Summary
我们提出了一个高效的人体细胞重编程为人类诱导多能干细胞（hiPSC）用OCT3 / 4，SOX2，KLF4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体编码和识别正确地重新编程，现场染色hiPSC协议茶1-81抗体。
Abstract
在此，我们提出了一个人类成年成纤维细胞重编程为人类诱导多能干细胞使用编码在场的丁酸钠1-3 OCT3 / 4，SOX2，KLF4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体（hiPSC）协议。我们用这个方法来改编年底通过（P10）成人成纤维细胞（GM03665，Coriell库），弗里德的共济失调患者。重编程的方法包括高效转协议，使用重复离心成纤维细胞中含有病毒，媒体的存在。重新编程hiPSC殖民地确定了使用现场染色TRA-1-81，多能干细胞的表面标志，从非重编程成纤维细胞分离和手动4,5代。然后转移到这些hiPSC被基底膜板，直接重新编程板，生长在馈线的条件。从第一代开始，hiPSC殖民地展示特点胚胎-LIKE形态。使用该协议可以超过70％选择殖民地成功地扩大到细胞系的建立。建立hiPSC线显示特点的多能性标志物，包括表面标志TRA-1-60和SSEA-4，以及核标记OCT3 / 4，Sox2和Nanog的。这里介绍的协议已经成立，并进行弗里德的共济失调患者和控制个人6，人类新生儿成纤维细胞，以及人类角质细胞获得成年成纤维细胞。
Protocol
1。病毒生产和传导
- 板的凤凰Ampho细胞〜7 8x10的6％DMEM培养基（DMEM高糖，10％胎牛血清的热灭活，L-谷氨酰胺2毫米，无抗生素）在10毫升10厘米的板密度。在孵化器和文化过夜的地方，在37℃，5％的CO 2。
- 第二天染凤凰细胞使用12微克的矢量编码要么OCT3 / 4，SOX2，KLF4和c-myc，或绿色荧光蛋白基因（质粒Addgene 17217，17218，17219，17220）和35μLFugene 6。准备在500μLDMEM培养基（DMEM高糖，2毫米L-谷氨酰胺，无FBS和抗生素）转染组合。孵育20分钟。轻轻吸取到10厘米的板含有70-80％汇合凤凰细胞DNA复合物。
- 更换媒体6 - 8小时后转染含有青霉素和链霉素的DMEM培养基（DMEM高糖，10％胎牛血清的热灭活，2毫米L-谷氨酰胺）。
- 随后，收集病毒包含媒体的4倍，在12Ĥ间隔，所有的部分结合起来，并使用0.45μm过滤器过滤，去除离体细胞和碎片（含有病毒颗粒的介质，可以保持在2个星期的冰箱不失传染病活动，但冻结不推荐）。
- 逆转录病毒转导，板成人成纤维细胞（，Coriell实验室通过10）从冻结的股票24小时前逆转录媒体收集的最后一天。种子细胞密度1×10 5个细胞在DMEM高糖，6以及明胶覆盖板，10％胎牛血清，2毫米L-谷氨酰胺，青霉素，链霉素和非必需氨基酸。
- 第二天替代DMEM培养基与媒体含有从凤凰细胞中获得的病毒颗粒。新增病毒的媒体（1毫升每Oct4的，SOX2，KLF4，和c-myc媒体，共4毫升），辅以6微克/毫升的聚凝胺在1600克到每一个良好的文化和离心机的成纤维细胞的6孔板1小时20°C。约12小时自动对焦之三的传导，更换成纤维细胞培养液中的病毒的媒体。每隔24小时执行病毒感染和离心的3倍。
- 在DMEM培养基培养成纤维细胞，最后感染后48小时。检查与表达GFP逆转录病毒的媒体并行转导的感染效率。图1说明了离心促进人类成纤维细胞的逆转录病毒感染的效率。
2。重新编程
- 准备6孔板播种〜2×10 5细胞密度在每口井的明胶MEF细胞γ辐照MEF饲养层处理成纤维细胞生长介质中的6孔板。翌日分裂感染人成纤维细胞，用0.05％胰蛋白酶/ EDTA和种子，他们在成纤维细胞生长培养基中密度〜1.2X10 4％。
- 第二天更换媒体与，胚胎媒体（DMEM/F12培养液，20％Knockout血清置换，非必需氨基酸，penicilliN /链霉素，L-谷氨酰胺2毫米，0.1毫米，20毫微克/毫升基底成纤维细胞生长因子（bFGF），与最初的7天的重编程为0.5毫米丁酸钠补充β-巯基乙醇。每天改变媒体。
- 日常监测转染细胞的形态变化。臀部，像细胞的殖民地，将开始出现约5 - 10天，后转移到饲养细胞的转成纤维细胞。 hiPSC殖民地准备约14被隔离 - 镀上MEF饲养层细胞后28天。
