Eletroforese em Gel Bidimensional
English
Share
Overview
Eletroforese de gel bidimensional (2DGE) é uma técnica que pode resolver milhares de biomoléculas a partir de uma mistura. Esta técnica envolve dois métodos de separação distintos que foram acoplados: foco isoelétrico (IEF) e eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de sódio (SDS-PAGE). Isso separa fisicamente compostos através de dois eixos de um gel por seus pontos isoelétricos (uma propriedade eletroquímica) e seus pesos moleculares.
O procedimento neste vídeo abrange os principais conceitos do 2DGE e um procedimento geral para caracterizar a composição de uma solução proteica complexa. Três exemplos dessa técnica são mostrados na seção de aplicações, incluindo detecção de biomarcadores para iniciação e progresso da doença, monitoramento do tratamento em pacientes e estudo de proteínas após modificação pós-transacional (TEPT).
Eletroforese de gel bidimensional, ou 2D, é uma técnica que utiliza dois métodos distintos de separação que podem separar milhares de proteínas de uma única mistura. Uma das técnicas, SDS-PAGE ou sódio dodecyl sulfate poliacrilamida gel electrophoresis, não pode separar totalmente misturas complexas sozinhas. A eletroforese de gel 2D acopla o SDS-PAGE a um segundo método, foco isoelétrico ou IEF, que se separa com base em pontos isoelétricos, permitindo a resolução de potencialmente todas as proteínas em um lise celular. Este vídeo mostrará os princípios da eletroforese de gel 2D, um procedimento geral e algumas de suas aplicações biomédicas.
A eletroforese de gel 2D começa com o IEF como a primeira dimensão. Toda proteína tem um valor de pH, chamado de ponto isoelétrico ou i PI, onde a carga líquida é zero. Quando uma proteína é submetida a um campo elétrico, ela se move em direção ao eletrodo com carga oposta. Amostras de interesse são carregadas em gradiente de pH imobilizado, ou IPG, tiras que têm amfolitos incorporados, moléculas contendo grupos ácidos e básicos. Um campo elétrico é então aplicado na tira de gradiente de pH, fazendo com que as proteínas migrem até atingirem o valor do pH que corresponde ao seu iPI, onde perdem sua carga líquida.
Antes de executar a segunda dimensão, as proteínas incorporadas são tratadas com SDS, desnaturando-as e fornecendo uma carga negativa uniforme. Uma vez concluídas, as tiras IPG são colocadas em um gel de poliacrilamida. Um campo elétrico aplicado atrai as proteínas em direção ao ânodo, com proteínas maiores movendo-se mais lentamente através do gel.
Uma vez que a mistura de proteínas tenha sido separada de acordo com o iDO e o peso molecular, o mapa proteome é visualizado usando manchas, e proteínas de interesse são identificadas.
Agora que discutimos os princípios da eletroforese em gel 2D, vamos passar por cima de um procedimento laboratorial típico.
Antes que o experimento possa ser realizado, as proteínas devem ser solubilizadas na mídia. A solubilização da amostra é obtida pela desagregação de proteínas com uma combinação de agentes chaotrópicos para interromper interações de ligação de hidrogênio, detergentes noniônicos para evitar a alteração da carga das proteínas, reduzindo os agentes para quebrar ligações de desulfida e tampões. Para remover proteínas abundantes e outras moléculas, o material é extraído sequencialmente por centrifugação e coleta da pelota resultante; seguida do tratamento com endonuclease, enzima usada para consumir qualquer DNA que interferisse no experimento.
Uma vez solubilizadas as proteínas, as tiras de IPG são preparadas enxaguando com uma solução de limpeza de tiras e deixadas de cabeça para baixo para secar. Cada tira é então atribuída a um número de suporte de tira. Uma vez pronto, o extrato celular é carregado nas tiras em um movimento lento e deslizante do negativo para o lado positivo. Para fins de reidratação, o papel de mancha úmida é colocado em cima do eletrodo e sob as tiras de gel; as tiras IPG são então forradas no instrumento IEF. Uma alta corrente elétrica é aplicada, e as proteínas começam a migrar.
Após a conclusão da primeira dimensão, o gel para SDS-PAGE é preparado em um aparelho de fundição. As tiras IPG são tratadas colocando-as de frente para baixo no buffer de equilíbrio contendo SDS. A unidade de eletroforese é readied com a adição de tampão de eletroforese. As tiras de IPG tratadas são coletadas com pinças, colocadas em cima das placas de gel, e seladas com solução de vedação de agarose. Uma fonte de tensão então aplica um campo elétrico, que é mantido até que as proteínas em movimento mais rápido estejam a 1 cm da parte inferior do gel.
Após a conclusão da eletroforese, as proteínas devem ser visualizadas. Tradicionalmente, isso é realizado por coloração com nitrato azul coomassie ou prata. Proteínas de interesse podem ser transferidas do gel, e analisadas pela análise de manchas ocidentais.
Uma segunda abordagem de identificação envolve a excisão das proteínas do gel, digerindo-as, do que analisá-las por espectrometria de massa.
Agora que revisamos um procedimento, vamos ver alguns dos usos para eletroforese em gel 2D.
Um dos usos mais comuns para essa técnica é a identificação de moléculas envolvidas na iniciação e progressão da doença. A eletroforese de gel 2D, juntamente com a espectrometria de massa, pode detectar a regulação de proteínas específicas em áreas doentes em comparação com as saudáveis.
