Summary
우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.
Abstract
여기에 우리가 1-3 나트륨 butyrate의 면전에서 Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 retroviral 벡터를 사용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC)로 인간 성인 섬유아 세포를 프로그래밍의 프로토콜을 제시한다. 우리는 늦게까지 통로를 재설정하는 데이 방법을 사용 (> p10) Friedreich 운동 실조증 환자에서 파생된 인간의 성인 섬유아 세포 (GM03665, Coriell 리포지 토리). 프로그래밍 접근 방식은 바이러스를 함유 미디어의 면전에서 섬유아 세포의 반복적인 원심 분리를 사용하여 고효율 형질 도입 프로토콜을 포함한다. 다시 프로그램 hiPSC의 식민지가 Tra-1-81 실시간으로 immunostaining를 사용하여 확인되었다 pluripotent 세포 표면 마커가 아닌 다시 프로그램 섬유아 세포에서 분리하고 수동 4,5 passaged. 이러한 hiPSC 그런 다음 Matrigel 접시에 양도하고 직접 프로그래밍을 접시에서, 피더없는 조건에서 재배되었다. 첫 번째 통로부터는 hiPSC의 식민지는 hES - 내가 특성 입증IKE 형태. 이 프로토콜을 사용하여 선택한 식민지 이상의 70 %는 성공적으로 확장과 셀 라인으로 작성할 수도 있습니다. 설립 hiPSC 라인 표면 마커 TRA-1-60 SSEA-4뿐만 아니라 핵 마커 Oct3 / 4, Sox2와 Nanog 포함하여 특색있는 pluripotency 마커를 표시합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 설립 Friedreich 운동 실조증 환자 및 제어 개인 6, 인간의 신생아 섬유아 세포뿐만 아니라, 인간 keratinocytes에서 얻은 성인 섬유아 세포를 사용하여 테스트되었습니다.
Protocol
1. 바이러스 생산과 형질 도입
- DMEM 배지 (DMEM 높은 포도당, inactivated 10% FBS 열, 2 개의 MM L-글루타민, 아니 항생제)의 10 ML에서 ~ 7-8x10과 6 당 10cm 판의 밀도에 플레이트 피닉스 Ampho 세포. 37 야간 보육 및 문화 플레이스 ° C에서 5 % CO 2.
- 12 벡터 인코딩 μg 중 Oct3 / 4, Sox2, Klf4, C-myc, 또는 GFP 유전자 (Addgene plasmids 17,217, 17,218, 17,219, 17,220) 35 μl Fugene 6.를 사용하여 다음 날 transfect 피닉스 세포 DMEM 배지 (DMEM 높은 포도당, 2 밀리미터 L-글루타민, 아니 FBS와 항생제) 500 μl에 transfection 믹스를 준비합니다. 20 분 알을 품다. 부드럽게 70-80% 합류 피닉스 세포를 포함 10cm 플레이트로의 DNA 단지를 피펫.
- 8 H 페니실린과 스트렙토 마이신을 포함한 DMEM 배지 (DMEM 높은 포도당, inactivated 10% FBS 열, 2 개의 MM L-글루타민)과 사후 transfection - 미디어 6 바꿉니다.
- 그 후 수집, 바이러스를 포함하는 12 미디어 4 번 H간격은 모든 부분을 하나로 합치는 분리된 세포 파편 (바이러스 입자를 포함하는 미디어가 그러나 동결을 권장하지 않습니다, 전염성 활동을 잃지 않고 2 주 동안 냉장고에 보관하실 수 있습니다) 제거 필터 0.45 μm의를 사용하여 필터링된.
- retroviral 미디어 컬렉션의 마지막 날 이전 냉동 주식 24 H에서 retroviral 형질 도입, 플레이트 인간 성인 섬유아 세포 (통로 10, Coriell 연구소)의 경우. 종자는 DMEM 높은 포도당에 잘 당 밀도를 1x10 5 세포에서 6 - 잘 젤라틴 덮여 접시에 세포를 10 % FBS, 2 개의 MM L-글루타민, 페니실린, 스트렙토 마이신 및 비 필수 아미노산.
- 피닉스 세포에서 얻은 바이러스 입자를 포함하는 매체와 다음 날 대신할 DMEM 미디어. 위해 1천6백그램에서 fibroblast의 문화와 원심 분리기의 6 잘 플레이트의 각도에 6 μg / polybrene의 ML과 보완 바이러스 미디어를 (1 각 Oct4의 ML, Sox2, Klf4, 그리고 C-myc 미디어, 4 ML 총) 추가 20 1H ° C. 약 12 H AFter 형질 도입은 fibroblast 문화 매체와 입소문 미디어를 대체합니다. 24 H 간격의 바이러스성 감염과 원심 분리 3 회를 수행합니다.