3。隔离hiPSC殖民地
- 一天，前采摘的hiPSC的殖民地准备γ辐照MEF饲养细胞，成纤维细胞生长培养基（4％〜4X10细胞）的24孔板。在此阶段hiPSC殖民地，也可以转移到免费接驳文化使用基底膜和mTeSR1的介质。
- hiPSC殖民地隔离前准备MEF的板取出成纤维细胞生长mediu米，用PBS漂洗MEFs中，以去除胎牛血清的痕迹。随后添加0.5毫升胚胎中（或mTeSR1在基底膜涂井的情况下中等），10μM的岩石抑制剂Y27632每口井的7,8。
- 如有必要，删除安装在层流罩（图2A - C），在显微镜下用21号针头hiPSC菌落周围成纤维细胞。用PBS冲洗板，并添加含有TRA-1-81 StainAlive特异性抗体（1:200，Stemgent）新鲜胚胎媒体。 30分钟后，更换含有抗体，辅以10微米ROCK抑制剂与新鲜胚胎媒体的媒体。荧光显微镜下检查板和标志TRA-1-81使用客观指标（图2D）的阳性克隆。
- 切割TRA-1-81阳性，在显微镜下hiPSC殖民地成若干小块，在层流罩，使用21号针头，图2E和F所示
- 到IND使用一个hiPSC殖民地自动移液器（P200的）转让片段MEFs中或Matrigel的24孔板ividual井。避免非臀部细胞转移。放置在37℃，5％ 二氧化碳培养箱板和允许的hiPSC殖民地重视24-36Ĥ。
- 变化胚胎或mTeSR1的（基底膜上生长的菌落）媒体每天。正确的胚胎样形态hiPSC殖民地将是可见的48小时后的首次转移到24孔板。
- 手动通过hiPSC菌落每6 - 8天到12，随后在6孔板。
- 克隆扩增和建立hiPSC行后，分析多能性标志使用，如在图3所示的免疫细胞化学TRA-1-60，SSEA-4，OCT3 / 4，Sox2和Nanog的表达。评估基因组的完整性和分化潜力的利用核型畸胎瘤形成分析6,9线。
4。代表结果
逆转录病毒包含媒体我的有效传导小号重新编程成功的关键。这是推荐使用的GFP表达病毒每一个单一的重新编程实验监测效率，如在图1所示进行整个转染/感染过程。的GFP表达病毒滴度测定，描述通过使用非浓缩病毒通常在0.5的范围是媒体的人成纤维细胞的转导，在10 - 5×10 7（VP /毫升），每毫升的病毒颗粒。
成纤维细胞形态的改变早在2天之后，最后感染。胰酶消化人类成纤维细胞前应仔细计算播种MEF饲养细胞。建议3（6X10 1.2X10 4，3，每单2.5×10 4 6孔板）不同密度的种子细胞，因为每个细胞株显示不同的生长特性和播种密度为重编程的效率是至关重要的。丁酸钠的使用最初的7 - 14天内重整，提高效率hiPSC形成约5倍。频繁，尤其是当感染成纤维细胞接种密度较高，成纤维细胞样细胞可长满培养皿覆盖hiPSC殖民地如图2A所示。在这种情况下，成纤维细胞层，可仔细解除和拆下来揭开hiPSC殖民地（图2B）。随后，hiPSC殖民地应冲洗胚胎媒体和TRA-1-81抗体染色。根据成纤维细胞，约20 - 40％的展示与IPSC的类似形态的殖民地不与TRA-1-81抗体染色。从一个板块在未来12 - 24小时，确定hiPSC殖民地可以转让。长时间的潜伏期会导致迅速分化hiPSCs。殖民地可以手动代到要么MEF饲养细胞或基底膜涂层钢板。扩建后成立hiPSC克隆使用的pluripoten表达的免疫组化（国际刑事法院应测试）CY标志物，如在图3所示。此外，生成的iPS细胞系进行了详细的分子特性应包括：利用RT-PCR，DNA去甲基化的示范发起人全能性基因和转基因沉默9分析的全能性基因表达分析。
图1。决定使用两个GFP逆转录病毒的媒体连续感染后表达绿色荧光蛋白逆转录病毒 （甲，乙）成人弗里德的共济失调患者成纤维细胞（GM03665，Coriell库），可视化的病毒转导效率 。 （C和D）人成纤维细胞感染了同一批次的绿色荧光蛋白逆转录病毒的媒体直接上1小时6井1600克板细胞离心。图像感染后48小时被抓获。
图2。识别和隔离hiPSC殖民地。（一）第一阶段包含板由成纤维细胞包围hiPSCs对比度的图像。细胞培养为胚胎媒体21天。 （乙，丙）拆除后，周围的成纤维细胞层相同hiPSC殖民地。 （四）正确地重新编程hiPSC殖民地现场TRA-1-81表面标记抗体染色，切使用无菌注射针（，E，F）和24孔板转移到单独的井。