Além disso, a eletroforese de gel 2D é útil para acompanhar o progresso da resposta dos pacientes a uma potencial droga terapêutica. Os espécimes podem ser retirados de pacientes em vários momentos após a administração do tratamento. Desta forma, a eletroforese de gel 2D aliada à análise de manchas ocidentais ou espectrometria de massa, pode detectar proteínas associadas a respostas negativas, como inflamação; ou a ausência de proteínas em um estado aliviado.
Outro uso para eletroforese de gel 2D está no estudo da estrutura e função proteica após modificação pós-transacional, ou PTM, que são adições a proteínas após sua tradução de mRNA. Os PTM’s podem regular uma variedade de funções, incluindo sinalização proteica, expressão genética ou causar danos oxidativos. A eletroforese de gel 2D é sensível a modificações como metilação ou acetilação, que podem causar uma mudança no II, bem como no peso molecular.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre eletroforese em gel 2D. Este vídeo descreveu os princípios da técnica, um procedimento experimental típico, e várias de suas aplicações no campo da biomedicina.
Obrigado por assistir!
Procedure
Disclosures
Transcript
Two-dimensional, or 2D, gel electrophoresis is a technique utilizing two distinct separation methods which can separate thousands of proteins from a single mixture. One of the techniques, SDS-PAGE or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, cannot fully separate complex mixtures alone. 2D gel electrophoresis couples the SDS-PAGE to a second method, isoelectric focusing or IEF, which separates based on isoelectric points, allowing for the resolution of potentially all proteins in a cell lysate. This video will show the principles of 2D gel electrophoresis, a general procedure, and some of its biomedical applications.
2D gel electrophoresis begins with IEF as the first dimension. Every protein has a pH value, called the isoelectric point or pI, where the net charge is zero. When a protein is subjected to an electric field, it will move toward the electrode with opposite charge. Samples of interest are loaded onto immobilized pH gradient, or IPG, strips which have embedded ampholytes, molecules containing both acidic and basic groups. An electric field is then applied to the pH gradient strip, causing the proteins to migrate until they reach the pH value matching their pI, where they lose their net charge.
Prior to running the second-dimension, the embedded proteins are treated with SDS, denaturing them and providing a uniform negative charge. Once completed, the IPG strips are placed onto a polyacrylamide gel. An applied electric field draws the proteins toward the anode, with larger proteins moving more slowly through the gel.
Once the protein mixture has been separated according to pI and molecular weight, the proteome map is visualized using stains, and proteins of interest are identified.
Now that we have discussed the principles of 2D gel electrophoresis, let’s go over a typical laboratory procedure.
Before the experiment can be performed, the proteins must be solubilized into media. Solubilization of the sample is achieved by de-aggregating proteins with a combination of chaotropic agents for disrupting hydrogen-bonding interactions, nonionic detergents to prevent altering of the proteins’ charge, reducing agents to break disulfide bonds, and buffers. To remove interfering abundant proteins and other molecules, the material is sequentially extracted by centrifugation, and collection of the resulting pellet; followed by treatment with endonuclease, an enzyme used to consume any DNA that would interfere with the experiment.
Once the proteins have been solubilized, IPG strips are prepared by rinsing with a strip-cleaning solution and left upside-down to dry. Each strip is then assigned a strip holder number. Once ready, the cellular extract is loaded onto the strips in a slow, sliding motion from the negative to the positive end. For the purpose of rehydration, damp blotting paper is placed on top of the electrode and under the gel strips; the IPG strips are then lined onto the IEF instrument. A high electric current is applied, and the proteins begin to migrate.
Following completion of the first dimension, the gel for SDS-PAGE is prepared in a casting apparatus. The IPG strips are treated by placing them face down in SDS-containing equilibration buffer. The electrophoresis unit is readied with the addition of electrophoresis buffer. The treated IPG strips are collected using tweezers, placed on top of the gel plates, and sealed with agarose-sealing solution. A voltage source then applies an electric field, which is held until the fastest-moving proteins are 1 cm from the bottom of the gel.
After completion of the electrophoresis, the proteins must be visualized. Traditionally this is performed by staining with Coomassie blue or silver nitrate. Proteins of interest may be transferred from the gel, and analyzed by Western blot analysis.
A second identification approach involves excision of the proteins from the gel, digesting them, than analyzing them by mass spectrometry.
Now that we’ve reviewed a procedure, let’s look at some of the uses for 2D gel electrophoresis.
One of the most common uses for this technique is the identification of molecules involved in disease initiation and progression. 2D gel electrophoresis, coupled with mass spectrometry, can detect the up- or down-regulation of specific proteins in diseased areas in comparison to healthy ones.
Additionally, 2D gel electrophoresis is useful in following the progress of patients’ response to a potential therapeutic drug. Specimens may be taken from patients at various timepoints following administration of the treatment. In this way, 2D gel electrophoresis coupled with Western blot or mass spectrometry analysis, can detect proteins associated with negative responses such as inflammation; or the absence of proteins in an alleviated state.
Another use for 2D gel electrophoresis is in the study of protein structure and function following posttranslational modification, or PTM, which are additions to proteins following their translation from mRNA. PTM’s can regulate a variety of functions, including protein signaling, gene expression, or cause oxidative damage. 2D gel electrophoresis is sensitive to modifications such as methylation or acetylation, which can cause a shift in pI as well as the molecular weight.
You’ve just watched JoVE’s video on 2D gel electrophoresis. This video described the principles of the technique, a typical experimental procedure, and several of its applications in the field of biomedicine.
Thanks for watching!
