Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für die effiziente Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in die menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) und Identifizierung von richtig umprogrammiert hiPSC durch Live-Färbung mit Tra- 1-81 Antikörper ist.
Abstract
Hier präsentieren wir ein Protokoll der Reprogrammierung erwachsener Mensch menschlichen Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) in Gegenwart von Natriumbutyrat 1-3. Wir verwendeten diese Methode, um spät Passage neu zu programmieren (> P10) humanen adulten Fibroblasten von Friedreich-Ataxie Patienten abgeleitet (GM03665, Coriell Repository). Die Umprogrammierung beinhaltet hoch effiziente Transduktion Protokoll unter Verwendung von Fibroblasten wiederholte Zentrifugation in Gegenwart von Virus-enthaltenden Medien. Die modifizierte hiPSC Kolonien identifiziert wurden unter Verwendung lebender Immunfärbung für Tra-1-81, ein Oberflächenmarker von pluripotenten Zellen, aus nicht-programmiert Fibroblasten getrennt und manuell passagiert 4,5. Diese hiPSC wurden dann auf Matrigel Platten übertragen und aufgewachsen in Feeder-freien Bedingungen, direkt aus der Umprogrammierung Platte. Ab dem ersten Durchgang, demonstrieren hiPSC charakteristische Kolonien hES-like Morphologie. Unter Verwendung dieses Protokolls mehr als 70% der ausgewählten Kolonien erfolgreich ausgeweitet und festgesetzt werden, in Zelllinien. Die etablierten hiPSC Linien angezeigt charakteristischen Markern für Pluripotenz einschließlich Oberflächenmarker TRA-1-60 und SSEA-4, sowie nukleare Marker Oct3 / 4, Sox2 und Nanog. Das hier vorgestellte Protokoll wurde eingerichtet und getestet mit adulten Fibroblasten von Friedreich-Ataxie Patienten und Kontrollpersonen 6, menschlichen Neugeborenen Fibroblasten, sowie menschliche Keratinozyten erhalten.
Protocol
1. Virus Produktion und Transduktion
- Tafel Phoenix Ampho-Zellen bei einer Dichte von ~ 7-8x10 6 pro 10 cm Platte in 10 ml DMEM-Medium (DMEM hohe Glucose, 10% Hitze-inaktiviertem FBS, 2 mM L-Glutamin, keine Antibiotika). Platz im Inkubator und Kultur über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Am nächsten Tag Transfektion Phoenix Zellen unter Verwendung von 12 ug einem Vektor, der entweder Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc oder GFP-Gen (Addgene Plasmide 17.217, 17.218, 17.219, 17.220) und 35 ul Fugene 6. Planen Transfektionsgemisch in 500 ul DMEM-Medium (DMEM hohe Glucose, 2 mM L-Glutamin, nicht FBS und Antibiotika). Inkubieren 20 min. Vorsichtig pipettieren DNA-Komplexe in die 10 cm-Platten mit 70-80% konfluenten Phoenix-Zellen.
- Ersetzen Medien 6 - 8 h nach der Transfektion mit DMEM-Medium (DMEM high glucose, 10% FBS hitzeinaktiviertem, 2 mM L-Glutamin) mit Penicillin und Streptomycin.
- Anschließend sammeln Virus-haltigen Medien 4-mal in 12 hIntervalle, kombinieren alle Teile und durch ein 0,45 um-Filter, um abgelösten Zellen und Ablagerungen (Medien mit viralen Partikeln kann im Kühlschrank bei 2 Wochen, ohne dass infektiöse Aktivität gehalten werden, jedoch Einfrieren wird nicht empfohlen) entfernen.
- Für retrovirale Transduktion, Platte humanen adulten Fibroblasten (Passage 10, Coriell Laboratories) aus einem gefrorenen Lager 24 h vor dem letzten Tag des retroviralen Mediensammlung. Seed die Zellen auf 6-Loch-Platten abgedeckt Gelatine mit einer Dichte 1x10 5 Zellen pro Vertiefung in DMEM hohe Glucose, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin, Streptomycin und nicht-essentiellen Aminosäuren.
