Neuronale Kernen Isolatie van Human postmortaal hersenweefsel

Summary

De cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel vormt een belangrijke beperking voor de studie van de epigenetische markeringen in chromatine, omdat de meeste assays gebrek aan enkele cel resolutie. Neuronen meestal vermengd met glia en andere niet-neuronale cellen. Wij bieden een protocol te halen en neuronale kernen verzamelen van menselijke hersenen.

Abstract

Neuronen in de menselijke hersenen grotendeels worden postmitotische tijdens de prenatale ontwikkeling, en dus behouden hun kernen gedurende de volledige levensduur. Er is echter weinig bekend over veranderingen in neuronale chromatine-en nucleaire organisatie in de loop van de ontwikkeling en veroudering, of bij chronische neuropsychiatrische aandoeningen. Echter, de meeste chromatine en DNA-gebaseerde testen (anders dan die van vissen), gebrek aan enkele cel resolutie datum. Te dien einde, de aanzienlijke cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel vormt een belangrijke beperking, want meestal verschillende subpopulaties van neuronen worden vermengd met verschillende soorten glia en andere niet-neuronale cellen. Een mogelijke oplossing zou zijn om cel-type specifieke culturen groeien, maar de meeste CNS cellen, met inbegrip neuronen, zijn ex vivo een duurzame, op zijn best, maar een paar weken en zou dus een incompleet model voor epigenetische mechanismen mogelijk actief over de gehele levensduur te bieden . Hier bieden we een protocol te halen en kernen te zuiveren van bevroren (nooit vast) menselijke postmortem hersenen. De methode omvat extractie van kernen in hypotone lysis buffer, gevolgd door ultracentrifugatie en immunotagging met anti-Neun antilichaam. Gelabeld neuronale kernen worden vervolgens gescheiden ingezameld met behulp van fluorescentie-geactiveerde sorteren. Deze methode moet worden van toepassing op alle gebied van de hersenen in een breed scala van soorten en geschikt voor chromatine immunoprecipitatie studies met site-en modificatie-specifieke anti-histon antilichamen, en voor DNA-methylering en andere testen.

Protocol

Kernen Extraction Doe 250 mg van bevroren postmortaal hersenweefsel in 5 ml Lysis Buffer 1 in een douncer en plaats deze op ijs. Voor het ontvangen van ongeveer 5 miljoen kernen na FACS-sortering, we meestal gebruik van 1000 mg van de weefsels per monster. Zodra het weefsel is ontdooid, dounce het weefsel voor een minuut, terwijl op ijs. Neem de gehomogeniseerd weefsel en plaats deze in een 15 ml helder ultracentrifuge buis. Zet de tube op het ijs. Neem 9 mL van Sucrose…

Discussion

Het protocol hier gepresenteerde moeten in het bijzonder nuttig zijn voor onderzoek gericht zijn op epigenetische veranderingen van neuronale chromatine en, meer algemeen, over de moleculaire fenotype van de neuronale kern, tijdens de normale ontwikkeling en veroudering, of in de neurologische of psychiatrische ziekte. De methode is vooral van voordeel bij de cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel, inclusief mogelijke verschuivingen in neuron-to-glia rantsoen in de loop van het ouder worden of door ziekte zijn een punt van ^zor…

Materials

Reagents:

1. Lysis Buffer
0.32M	Sucrose	5.47 g
5 mM	CaCl2	250 µl
3 mM	Mg(Acetate)2	150 µl
0.1 mM	EDTA	10 µl
10mM	Tris-HCl, pH8	500 µl
1 mM	DTT	17 µl
0.1%	Triton X-100	50 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water

2. Sucrose Solution
1.8 M	Sucrose	30.78 g
3 mM	Mg(Acetate)2	150 µl
1 mM	DTT	17 µl
10 mM	Tris-HCl, pH8	500 µl
Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water

3. Dounce buffer
10 mM	Tris	0.242 g
4 mM	MgCl2	0.163 g
1 mM	CaCl2	0.03 g
Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water