Utveckling av en bio-hybrid mygg Stinger-baserad atomkraftsmikroskopisond

Summary

Kvantitativa och kontrollerade undersökningar av insekters bitbeteenden är avgörande för att utforma effektiva strategier för att bekämpa vektorburna sjukdomar. I detta sammanhang introduceras en metod för att tillverka en bio-hybrid atomkraftsmikroskopi (AFM) sond.

Abstract

Myggor, som är ökända som de dödligaste djuren för människor på grund av deras förmåga att överföra sjukdomar, utgör en ständig utmaning för folkhälsan. Den primära förebyggande strategi som för närvarande används involverar kemiska avskräckningsmedel, som ofta visar sig vara ineffektiva eftersom myggor snabbt utvecklar resistens. Därför är det viktigt att uppfinna nya förebyggande metoder. En sådan utveckling är beroende av en grundlig förståelse för myggbitningsbeteenden, vilket kräver en experimentell uppställning som exakt replikerar faktiska bitningsscenarier med kontrollerbara testparametrar och kvantitativa mätningar. För att överbrygga denna klyfta konstruerades en biohybrid atomkraftsmikroskopi (AFM), med en biologisk gadd – specifikt en mygglabrum – som spets. Denna biohybridsond, som är kompatibel med vanliga AFM-system, möjliggör en nästan autentisk simulering av myggors penetrationsbeteende. Denna metod markerar ett steg framåt i den kvantitativa studien av bitmekanismer, vilket potentiellt kan leda till skapandet av effektiva barriärer mot vektorburna sjukdomar (VBD) och öppna nya vägar i kampen mot myggöverförda sjukdomar.

Introduction

Världshälsoorganisationen (WHO) rapporterade att vektorburna sjukdomar (VBD) står för över 17 % av alla infektionssjukdomar, som orsakar mer än 7 00 000 dödsfall per år globalt. Till exempel, som det dödligaste djuret i världen, sprider myggor många patogener, såsom dengue, malaria och zika, genom bloduppsugande leddjur, vilket resulterar i 700 miljoner infektioner varje år¹. Utforskningar mot utvecklingen av effektiva åtgärder för att förhindra VBD är av avgörande betydelse, inklusive att efterlikna myggors penetrationsbeteenden för att undersöka deras bitmekanismer och studier av potentiella hinder för att bevisa deras effektivitet när det gäller att förhindra penetration. En viktig utmaning är att utveckla lämpliga metoder för att utföra sådana undersökningar. Ansträngningar har gjorts i litteraturen, inklusive utvecklingen av nålar i mikroskala som liknar geometrin hos en myggsticka; Men många av de material som används för att tillverka dessa mikronålar (dvs. viskoelastiska material², kisel (Si), glas, keramik³, etc.) har andra mekaniska egenskaper än det biologiska materialet i myggans snabel. De konstruerade materialen kan vara spröda och benägna att spricka och buckla ^3,4, medan myggans snabel tål brott eller buckling bättre⁴. Fördelen med att ha en biohybridsond som använder labrum från en mygga istället för konstruerade material är att det kan vara en mer exakt representation av myggors genomträngande mekanism. Dessutom måste specialverktyg integreras med mikronålar för att utföra kvantitativa studier, såsom noggrann mätning av kraft⁵, vilket inte är lätt att uppnå med anpassade uppställningar med hjälp av konstruerade mikronålar.

Atomkraftsmikroskopi (AFM)-baserad metod är lovande genom att den fungerar genom att använda en utskjutande med en ultrafin spets som är noggrant placerad nära ett provs yta. Spetsen kan antingen skanna över eller pressas mot/in i en yta, och uppleva varierande attraktiva eller repulsiva krafter på grund av dess interaktioner med ett prov⁶. Dessa interaktioner leder till konsolens avböjning, som spåras genom reflektionen av en laserstråle från konsolens topp på en fotodetektor⁶. Systemets exceptionella känslighet för rörelse gör det möjligt för AFM att utföra ett brett spektrum av mätningar, inklusive men inte begränsat till morfologisk kartläggning med pikometernoggrannhet, kraftmätningar som sträcker sig från pikonewton till mikronewton och omfattande multifysikundersökningar⁷. Till exempel kan AFM-fördjupningar utföras för att exakt bedöma svaret på den applicerade kraften hos ett prov och även för att mäta hårdheten, elasticiteten och andra mekaniska egenskaper hos ett prov genom koppling till lämpliga analytiska modeller⁸. AFM:s sond är oftast gjord av kisel (Si) eller kiselnitrid (Si₃N₄)⁸ med en längd på 20-300 μm⁹ och en spetsradie i storleksordningen flera till tiotals nanometer¹⁰. Spetsradien i nanometerskala kan vara idealisk för applikationer som högupplöst avbildning; Den har dock inte egenskaperna hos biologiska stingers för studier som försöker efterlikna penetrationsbeteenden när det gäller styvhet, radie, form och bildförhållande. Till exempel är mikronålsstrukturen hos en mygga fascikeln, som har ett bildförhållande på ~60¹¹ (längd ~1,5 mm till 2 mm; diameter ~30 μm)¹². Även om en konventionell AFM-sond kan antas likna en biologisk gadd som ett labrum, kommer dess distinkta materialegenskaper och dimensioner inte att återspegla den verkliga situationen under ett bett.

