Elettroforesi bidimensionale su gel

L’elettroforesi su gel bidimensionale, o 2D, è una tecnica che utilizza due distinti metodi di separazione che possono separare migliaia di proteine da una singola miscela. Una delle tecniche, SDS-PAGE o elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio, non può separare completamente miscele complesse da sole. L’elettroforesi su gel 2D accoppia la SDS-PAGE a un secondo metodo, la messa a fuoco isoelettrica o IEF, che separa in base a punti isoelettrici, consentendo la risoluzione di potenzialmente tutte le proteine in un lisato cellulare. Questo video mostrerà i principi dell’elettroforesi su gel 2D, una procedura generale e alcune delle sue applicazioni biomediche.

L’elettroforesi su gel 2D inizia con IEF come prima dimensione. Ogni proteina ha un valore di pH, chiamato punto isoelettrico o pI, dove la carica netta è zero. Quando una proteina è sottoposta a un campo elettrico, si muoverà verso l’elettrodo con carica opposta. I campioni di interesse vengono caricati su gradiente di pH immobilizzato, o IPG, strisce che hanno incorporato anfoliti, molecole contenenti sia gruppi acidi che basici. Un campo elettrico viene quindi applicato alla striscia di gradiente di pH, causando la migrazione delle proteine fino a raggiungere il valore di pH corrispondente al loro pI, dove perdono la loro carica netta.

Prima di eseguire la seconda dimensione, le proteine incorporate vengono trattate con SDS, denaturandole e fornendo una carica negativa uniforme. Una volta completate, le strisce IPG vengono poste su un gel di poliacrilammide. Un campo elettrico applicato attira le proteine verso l’anodo, con proteine più grandi che si muovono più lentamente attraverso il gel.

Una volta che la miscela proteica è stata separata in base al pI e al peso molecolare, la mappa del proteoma viene visualizzata utilizzando le macchie e vengono identificate le proteine di interesse.

Ora che abbiamo discusso i principi dell’elettroforesi su gel 2D, esaminiamo una tipica procedura di laboratorio.

Prima che l’esperimento possa essere eseguito, le proteine devono essere solubilizzate in mezzi. La solubilizzazione del campione si ottiene disaggregando le proteine con una combinazione di agenti chaotropici per interrompere le interazioni di legame idrogeno, detergenti non ionici per prevenire l’alterazione della carica delle proteine, agenti riducenti per rompere i legami disolfuro e tamponi. Per rimuovere le proteine abbondanti interferenti e altre molecole, il materiale viene estratto sequenzialmente mediante centrifugazione e raccolta del pellet risultante; seguito da un trattamento con endonucleasi, un enzima utilizzato per consumare qualsiasi DNA che interferirebbe con l’esperimento.

Una volta solubilizzate le proteine, le strisce IPG vengono preparate risciacquando con una soluzione detergente per strisce e lasciate a testa in giù ad asciugare. Ad ogni striscia viene quindi assegnato un numero di portastrieri. Una volta pronto, l’estratto cellulare viene caricato sulle strisce in un movimento lento e scorrevole dall’estremità negativa a quella positiva. Ai fini della reidratazione, la carta assorbente umida viene posizionata sopra l’elettrodo e sotto le strisce di gel; le strisce IPG vengono quindi allineate sullo strumento IEF. Viene applicata un’alta corrente elettrica e le proteine iniziano a migrare.

Dopo il completamento della prima dimensione, il gel per SDS-PAGE viene preparato in un apparato di fusione. Le strisce IPG vengono trattate posizionandole a faccia in giù in un tampone di equilibrio contenente SDS. L’unità di elettroforesi viene pronta con l’aggiunta di tampone di elettroforesi. Le strisce IPG trattate vengono raccolte utilizzando una pinzetta, poste sopra le piastre di gel e sigillate con soluzione sigillante di agarose. Una sorgente di tensione applica quindi un campo elettrico, che viene trattenuto fino a quando le proteine in movimento più veloce si trovano a 1 cm dal fondo del gel.

Dopo il completamento dell’elettroforesi, le proteine devono essere visualizzate. Tradizionalmente questo viene eseguito colorando con nitrato blu o argento Coomassie. Le proteine di interesse possono essere trasferite dal gel e analizzate mediante analisi Western blot.

Un secondo approccio di identificazione prevede l’escissione delle proteine dal gel, digerendole, piuttosto che analizzarle mediante spettrometria di massa.

Ora che abbiamo esaminato una procedura, diamo un’occhiata ad alcuni degli usi per l’elettroforesi su gel 2D.

Uno degli usi più comuni di questa tecnica è l’identificazione delle molecole coinvolte nell’inizio e nella progressione della malattia. L’elettroforesi su gel 2D, abbinata alla spettrometria di massa, può rilevare la regolazione verso l’alto o verso il basso di proteine specifiche in aree malate rispetto a quelle sane.

Inoltre, l’elettroforesi su gel 2D è utile per seguire i progressi della risposta dei pazienti a un potenziale farmaco terapeutico. I campioni possono essere prelevati dai pazienti in vari momenti dopo la somministrazione del trattamento. In questo modo, l’elettroforesi su gel 2D accoppiata con Western blot o analisi di spettrometria di massa, può rilevare proteine associate a risposte negative come l’infiammazione; o l’assenza di proteine in uno stato alleviato.

Un altro uso per l’elettroforesi su gel 2D è nello studio della struttura e della funzione delle proteine a seguito di modifica post-traduzione, o PTM, che sono aggiunte alle proteine dopo la loro traduzione dall’mRNA. I PTM possono regolare una varietà di funzioni, tra cui la segnalazione proteica, l’espressione genica o causare danni ossidativi. L’elettroforesi su gel 2D è sensibile a modifiche come la metilazione o l’acetilazione, che possono causare uno spostamento del pI e del peso molecolare.

Hai appena visto il video di JoVE sull’elettroforesi su gel 2D. Questo video descriveva i principi della tecnica, una tipica procedura sperimentale, e molte delle sue applicazioni nel campo della biomedicina.

Grazie per l’attenzione!