Zweidimensionale Gelelektrophorese
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Overview
Zweidimensionaler Gelelektrophorese (2DGE) ist eine Technik, die Tausende von Biomolekülen aus einer Mischung auflösen kann. Diese Technik beinhaltet zwei verschiedene Trennverfahren zusammen gekuppelt: isoelektrischen Fokussierung (IEF) und Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Dies trennt physikalisch Verbindungen über zwei Achsen eines Gels durch ihre isoelektrischen Punkte (eine elektrochemische Eigenschaft) und ihren Molekulargewichten.
Das Verfahren in diesem Video deckt die wichtigsten Konzepte der 2DGE und ein allgemeines Verfahren zur Charakterisierung der Zusammensetzung einer komplexen Proteinlösung. Drei Beispiele für diese Technik sind unter der Rubrik Anwendungen, einschließlich der Biomarker-Erkennung für Krankheit Initiierung und Fortschritt, Kontrollbehandlung bei Patienten und die Untersuchung von Proteinen nach posttranslationale Modifikation (PTM) gezeigt.
Zweidimensional, oder 2D, Gelelektrophorese ist eine Technik, die unter Verwendung zwei verschiedene Trennverfahren, die Tausenden von Proteinen aus einer einzigen Mischung trennen können. Eine der Techniken, SDS-PAGE oder Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, nicht vollständig allein komplexe Stoffgemische trennen. 2D Gelelektrophorese Paare der SDS-PAGE auf eine zweite Methode, isoelektrischen Fokussierung oder IEF, die trennt auf isoelektrischen Punkte, so dass für die Lösung von potenziell alle Proteine in einer Zelle lysate. Dieses Video zeigt, dass die Grundsätze der 2D gel-Elektrophorese, ein allgemeines Verfahren, und einige seiner biomedizinische Anwendungen.
2D Gelelektrophorese beginnt mit IEF als die erste Dimension. Jedes Protein hat einen pH-Wert, der isoelektrischen Punkt oder pI, genannt, wo die Nettoladung ist null. Wenn ein Protein in einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, bewegt sie in Richtung der Elektrode mit entgegengesetzter Ladung. Proben von Interesse sind immobilisierte pH-Gradienten oder IPG, Streifen verladen die Ampholyten, Moleküle mit saure und basische Gruppen eingegraben haben. Ein elektrisches Feld wird dann auf die pH Steigung Streifen, verursacht die Proteine zu migrieren, bis zum Erreichen des pH-Wertes Abgleich ihrer pI, wo sie verlieren ihre Nettoladung angewendet.
Vor dem Ausführen der zweiten Dimension, die eingebettete Proteine mit SDS, Denaturierung sie und bietet eine einheitliche negative Ladung behandelt. Einmal abgeschlossen, werden die IPG-Streifen auf einem Polyacrylamid-Gel platziert. Ein angewandter elektrisches Feld zieht die Proteine in Richtung der Anode mit größere Proteine langsam durch das Gel.
Sobald die Proteinmischung nach pI und Molekulargewicht abgetrennt wurde, die Proteom-Karte ist mit Flecken visualisiert und interessierender Proteine identifiziert.
Nun, da wir die Grundsätze der 2D Gelelektrophorese besprochen haben, gehen Sie wir über eine typische Laborverfahren.
Bevor das Experiment durchgeführt werden kann, müssen die Proteine in Medien solubilisiert. Solubilisierung der Probe erfolgt durch de-Aggregation Proteine mit einer Kombination von chaotropen Agenten für Störung der Wasserstoff-Bindung Interaktionen, nichtionische Detergentien, zu verhindern, ändern die Proteine kostenlos, Reduktionsmittel, Disulfid-Bindungen aufzubrechen und puffert. Um störende reichlich Proteinen und anderen Molekülen zu entfernen, wird das Material nacheinander durch Zentrifugation und Sammlung von der daraus resultierenden Pellet extrahiert; gefolgt von der Behandlung mit Endonuklease, ein Enzym verwendet, um keine DNA zu verbrauchen, die mit dem Experiment stören würde.
