labrum2, (4) Hipofaringe: responsable de secretar saliva en el torrente sanguíneo del huésped2, (5) Maxilares: miembro dentado que ayuda en el mecanismo de alimentación2, (5) Mandíbulas: similares al maxilar, ayudan al mosquito en el mecanismo de alimentación y tienen una punta afilada2, (6) Labrum: el miembro principal para penetrar la piel de una víctima, que es mucho más grande que los maxilares, las mandíbulas y la hipofaringe. También tiene estructuras sensoriales que le permiten encontrar vasos sanguíneos y canales internos debajo de la piel2, (7) Manipulador: un conjunto con tres grados de libertad y precisión a escala de micras para el posicionamiento, lo que permite el movimiento en direcciones XYZ, (8) Conjunto de abrazadera: una abrazadera de 2 partes hecha a medida montada en el manipulador utilizada para sujetar el voladizo AFM sin punta durante el experimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
El paso 1 del protocolo está destinado a limpiar la muestra biológica del labio no deseado. Para ello, se realiza una incisión en el labio, pero no en el fascículo, que descansa directamente debajo del labio (Figura 1). Debido a que el fascículo y el labio no están unidos en su interfaz (es decir, el labio puede deslizarse libremente a lo largo del fascículo y solo se mantiene en su lugar mediante su unión a la cabeza del mosquito), la incisión realizada está destinada a separar pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo financiero del Fondo de Nuevas Fronteras en Investigación (NFRF) de Canadá, el programa Discovery del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y las becas de formación de maestría del Fondo de Investigación de Naturaleza y Tecnologías de Quebec (FRQNT). Los autores también quieren agradecer al grupo del Prof. Yaoyao Zhao en McGill por su apoyo técnico en la impresión 3D de algunos componentes.
Materials
| 5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers | Excelta | N/A | For manipulating/dissecting the proboscis. |
| C-4D Probe station | Everbeing Int’l Corp | N/A | Used for AFM assembly. |
| Tipless Tapping Mode Cantilever | NanoAndMore USA | TL-NCH | AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Width: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm) |
| UV Expoxy | Let's resin | ALR00146 | For stinger attachment. |
References
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