גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם
Summary
ההטרוגניות הסלולר של רקמת המוח מהווה מגבלה משמעותית לחקר סימונים epigenetic ב הכרומטין כי רוב מבחני חוסר ברזולוציה תא בודד. נוירונים הם בדרך כלל התערבבו עם גליה ולמוסדות אחרים ללא כוונת תאים עצביים. אנו מספקים פרוטוקול לחלץ ולאסוף גרעינים העצבית מהמוח האנושי.
Abstract
נוירונים במוח האנושי להיות postmitotic בעיקר במהלך התפתחות טרום לידתי, ובכך לשמור על גרעינים תוחלת החיים שלהם לאורך מלא. עם זאת, מעט מאוד ידוע על שינויים עצביים הכרומטין והארגון גרעיני במהלך התפתחות והזדקנות, או מחלה כרונית נוירופסיכיאטריות. עם זאת, עד כה מבחני מבוסס הכרומטין ביותר ו-DNA (למעט דגים) ברזולוציה יחיד חוסר התא. לשם כך, את ההטרוגניות הסלולר ניכר של רקמת המוח מהווה מגבלה משמעותית, שכן בדרך כלל subpopulations שונים של נוירונים הם התערבבו עם סוגים שונים של גליה ולמוסדות אחרים ללא כוונת תאים עצביים. אחד הפתרונות האפשריים יהיה לגדל תאים מסוג בתרבויות מסוימות, אבל רוב התאים במערכת העצבים המרכזית, כולל נוירונים, הם vivo לשעבר קיימא, במקרה הטוב, רק כמה שבועות ובכך יספק מודל שלם של מנגנוני epigenetic פוטנציאל ההפעלה ברחבי תוחלת החיים המלא . כאן, אנו מספקים פרוטוקול לחלץ ולטהר גרעינים מהמוח (לא קבוע) קפוא המוות האנושי. השיטה כוללת מיצוי של גרעיני במאגר תמוגה hypotonic, ואחריו ultracentrifugation ו immunotagging עם נוגדן אנטי NeuN. גרעינים העצבית תווית נאספים אז בנפרד באמצעות הקרינה המופעל מיון. שיטה זו צריכה לחול על כל האזור במוח במגוון רחב של מינים מתאימים ללימודי הכרומטין immunoprecipitation עם אתר ושינוי ספציפי אנטי היסטון נוגדנים, ועל מתילציה בדנ"א מבחני אחרות.
Protocol
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן צריך להיות שימושי במיוחד עבור מחקרים התמקדו בשינויים epigenetic של הכרומטין העצבית, ובאופן כללי יותר, על הפנוטיפ המולקולרי של גרעין עצבי, במהלך מחלה נוירולוגית או פסיכיאטרית נורמלי בפיתוח הזדקנות, או. השיטה היא יתרון מסוים כאשר ההטרוגניות הסלולר של רקמת המוח, כו?…
Acknowledgements
החוקרים מעריכים את העצה ותמיכה טכנית מסופק על ידי ד"ר ריצ'רד Konz והצוות במתקן cytometry זרימה Core באוניברסיטת הספר לרפואה של מסצ'וסטס. משאבים Core נתמך על ידי לאנדוקרינולוגיה וסוכרת במרכז המחקר גרנט DK032520 שימשו גם. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות הנפש (NIMH), המכון הלאומי לשימוש בסמים (NIDA) לבין המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם.
Materials
Reagents:
| 1. Lysis Buffer | ||
|---|---|---|
| 0.32M | Sucrose | 5.47 g |
| 5 mM | CaCl2 | 250 µl |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 0.1 mM | EDTA | 10 µl |
| 10mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 0.1% | Triton X-100 | 50 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 2. Sucrose Solution | ||
|---|---|---|
| 1.8 M | Sucrose | 30.78 g |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 10 mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 3. Dounce buffer | ||
|---|---|---|
| 10 mM | Tris | 0.242 g |
| 4 mM | MgCl2 | 0.163 g |
| 1 mM | CaCl2 | 0.03 g |
| Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water | ||
References
- Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons. PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells. Biotechniques. 43, 791-797 (2007).