图3。全能性的特定标志OCT3 / 4，SOX2，NANOG，SSEA4和TRA-1-60在hiPSCs表达测定采用免疫细胞化学。
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Discussion
研究人类，特别是神经系统和神经退行性疾病，已特别具有挑战性由于交通不便足够的人体细胞模型。容易取得的体细胞重新编程为诱导多能干细胞和潜在能力，分化成多种细胞类型，开了一家可能造成遗传性疾病的细胞模型。此外，iPS细胞保持在再生医学的未来大有希望。因此，它是必不可少的重编程体细胞全能性的可靠，高效，安全的方法来开发和优化。
从治疗应用的角度来看，关键是发展IPSC的一代缺乏安全的方法在宿主基因组的足迹突变。体细胞的方法，没有引入的永久性改变，如附加体式载体的转基因重新编程的细胞重新编程，使用应纳税TRA的nsposons，腺病毒感染，已经建立了直接交付的基因或蛋白质11-15。迄今为止使用这些转基因的方法是重新编程效率低和重新编程细胞的性质，类型和年龄而定。因此，这些协议是不适合下旬通过重新编程成年体细胞经常沉积在细胞库。此外，使多个IPSC线的详细描述，并建立新的人类疾病模型和进行高通量药物屏幕，使用病毒载体转录因子的体细胞重新编程，是一个适当的战略。到目前为止，20多个研究报告的模型人体的神经和神经肌肉疾病患者的具体iPSCs的一代。在所有，但一个情况下产生的iPS细胞用慢病毒或逆转录病毒转导16。
我们的数据表明，一个简单的协议，根据对日逆转录病毒交付的E OSKM转录因子可用于成人的成纤维细胞，甚至高的通道，有效地改编。从单一的10厘米的板凤凰细胞转染获得的病毒数量超过10个重新编程实验是足够的。我们重新编程成年成纤维细胞的协议中有三个关键步骤：（一）促进高效的病毒转导，这极大地提高了转导效率的传导过程中的额外的离心步骤;（二）转成纤维细胞种植密度上的MEFs中（ iii）使用活染色与TRA-1-81标记的抗体，以方便选择可能完全重新编程，可直接转移到馈线文化殖民地。丁酸钠的重编程过程中使用的第二个星期的重新编程的效率显着增强。此外，我们观察到更大的分数了IPSC的殖民地，在培养药物的存在可以扩展到完全重新编程的IPSC的线路建立。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
这项工作得到了弗里德的共济失调研究联盟和阿诺德家庭基金会和MD安德森癌症中心的干细胞和发育生物学中心的试点补助金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| KSR | Invitrogen | 10828 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 | |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8628 | |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S | |
| Tra-1-60 antibody | EMD Millipore | MAB4360 | |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S | |
| SSEA4 | EMD Millipore | MAB4304 | |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G | |
| Objective marker | Nikon Instruments | MBW10010 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 05850 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Fugene 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Object marker | Nikon Instruments | MBW10010 |
References
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