- Am nächsten Tag Ersatz DMEM-Medium mit Medien, die viralen Partikel aus Phoenix-Zellen erhalten. Fügen Sie viralen Medien (1 ml jeder Oct4, Sox2, Klf4, und c-myc-Medien, insgesamt 4 ml) mit 6 pg / ml Polybren in jedes Well der 6-Well-Platte der Fibroblasten-Kulturen und Zentrifuge ergänzt bei 1600g für 1h bei 20 ° C Etwa 12 h after die Transduktion, ersetzen Sie die viralen Medien mit Fibroblasten-Kulturmedium. Führen Virusinfektion und Zentrifugation 3-mal in 24 h Intervallen.
- Kultur Fibroblasten in DMEM-Medium für 48 h nach der letzten Infektion. Die Effizienz der Infektion durch parallele Transduktionen mit einem retroviralen Medien, die GFP exprimieren. 1 zeigt die Effizienz der Zentrifugation erleichtert-retroviralen Infektion von humanen Fibroblasten.
2. Reprogrammierung
- Planen 6-Well-Platten mit γ-bestrahlten MEF-Feeder-Schichten durch Impfen MEF-Zellen bei einer Dichte von ~ 2x10 5 Zellen pro Vertiefung der Gelatine behandelten 6-Well-Platte in Fibroblasten-Wachstumsfaktor Medium. Am folgenden Tag aufgeteilt infizierten menschlichen Fibroblasten unter Verwendung von 0,05% Trypsin / EDTA und entkernen mit einer Dichte von ~ 1.2x10 4 pro auch in der Fibroblasten Wachstumsmedium.
- Am nächsten Tag ersetzen Medien mit hES-Medien (DMEM/F12, 20% Knockout Serumersatz, nicht-essentielle Aminosäuren, penicillin / Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 20 ng / ml basalen Fibroblast Growth Factor (bFGF), ergänzt mit 0,5 mM Natriumbutyrat für die ersten 7 Tage nach Umprogrammierung. Ändern Medien täglich.
- Überwachen morphologischen Veränderungen in transduzierten Zellen täglich. Kolonien von HIPS-ähnlichen Zellen beginnt zu entstehen ca. 5 - 10 Tage nach der Übertragung der transduzierten Fibroblasten auf Feeder-Zellen. Die hiPSC Kolonien sind bereit, rund 14 isoliert werden - 28 Tage nach dem Ausplattieren sie auf den MEF-Feeder-Zellen.
3. Isolierung von Kolonien hiPSC
- Einen Tag vor Aufnahme der hiPSC Kolonien herzustellen 24-Well-Platten mit γ-bestrahlten MEF Feeder-Zellen (~ 4x10 4 Zellen pro Vertiefung) in Fibroblasten Wachstumsmedium. In diesem Stadium hiPSC Kolonien können auch auf Feeder-freien Kultur mit Matrigel und mTeSR1 Medium übertragen werden.
- Vor der Isolierung des hiPSC Kolonien herzustellen MEF Platten durch Entfernen Fibroblasten Wachstum Medium und Spülen mit PBS MEFs, um Spuren von FBS zu entfernen. Anschließend werden 0,5 ml HES Medium (oder mTeSR1 Mediums im Falle von Matrigel beschichteten Vertiefungen) mit 10 pM ROCK-Inhibitor Y27632 in jede Vertiefung 7,8.
- Falls erforderlich, die rund um die Fibroblasten hiPSC Kolonien mit einem 21-Gauge-Nadel unter einem Mikroskop in einem Abzug mit laminarer Strömung (2A - C) angebracht ist. Spülen Sie die Platten mit PBS und fügen frische hES-Datenträger mit dem Tra-1-81 StainAlive spezifischen Antikörper (1:200, Stemgent). Nach 30 min., Ersetzen Sie Medien, die den Antikörper mit frischen hES-Medien mit 10 uM ROCK-Inhibitor ergänzt. Untersuchen Sie die Platten unter dem Fluoreszenzmikroskop und Tra-Marke von 1 bis 81 positive Kolonien mit Hilfe einer objektiven Marker (2D).