Sobald die Proteine solubilisiert haben, sind IPG Streifen durch das Ausspülen mit einem Streifen-Reinigungslösung vorbereitet und kopfüber trocknen gelassen. Jeder Streifen wird dann ein Streifen-Halter-Nummer zugewiesen. Einmal fertig, ist der Streifen in einer langsamen, gleitenden Bewegung vom negativ zum Pluspol der zelluläre Extrakt verladen. Zum Zwecke der Rehydratation wird feucht Löschpapier auf die Elektrode und unter die Gel-Streifen gelegt; die IPG-Streifen werden dann auf das IEF-Instrument gesäumt. Ein hoher elektrischer Strom angewendet, und die Proteine beginnen zu migrieren.
Nach Abschluss der ersten Dimension ist das Gel für SDS-PAGE in einer Gießvorrichtung bereit. Die IPG-Streifen werden behandelt werden, indem sie unten im SDS-haltigen Gleichgewichtherstellung Puffer. Die Elektrophorese-Einheit ist mit dem Zusatz von Elektrophorese Puffer vorbereitet. Die behandelten IPG-Streifen werden mit einer Pinzette, platziert die Gel-Platten und versiegelt mit Agarose-Abdichtung Lösung gesammelt. Eine Spannungsquelle gilt dann ein elektrisches Feld, das gehalten wird, bis die schnellste Bewegung Proteine 1 cm über dem Boden des Gels sind.
Nach Abschluss der Elektrophorese müssen die Proteine visualisiert werden. Traditionell erfolgt dies durch Färbung mit Coomassie-Blau oder Silber-Nitrat. Interessierenden Proteine werden durch Western-Blot Analyse aus dem Gel übertragen, und analysiert.
Ein zweiter Ansatz Identifikation beinhaltet Exzision der Proteine aus dem Gel, verdauen sie, als sie durch Massenspektrometrie analysiert.
Nun, da wir ein Verfahren überprüft haben, betrachten wir einige der Anwendungen für 2D Gelelektrophorese.
Einer der häufigsten Verwendungszwecke für diese Technik ist die Identifizierung von Molekülen Krankheit Initiation und Progression beteiligt. 2D Gelelektrophorese, gekoppelt mit Massenspektrometrie, erkennt die Up oder Down-Regulierung spezifischer Proteine erkrankten Bereiche im Vergleich zu gesunden.
Darüber hinaus eignet sich die 2D Gelelektrophorese im Anschluss an der Fortschritts des Patienten als Reaktion auf eine mögliche therapeutische Droge. Patienten an verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung können Proben entnommen werden. Auf diese Weise können 2D Gelelektrophorese gepaart mit Western-Blot oder Massenspektrometrie Analyse Proteinen assoziiert mit negativen Reaktionen wie Entzündung erkennen; oder das Fehlen von Proteinen in einem gemilderten Zustand.
Ein weiteres Einsatzgebiet für 2D Gelelektrophorese ist die Untersuchung von Protein-Struktur und Funktion nach posttranslationale Modifikation oder PTM, die Ergänzungen zu den Proteinen, die nach ihrer Übersetzung von mRNA. PTM können eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Protein signaling, Genexpression regulieren oder oxidativen Schäden verursachen. 2D Gelelektrophorese reagiert empfindlich auf Veränderungen wie Methylierung oder Acetylierung, die eine Verschiebung in pI sowie das Molekulargewicht verursachen können.
Sie haben nur Jupiters Video auf 2D Gelelektrophorese angesehen. Dieses Video beschrieben die Prinzipien der Technik, eine typische Versuchsdurchführung und einige ihrer Anwendungen auf dem Gebiet der Biomedizin.
Danke fürs Zuschauen!
Procedure
Disclosures
Transcript
Two-dimensional, or 2D, gel electrophoresis is a technique utilizing two distinct separation methods which can separate thousands of proteins from a single mixture. One of the techniques, SDS-PAGE or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, cannot fully separate complex mixtures alone. 2D gel electrophoresis couples the SDS-PAGE to a second method, isoelectric focusing or IEF, which separates based on isoelectric points, allowing for the resolution of potentially all proteins in a cell lysate. This video will show the principles of 2D gel electrophoresis, a general procedure, and some of its biomedical applications.
