Isolatie en Cultuur van Post-Natal Mouse Cerebellaire Korrel Neuron progenitor cellen en Neuronen
Summary
Hier presenteren wij een methode om te isoleren en cultuur cerebellaire granule neuron progenitor cellen en cerebellaire korrel neuronen van postnatale muis.
Abstract
De cerebellaire cortex is een goed beschreven structuur die unieke kansen voor het bestuderen van neuronale eigenschappen en ontwikkeling 1,2 biedt. Van de cerebellaire neuronale types (granule cellen, Purkinje cellen en remmende interneuronen), granulaat neuronen zijn veruit de meest talrijke en zijn de meest voorkomende vorm van neuronen in de hersenen van zoogdieren. Bij knaagdieren, zijn de kleine hersenen korrel neuronen die tijdens de eerste twee postnatale week van progenitor cellen in de buitenste laag van de cerebellaire cortex, de externe korrel laag (EGL). Het protocol beschrijft hier gepresenteerde technieken te verrijken en cultuur korrel neuronen en hun stamcellen uit post-natale muis cerebellum. We beschrijven de procedures aan culturen van toenemende zuiverheid 3,4, die kan worden gebruikt om de differentiatie van prolifererende progenitorcellen in de granule neuronen 5,6 studie te verkrijgen. Zodra de progenitor cellen differentiëren, de culturen ook een homogene populatie van korrel neuronen zorgen voor experimentele manipulatie en karakterisering van fenomenen zoals synaptogenese, glutamaat receptor functie 7, interactie met andere gezuiverde cerebellaire cellen 8,9 of celdood 7.
Protocol
Discussion
Dit protocol is gebaseerd op de wijzigingen van de procedures die zijn beschreven in het verleden 3,7,11. Er zijn een aantal belangrijke punten om op te merken, zoals hieronder besproken.
De korrel neuronen en progenitor cellen zich binnen 2 uur in de platen. Gezonde cellen hebben een ronde morfologie onder de fase-contrast microscoop 4. Binnen 24 uur na plating, zullen gezonde cellen verspreid over heel de dekglaasjes of het plastic goed en vormt processen. Op het moment van het eerste medium te veranderen, na…
Acknowledgements
Wij danken Barbara Carletti en Anna Marie Kenney voor waardevolle suggesties. HYL wordt ondersteund door de Training Grant "Hormonen: Biochemie en Moleculaire Biologie ', DK07328. Mede ondersteund door NIH subsidie 5R01 NS16951 (CAM).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer with 70μm mesh pore | BD Biosciences | 352350 | ||
| Spinal Needle | BD | 405182 | 20G x 3-1/2 inches | |
| Poly-D-Lysine mol wt>300,000 | Sigma | P1024 | Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. | |
| Percoll | Sigma | P-1644 | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma | P4333 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Must be calcium and magnesium free. | |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | ||
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | ||
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | ||
| 12-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3029 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| 25-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3037 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK 003150 | Kit is good for five isolations. | |
| Permaset scissors | Roboz | RS6782 | ||
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz | RS4978 | ||
| 4-well culture dish | Nunc | 176740 | ||
| 6-well culture dish | Nunc | 140685 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. . Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Banker, G., Goslin, K. . in Culturing Nerve Cells. , 419-419 (1998).
- Hatten, M. E. . The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).
- Carletti, B., Rossi, F. . Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).
- Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. . Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).
- Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. . Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).
- Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. . Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).
- Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. . Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. . Cerebellar Cortex: Cytology and Organization. , (1974).
- Messer, A. . Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).
- Ruiz I Altaba, A. . Development. 126, 3205-3205 (1999).
- Wallace, V. A. . Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. . Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. . Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).
- Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. . Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).
- Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).
- Kenney, A. M., Rowitch, D. H. . Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).
- Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. . Development. 130 (1), 15-15 (2003).
- Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. . Development. 128, 1481-1481 (2001).