För att möjliggöra kvantitativa undersökningar av penetrationsbeteenden som efterliknar biologiska bett hos insekter eller andra djur med gaddar, utvecklas här en process för att tillverka bio-hybrid AFM-konsoler med en biologisk gadd som spets. Som en fallstudie demonstrerades framgångsrikt en AFM-konsol med en mygglabrumsspets fäst. Genom att utnyttja befintlig information från litteratur om de typiska införingskrafter som en mygga använder för att tränga igenom offrets hud^12,13, kan denna biohybrida AFM-konsol potentiellt möjliggöra nästan verklig härmning av myggbett under en vanlig AFM. Protokollet för att utnyttja mikrobiologiska stingers för att tillverka biohybrida AFM-konsoler kan också tillämpas på utvecklingen av andra vassa stinger-baserade biohybrid AFM-konsoler för kvantitativa undersökningar av en mängd olika bitmekanismer.

Terminologier
En schematisk bild av en snabel och dess komponenter av intresse visas i figur 1, och deras definitioner är (1) SNABEL: en kroppsdel från munnen på en mygga som gör att myggan kan äta sig själv, med en kärna-skalstruktur som består av fascikeln (kärnan) och blygdläppet (skalet), (2) Labium: det mörka och trubbiga yttre höljet av en snabel², (3) Fascikel: en grupp smala nålar som finns inuti labium, inklusive två maxillae, två underkäkar, en hypofarynx och ett labrum², (4) Hypofarynx: ansvarig för att utsöndra saliv i värdens blodomlopp², (5) Maxillae: tandad medlem som hjälper till med matningsmekanismen², (5) Underkäkar: liknar överkäken, de hjälper myggan i matningsmekanismen och har en vass spets², (6) Labrum: den huvudsakliga medlemmen för att penetrera huden på ett offer, som är mycket större än överkäkarna, underkäkarna och hypofarynx. Den har också sensoriska strukturer som gör att den kan hitta blodkärl och inre kanaler under huden², (7) Manipulator: en enhet med tre frihetsgrader och mikronskala noggrannhet för positionering, vilket möjliggör rörelse i XYZ-riktningar, (8) Klämaggregat: en specialtillverkad 2-delad klämma monterad på manipulatorn som används för att klämma fast den spetslösa AFM-konsolen under experimentet.

Protocol

Den myggart som används för detta protokoll är en oinfekterad vuxen hona Aedes aegypti (A. aegypti), som fryses och förvaras i en frys med -20 °C. Arten tillhandahölls av NIH/NIAID Filariasis Research Reagens Resource Center för distribution genom BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. De reagenser och den utrustning som används för studien är listade i materialtabellen. 1. …

Representative Results

Svepelektronmikroskopibilder (SEM) av den tillverkade bio-hybrid AFM-sonden finns i figur 7. Änden av labrum limmades framgångsrikt på den spetslösa utskjutande balken. På grund av den naturliga krökningen av myggstingers och den manuella driften av det presenterade protokollet är det extremt svårt att få en fribärande med en stingerspets perfekt vinkelrät mot utskjutaren. Den förskjutna vinkeln mellan stingern och en imaginär mittlinje vinkelrät mot utskjutaren är vanligtvis …

Discussion

Steg 1 i protokollet är avsett att rengöra det biologiska provet från det oönskade labiumet. För att uppnå detta görs ett snitt på labium, men inte på fascikeln, som vilar direkt under labium (Figur 1). Eftersom fascikeln och labiumet inte är sammanfogade vid sitt gränssnitt (dvs. labium är fritt att glida längs fascikeln och hålls endast på plats genom att det fästs vid mygghuvudet), är det utförda snittet avsett att separera en del av labium från myggans huvud, vilket un…

Materials

5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Width: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.