Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe
Summary
Die zellulären Heterogenität von Hirngewebe stellt eine erhebliche Einschränkung für das Studium der epigenetischen Markierungen in Chromatin, da die meisten Assays einzelne Zelle Auflösung fehlt. Neuronen sind typischerweise mit Glia und andere nicht-neuronalen Zellen vermischt. Wir bieten ein Protokoll zu extrahieren und zu sammeln neuronale Kerne von menschlichen Gehirns.
Abstract
Neuronen im menschlichen Gehirn postmitotischen weitgehend geworden während der pränatalen Entwicklung, und behalten so ihre Kerne während der gesamten Lebensdauer. Es ist jedoch wenig über die Änderungen in der neuronalen Chromatin und nukleare Organisation im Laufe der Entwicklung und Alterung, oder bei chronischen neuropsychiatrischen Krankheit bekannt. Doch bis heute die meisten Chromatin und DNA basierenden Tests (außer Fisch) fehlen einzelne Zelle Auflösung. Zu diesem Zweck stellt die erheblichen zellulären Heterogenität des Hirngewebes eine erhebliche Einschränkung, denn in der Regel verschiedene Subpopulationen von Neuronen mit verschiedenen Arten von Gliazellen und anderen nicht-neuronalen Zellen vermischt. Eine mögliche Lösung wäre, Zelltyp-spezifische Kulturen wachsen, aber die meisten ZNS-Zellen, einschließlich Neuronen, sind ex vivo eine nachhaltige, am besten, denn nur ein paar Wochen und somit würde ein unvollständiges Modell für epigenetische Mechanismen potentiell Betriebskosten über die gesamte Lebensdauer liefern . Hier bieten wir ein Protokoll zu extrahieren und zu reinigen Kerne aus gefrorenem (nie fest) menschlichen post mortem Gehirn. Das Verfahren beinhaltet die Extraktion der Kerne in hypotone Lyse-Puffer, durch Ultrazentrifugation und immunotagging mit anti-NeuN-Antikörper. Labeled neuronale Kerne werden dann separat mit Fluoreszenz-aktivierter Sortierung gesammelt. Diese Methode sollte für jede Region des Gehirns in eine Vielzahl von Arten und für Chromatinimmunpräzipitation Studien mit Ort-und Umbau-spezifischen anti-Histon-Antikörper, und für die DNA-Methylierung und andere Assays.
Protocol
Discussion
Das Protokoll hier vorgestellten sollte besonders nützlich für Studien zu epigenetischen Veränderungen der neuronalen Chromatin und ganz allgemein ausgerichtet, auf der molekularen Phänotyp der neuronalen Zellkern, während der normalen Entwicklung und Alterung, oder in neurologischen oder psychiatrischen Erkrankungen. Die Methode ist von besonderem Vorteil, wenn die zelluläre Heterogenität des Hirngewebes, einschließlich der möglichen Verschiebungen in Neuron-to-Glia Ration im Verlauf des Alterns oder wegen Krankheit eine Sorge <su…
Acknowledgements
Die Autoren schätzen die Beratung und technische Unterstützung durch Dr. Richard Konz und Personal an der Durchflusszytometrie-Core Facility sofern an der University of Massachusetts Medical School. Core-Ressourcen durch die Diabetes Endocrinology Research Center Stipendium DK032520 unterstützt wurden ebenfalls verwendet. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem National Institute of Mental Health (NIMH), das National Institute of Drug Abuse (NIDA) und dem National Institute of Child Health and Human Development unterstützt.
Materials
Reagents:
| 1. Lysis Buffer | ||
|---|---|---|
| 0.32M | Sucrose | 5.47 g |
| 5 mM | CaCl2 | 250 µl |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 0.1 mM | EDTA | 10 µl |
| 10mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 0.1% | Triton X-100 | 50 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 2. Sucrose Solution | ||
|---|---|---|
| 1.8 M | Sucrose | 30.78 g |
| 3 mM | Mg(Acetate)2 | 150 µl |
| 1 mM | DTT | 17 µl |
| 10 mM | Tris-HCl, pH8 | 500 µl |
| Adjust volume to 50 ml with Autoclaved water | ||
| 3. Dounce buffer | ||
|---|---|---|
| 10 mM | Tris | 0.242 g |
| 4 mM | MgCl2 | 0.163 g |
| 1 mM | CaCl2 | 0.03 g |
| Adjust pH to 7.5 and volume to 200 ml with Autoclaved water | ||
References
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