- 마지막으로 감염 후 48 H에 대한 DMEM 미디어 문화 섬유아 세포. GFP를 표현 retroviral 매체와 병렬 transductions에 의해 감염의 효율성을 확인합니다. 그림 1은 인간 fibroblast의 원심 분리-촉진 retroviral 감염의 효율성을 보여줍니다.
2. 프로그래밍
- 당 잘 젤라틴 ~ 2x10 5 세포 밀도에 MEF 세포을 퍼뜨리고하여 γ-조사 MEF 피더 레이어 6 잘 접시를 준비는 fibroblast 성장 매체 6 잘 접시를 취급. 다음날은 섬유아 세포 성장 매체에 당 잘 ~의 밀도에 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 종자들을 1.2x10 4 0.05 %를 사용하여 감염된 인간의 섬유아 세포를 분리.
- 다음날 hES 미디어 (DMEM/F12, 20 % 마네의 세럼의 교환이 아닌 필수 아미노산, penicilli로 미디어 교체N / 스트렙토 마이신, 2 개의 MM L-글루타민, 0.1 MM β-메르 캅 토 에탄올, 20 NG / ML 기저 Fibroblast의 성장 인자 (bFGF), 언어학 재활 치료의 초기 7 일간 0.5 밀리미터 나트륨 butyrate와 보충. 매일 미디어를 변경합니다.
- 일일 transduced 세포의 형태학의 변화를 모니터링합니다. 엉덩이와 같은 세포의 콜로니는 약 5 반발을 시작합니다 - 십일 피더 세포 진입 transduced 섬유아 세포를 전송 후. hiPSC 식민지는 약 14 격리 준비가 - 28 일 MEF 피더 세포에서 그들을 도금 후.
3. hiPSC 식민지의 분리
- hiPSC 식민지를 따기 전에 하루 섬유아 세포 성장 매체의 γ-조사 MEF 피더 세포 (물론 당 ~ 4x10 4 세포)와 함께 24 잘 접시를 준비합니다. 이 단계에서는 hiPSC의 식민지도 Matrigel과 mTeSR1 매체를 사용하여 피더 무료 문화에 전송할 수 있습니다.
- hiPSC 콜로니를 분리하기 전에는 섬유아 세포 성장 mediu을 제거하여 MEF 플레이트를 준비M 및 FBS의 흔적을 제거하는 PBS로 MEFs을 rinsing. 그 후 각 잘 7,8에 10 μm의 록 억제제 Y27632와 0.5 ML hES 매체 (혹은 Matrigel 코팅 우물의 경우 mTeSR1 중간)에 추가합니다.
- 필요한 경우, 층류 후드 (- C 그림 2A)에 마운트 현미경으로 21 게이지 바늘로 hiPSC 식민지를 둘러싼 섬유아 세포를 제거합니다. PBS로 번호판을 씻어하고 Tra-1-81 StainAlive 특정 항체 (1:200, Stemgent)를 포함하는 신선한 hES 미디어를 추가합니다. 후 30 분., 10 μm의 바위 억제제 보충 신선한 hES 미디어와 항체를 포함하는 미디어를 대체합니다. 형광 현미경으로 접시를 검사 마크 Tra-1-81 객관적인 마커 (그림 2D)를 사용하여 긍정적인 식민지.
- 그림 2E와 F. 같이 21 게이지 바늘을 사용하여 여러 개의 작은 조각으로 판상 후드의 현미경 Tra-1-81 긍정 hiPSC 식민지를 잘라내기
- 공업로 hiPSC 식민지의 자동 피펫 (P200) 전송 조각을 사용하여MEFs 혹은 Matrigel과 24 잘 접시의 ividual 우물. 비 허리 세포를 전송하지 마십시오. 37 ° C 5 % CO 2 배양기에 플레이트를 삽입하고 hiPSC 식민지가 24-36 H 위해 연결할 수 있습니다.
- 변경 hES 또는 mTeSR1 (Matrigel에 성장 식민지 용) 미디어 일상. 올바른 hES 같은 형태로 hiPSC 식민지는 24도 판 진입 초기 전송 후 48 H 표시됩니다.
- 수동으로 통과 hiPSC의 식민지 매 6 - 12 잘하고 이후 6 - 잘 접시를 향해 팔일.