- Schneiden Sie die Tra-1-81 positive hiPSC Kolonien unter dem Mikroskop in einer Laminar-Haube, in mehrere kleine Stücke mit einer 21-Gauge-Nadel wie in 2E gezeigt und F.
- Verwendung einer automatischen Pipette (P200) Transfer Fragmente von hiPSC Kolonien in individual Vertiefungen der 24-Well-Platte mit MEFs oder Matrigel. Vermeiden Sie die Übertragung nicht-HIPS-Zellen. Legen Sie die Platten in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator und lassen Sie die hiPSC Kolonien für 24-36 h zu befestigen.
- Ändern HES oder mTeSR1 (für Kolonien auf Matrigel gewachsen) Medien täglich. Die Kolonien mit hiPSC richtige HES-Morphologie sichtbar 48 h nach der ersten Übertragung auf einer 24-Well-Platte.
- Manuelles Durchgang hiPSC Kolonien alle 6 - 8 Tage auf einer 12-Well und anschließend auf einem 6-Well-Platte.
- Nach klonale Expansion und zur Festlegung hiPSC Linien, zu analysieren Expression von Markern für Pluripotenz TRA-1-60, SSEA-4, Oct3 / 4, Sox2 und Nanog Verwendung von Immunocytochemie wie in 3 gezeigt. Bewerten genomischen Integrität und Differenzierungspotential der erhaltenen Linien mit Karyotyp und Teratombildung Analysen 6,9.
4. Repräsentative Ergebnisse
Effiziente Transduktion mit Retrovirus-haltigen Medien is die für den erfolgreichen Reprogrammierung. Es wird empfohlen, den gesamten Transfektion / Infektion Verfahren durchzuführen unter Verwendung eines GFP-exprimierenden Virus jede einzelne Anpassung Experiment, um die Effizienz zu überwachen, wie in 1 gezeigt. Der Titer des GFP-exprimierenden Virus bestimmt, wie in 10 beschrieben, durch die Transduktion von humanen Fibroblasten mit nicht-konzentrierten viralen Medien lag typischerweise im Bereich von 0,5 - 5 x 10 7 Viruspartikeln pro ml (vp / ml).
Fibroblasten ändern Morphologie bereits 2 Tage nach der letzten Infektion. Trypsiniert humanen Fibroblasten sollte sorgfältig gezählt werden, bevor sie auf die Aussaat MEF Feeder-Zellen. Es ist zu Samenzellen bei 3 verschiedenen Dichten (6x10 3, 4 1.2x10, 2.5x10 4 pro einzelnes Loch einer 6-Well-Platte) empfohlen, da jeder Zelllinie zeigt verschiedene charakteristische Wachstum und Aussaatdichte ist entscheidend für die Effizienz der Reprogrammierung. Natriumbutyrat für die Verwendungersten 7 - 14 Tagen der Umprogrammierung erhöht die Effizienz der Bildung hiPSC ca. 5 fache. Häufig, insbesondere wenn infizierte Fibroblasten in höherer Dichte ausgesät wurden, können die Fibroblasten-ähnliche Zellen überwachsen eine Kulturschale und decken hiPSC Kolonien in 2A gezeigt. In diesem Fall kann die Fibroblasten-Schicht vorsichtig angehoben werden und entfernt, um hiPSC Kolonien (2B) aufzudecken. Anschließend sollte hiPSC Kolonien mit hES-Medien gespült werden und gefärbt mit Tra-1-81 Antikörper. Abhängig von den Fibroblasten-Zellen, ca. 20 - 40% der Kolonien demonstriert mit IPSC-Morphologie nicht mit Tra-1-81 Antikörper färben. 24h - identifiziert hiPSC Kolonien können aus einer Platte innerhalb der nächsten 12 übertragen werden. Längerer Inkubation wird in schnelleren Differenzierung von hiPSCs führen. Die Kolonien können entweder manuell auf Feeder-Zellen oder MEF Matrigel-beschichteten Platten passagiert werden. Nach der Expansion etabliert hiPSC Klone sollte getestet mit Immunzytochemie (ICC) für die Expression von pluripoten werdency-Marker wie in Abbildung 3 gezeigt. Zusätzlich sollte eine detaillierte molekulare Charakterisierung der erzeugten iPS-Zelllinien umfassen: Analysen der Pluripotenz Genexpression mittels RT-PCR, Demonstration der DNA-Demethylierung bei den Promotoren von Pluripotenz-Gene und-analysen der Transgene Silencing-9.
