Isolierung und Kultivierung von Post-Natal-Maus Cerebellar Granule Neuron Vorläuferzellen und Neuronen
Summary
Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und Kultur des Kleinhirns Granulat Neuron Vorläuferzellen und Kleinhirn Nervenzellen Granulat aus postnatalen Maus.
Abstract
Die Kleinhirnrinde ist eine gut beschriebene Struktur, einzigartige Möglichkeiten zur Untersuchung neuronaler Eigenschaften und Entwicklung 1,2 bietet. Von den Kleinhirn-Neuronen-Typen (Körnerzellen, Purkinje-Zellen und hemmenden Interneuronen), sind Nervenzellen Granulat bei weitem die meisten und sind die am häufigsten vorkommende Art von Neuronen im Gehirn von Säugetieren. Bei Nagetieren sind zerebelläre Nervenzellen Granulat während der ersten zwei postnatalen Wochen von Vorläuferzellen in der äußersten Schicht der Kleinhirnrinde, die externen Körnerschicht (EGL) generiert. Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt Techniken zu bereichern und Kultur Granulat Neuronen und ihre Vorläuferzellen aus postnatalen Maus Kleinhirn. Wir beschreiben Verfahren Kulturen von zunehmender Reinheit 3,4, die verwendet werden, um die Differenzierung von proliferierenden Vorläuferzellen in Nervenzellen Granulat 5,6-Studie zu erwirken. Sobald die Vorläuferzellen zu differenzieren, die Kulturen auch eine homogene Population von Nervenzellen Granulat für experimentelle Manipulation und Charakterisierung von Phänomenen wie Synaptogenese, Glutamat-Rezeptor-Funktion 7, Interaktion mit anderen gereinigt Kleinhirn Zellen 8,9 oder Zelle Death 7.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll basiert auf Modifikationen der Verfahren, die in der Vergangenheit 3,7,11 beschrieben worden sind, basiert. Es gibt einige wichtige Punkte zu beachten wie unten diskutiert.
Die Nervenzellen Granulat-und Vorläuferzellen innerhalb von 2 Stunden plating halten. Gesunde Zellen haben einen runden Morphologie unter dem Phasenkontrast-Mikroskop 4. Innerhalb von 24 Stunden nach dem Ausplattieren werden gesunde Zellen gleichmäßig verteilt auf der ganzen Deckgläser oder der Kunststoff gut und Prozess…
Acknowledgements
Wir danken Barbara Carletti und Anna Marie Kenney für wertvolle Anregungen. , DK07328: Hyl wird durch die Ausbildung Grant "Biochemie und Molekularbiologie Hormone" unterstützt. Unterstützte teilweise durch NIH 5R01 NS16951 (CAM).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer with 70μm mesh pore | BD Biosciences | 352350 | ||
| Spinal Needle | BD | 405182 | 20G x 3-1/2 inches | |
| Poly-D-Lysine mol wt>300,000 | Sigma | P1024 | Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. | |
| Percoll | Sigma | P-1644 | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma | P4333 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Must be calcium and magnesium free. | |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | ||
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | ||
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | ||
| 12-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3029 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| 25-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3037 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK 003150 | Kit is good for five isolations. | |
| Permaset scissors | Roboz | RS6782 | ||
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz | RS4978 | ||
| 4-well culture dish | Nunc | 176740 | ||
| 6-well culture dish | Nunc | 140685 |
References
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