- clonal 확장과 hiPSC 라인을 맺은 후 그림 3과 같이 immunocytochemistry를 사용 pluripotency 마커 TRA-1-60, SSEA-4, Oct3 / 4, Sox2와 Nanog의 표현을 분석합니다. 게놈 무결성 및 핵형 및 teratoma 형성 분석 6,9를 사용하여 얻을 라인의 분화 잠재력을 평가하십시오.
4. 대표 결과
레트로 바이러스-포함된 미디어를 내가 가진 효율적인 형질 도입의 성공적인 언어학 재활 치료에 중요합니다. 그것은 그림 1과 같이 효율성을 모니터링하는 바이러스마다 하나의 프로그래밍을 실험을 표현 GFP를 사용하여 전체 transfection / 감염 절차를 수행하는 것이 좋습니다. 일반적으로 0.5의 범위에 비 집중 바이러스 미디어를 사용하는 인간 섬유아 세포의 형질 도입을 통해, 10에서 설명한대로 GFP 표현 바이러스의 titer는 결정 - 5 × 10 ML (VP / ML) 당 7 바이러스성 입자.
섬유아 세포는 지난 감염 후 빠르면 이일과 같은 형태로 변경합니다. Trypsinized 인간 섬유아 세포는 신중하게 MEF 피더 세포에 그들을 퍼뜨리고하기 전에 계산해야합니다. 각 세포주 서로 다른 성장 특성을 보여주고 시딩 밀도 프로그래밍의 효율성에 중요한지 3 가지 밀도 (6x10 3, 1.2x10 4, 6 잘 접시의 잘 단일 당 2.5x10 4)에서 씨앗 세포를 권장합니다. 에 사용되는 나트륨 butyrate초기 7 - 프로그래밍 14 일 hiPSC 형성 약 5 배의 효율성을 증가시킵니다. 자주, 감염된 섬유아 세포가 고밀도로 놓는되었다 특히, fibroblast 같은 세포는 배양 접시를 자라다와 그림 2A와 같이 hiPSC 식민지를 커버하실 수 있습니다. 이 경우, fibroblast 계층은 신중하게 드러내기 시작하고 hiPSC의 식민지 (그림 2B)을 밝히기 위해서 제거할 수 있습니다. 그 후, hiPSC의 식민지 hES 미디어 씻어서 Tra-1-81 항체 물들일한다. fibroblast 세포에 따라 약 20 - iPSC 같은 형태로 보여주는 식민지의 40 %는 Tra-1-81 항체와 착색하지 않습니다. 24 - 확인된 hiPSC 식민지는 앞으로 12 시간 이내 접시에서 전송할 수 있습니다. 장기 배양은 hiPSCs의 급속한 분화집니다. 식민지는 수동 MEF 피더 세포 혹은 Matrigel - 코팅 접시 하나에 passaged 수 있습니다. 확장 설립 후 hiPSC의 클론은 pluripoten의 표현을 위해 immunocytochemistry (ICC)를 사용하여 테스트해야그림 3에서 보여준대로 싸이가 마커. 또한, 생성된 IPS 세포 라인에 대한 자세한 분자 특성을 포함한다 : RT-PCR, 9 입을 transgenes의 pluripotency 유전자와 분석의 발기인의 DNA의 demethylation의 데모를 사용 pluripotency 유전자 발현의 분석.
1 그림. GFP retroviral 매체와 연속 2 감염 후 GFP 표현 레트로 바이러스. (A, B) Friedreich 운동 실조증 환자에서 파생된 인간 성인 섬유아 세포 (GM03665, Coriell 저장소)는 시각있었습니다을 사용하여 결정 바이러스 형질 도입의 효율. (C, D) 인간 섬유아 세포를 직접 1천6백g에서 1 시간을위한 6 자 접시에있는 세포를 원심 분리에 의해 다음 GFP retroviral 미디어 동일한 일괄 처리에 감염되었다. 이미지는 감염 이후에 48h를 점령했다.
그림 2. hiPSC 식민지의 식별 및 분리. () 섬유아 세포에 둘러싸여 hiPSCs를 포함하는 접시의 위상 콘트라스트 이미지입니다. 세포는 hES 미디어 21 일간 배양해되었다. 주변 fibroblast 계층의 제거 후 (B, C) 같은 hiPSC 식민지. (D) 올바르게 다시 프로그램 hiPSC 식민지가 Tra-1-81 표면 마커 항체 라이브 염색법에 의해 식별되며, 무균 바늘 (E, F)을 사용하여 절단 및 24도 접시의 별도의 우물로 전학 왔어.