2D gel electrophoresis begins with IEF as the first dimension. Every protein has a pH value, called the isoelectric point or pI, where the net charge is zero. When a protein is subjected to an electric field, it will move toward the electrode with opposite charge. Samples of interest are loaded onto immobilized pH gradient, or IPG, strips which have embedded ampholytes, molecules containing both acidic and basic groups. An electric field is then applied to the pH gradient strip, causing the proteins to migrate until they reach the pH value matching their pI, where they lose their net charge.
Prior to running the second-dimension, the embedded proteins are treated with SDS, denaturing them and providing a uniform negative charge. Once completed, the IPG strips are placed onto a polyacrylamide gel. An applied electric field draws the proteins toward the anode, with larger proteins moving more slowly through the gel.
Once the protein mixture has been separated according to pI and molecular weight, the proteome map is visualized using stains, and proteins of interest are identified.
Now that we have discussed the principles of 2D gel electrophoresis, let’s go over a typical laboratory procedure.
Before the experiment can be performed, the proteins must be solubilized into media. Solubilization of the sample is achieved by de-aggregating proteins with a combination of chaotropic agents for disrupting hydrogen-bonding interactions, nonionic detergents to prevent altering of the proteins’ charge, reducing agents to break disulfide bonds, and buffers. To remove interfering abundant proteins and other molecules, the material is sequentially extracted by centrifugation, and collection of the resulting pellet; followed by treatment with endonuclease, an enzyme used to consume any DNA that would interfere with the experiment.
Once the proteins have been solubilized, IPG strips are prepared by rinsing with a strip-cleaning solution and left upside-down to dry. Each strip is then assigned a strip holder number. Once ready, the cellular extract is loaded onto the strips in a slow, sliding motion from the negative to the positive end. For the purpose of rehydration, damp blotting paper is placed on top of the electrode and under the gel strips; the IPG strips are then lined onto the IEF instrument. A high electric current is applied, and the proteins begin to migrate.
Following completion of the first dimension, the gel for SDS-PAGE is prepared in a casting apparatus. The IPG strips are treated by placing them face down in SDS-containing equilibration buffer. The electrophoresis unit is readied with the addition of electrophoresis buffer. The treated IPG strips are collected using tweezers, placed on top of the gel plates, and sealed with agarose-sealing solution. A voltage source then applies an electric field, which is held until the fastest-moving proteins are 1 cm from the bottom of the gel.
After completion of the electrophoresis, the proteins must be visualized. Traditionally this is performed by staining with Coomassie blue or silver nitrate. Proteins of interest may be transferred from the gel, and analyzed by Western blot analysis.
A second identification approach involves excision of the proteins from the gel, digesting them, than analyzing them by mass spectrometry.
Now that we’ve reviewed a procedure, let’s look at some of the uses for 2D gel electrophoresis.
One of the most common uses for this technique is the identification of molecules involved in disease initiation and progression. 2D gel electrophoresis, coupled with mass spectrometry, can detect the up- or down-regulation of specific proteins in diseased areas in comparison to healthy ones.
Additionally, 2D gel electrophoresis is useful in following the progress of patients’ response to a potential therapeutic drug. Specimens may be taken from patients at various timepoints following administration of the treatment. In this way, 2D gel electrophoresis coupled with Western blot or mass spectrometry analysis, can detect proteins associated with negative responses such as inflammation; or the absence of proteins in an alleviated state.
Another use for 2D gel electrophoresis is in the study of protein structure and function following posttranslational modification, or PTM, which are additions to proteins following their translation from mRNA. PTM’s can regulate a variety of functions, including protein signaling, gene expression, or cause oxidative damage. 2D gel electrophoresis is sensitive to modifications such as methylation or acetylation, which can cause a shift in pI as well as the molecular weight.
You’ve just watched JoVE’s video on 2D gel electrophoresis. This video described the principles of the technique, a typical experimental procedure, and several of its applications in the field of biomedicine.
Thanks for watching!