그림 3. pluripotency 특정 마커 Oct3 / 4, Nanog, Sox2, SSEA4 및 hiPSCs의 Tra-1-60 표현은 immunocytochemistry에 의해 결정되었다.
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Discussion
특히 신경 및 neurodegenerative 인간의 질병, 유학, 특히 충분한 사람 세포 모델의 어려움으로 인해 도전되었습니다. 다양한 세포 유형으로 그들을 차별 유도된 pluripotent 줄기 세포의 가능성에 쉽게 얻을 체세포를 재설 정할 능력은 유전 질병 세포 모델을 만들 수있는 가능성을 열었습니다. 또한, iPSCs은 재생 의료의 미래에 큰 약속을 누르고 있습니다. 따라서 pluripotency로 체세포를 프로그래밍의 안정적인 효율적이고 안전한 방법을 개발하고 최적화하기 위해 필수적입니다.
치료적 응용 프로그램의 관점에서 그것은 호스트 게놈에 풋프린트 변이 부족 iPSC 세대의 안전한 접근법을 개발하는 것이 매우 중요합니다. 이러한 episomal 벡터의 transfection 등 다시 프로그램 세포의 게놈에 영구적인 변경을 도입하지 않고 프로그래밍을 체세포의 방법은 excisable tra의 사용nsposons, adenoviral 감염, 그리고 mRNA 또는 단백질의 직접적인 전달은 이미 11-15 설립되었습니다. 지금까지 이러한 transgene없는 방법을 사용하여 프로그래밍 효율이 낮습니다 그리고 다시 프로그램 체세포 세포의 문자 유형과 연령에 따라 달라집니다. 따라서 이러한 프로토콜을 늦게 통과를 프로그래밍에 적합하지, 성인 체세포 자주 세포 저장소로 입금. 또한 여러 iPSC 라인의 세부적인 특성을 활성화하고 인간의 질병의 새로운 모델을 확립하고 전사 요인 바이러스 전송을 사용하여 체세포의 프로그래밍, 높은 처리량 약물 화면을 진행하는 것은 적절한 전략이다. 20 개 이상의 연구와 데이트를하기 위해서는 모델이 인간의 신경계 및 신경근육학 질환 환자의 특정 iPSCs의 생성을보고했다. 하나를 제외한 모든 경우에 iPSCs는 lentiviral 또는 retroviral 형질 도입 16를 사용하여 생성되었습니다.
당사의 데이터를 보여주는 그 일을 기준으로 간단한 프로토콜OSKM 전사 요인 전자 retroviral 전달이 효율적으로 심지어 높은 통과 성인 인간의 섬유아 세포를 재설정하는 데 사용할 수 있습니다. 10cm 플레이트에서 피닉스 세포의 단일 transfection에서 얻은 바이러스의 금액은 10 개 이상의 프로그래밍을 실험을하기에 충분 해요. 성인 섬유아 세포 우리의 프로그래밍 프로토콜 세 중요한 단계가 있습니다 : 극적으로 형질 도입의 효율을 증가 형질 도입하는 동안 추가로 원심 분리 단계에 의해 촉진은 (i) 고효율 바이러스 형질 도입, (ii) 본 심는 MEFs쪽으로 transduced fibroblast의 밀도와 ( 3) 직접 피더없는 문화로 전송하실 수 있습니다 잠재적으로 완전하게 다시 프로그램 식민지의 선택을 촉진하기 Tra-1-81 표지 항체와 라이브 염색법을 사용하지 않습니다. 프로그래밍의 효율성이 크게 언어학 재활 치료의 두 번째 주 동안 나트륨 butyrate를 사용하여 개선되었습니다. 더욱이, 우리는 iPSC 식민지의 큰 분수가에서 배양해 것을 관찰약물의 존재는 확대하고 완전히 다시 프로그램 iPSC 라인으로 작성할 수도 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 Friedreich 운동 실조증 연구 얼라이언스과 아놀드 가족 재단과 줄기 세포 및 MD 앤더슨 암 센터에서 발달 생물학을위한 센터에서 시범 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| KSR | Invitrogen | 10828 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 | |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8628 | |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S | |
| Tra-1-60 antibody | EMD Millipore | MAB4360 | |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S | |
| SSEA4 | EMD Millipore | MAB4304 | |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G | |
| Objective marker | Nikon Instruments | MBW10010 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 05850 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Fugene 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Object marker | Nikon Instruments | MBW10010 |
References
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