Abbildung 1. Die Effizienz der virale Transduktion unter Verwendung GFP-exprimierenden Retrovirus ist. (A, B) Humane adulte Fibroblasten, die von Friedreich-Ataxie Patienten abgeleitet (GM03665, Coriell Repository) wurden sichtbar nach zwei aufeinander folgenden Infektionen mit GFP retroviralen Medien. (C, D) Humane Fibroblasten wurden mit der gleichen Charge der GFP retroviralen Medien durch Zentrifugation der Zellen direkt auf den Platten mit 6 Vertiefungen für 1 Stunde bei 1600g gefolgt infiziert. Die Bilder wurden 48h nach der Infektion eingefangen.
Abbildung 2. Identifizierung und Isolierung von hiPSC Kolonien. (A) Phasenkontrast-Bild einer Platte mit hiPSCs von Fibroblasten umgeben. Die Zellen wurden für 21 Tage auf hES Medien kultiviert. (B, C) Das gleiche hiPSC Kolonie nach dem Entfernen des umgebenden Fibroblasten-Schicht. (D) korrekt neu programmiert hiPSC Kolonien, die von Live-Färbung mit Tra-Oberfläche 1-81 Marker-Antikörper identifiziert werden, schneiden mit einer sterilen Kanüle (E, F) und in separaten Kammern einer 24-Well-Platte.
3. Expression der Pluripotenz Marker Oct3 / 4, Nanog, Sox2, SSEA4 und Tra-1-60 in hiPSCs wurde durch Immunzytochemie bestimmt.
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Discussion
Studieren menschlicher Krankheiten, insbesondere neurologische und neurodegenerative, wurde eine besondere Herausforderung aufgrund der Unzugänglichkeit der angemessene personelle zellulären Modellen. Die Fähigkeit, leicht erhältlich Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen umprogrammieren und das Potenzial, um sie in verschiedenen Zelltypen differenzieren eröffnet die Möglichkeit, zelluläre Modelle von genetischen Krankheiten zu schaffen. Darüber hinaus halten IPSCs ein großes Versprechen für die Zukunft der regenerativen Medizin. Daher ist es wichtig, zu entwickeln und zu optimieren zuverlässige, effiziente und sichere Methoden zur Reprogrammierung von Körperzellen zu Pluripotenz.
Aus der Sicht von therapeutischen Anwendungen, ist es wichtig, sicher Ansätze iPSC Generation fehlt Footprint Mutationen in das Genom des Wirts zu entwickeln. Verfahren zur Anpassung an somatischen Zellen ohne Einführung ständigen Änderungen in das Genom der umgewandelten Zellen wie Transfektion von episomalen Vektoren, verbrauchsteuerpflichtiger tra verwendennsposons, adenovirale Infektion und direkte Lieferung von mRNA oder Proteinen wurden bereits 11-15 etabliert. So weit die Umprogrammierung Effizienz der Verwendung dieser Transgen-freien Methoden ist gering und hängt von dem Charakter, Art und Alter des somatischen Zellen umprogrammiert. Daher sind diese Protokolle nicht geeignet sind für die Umprogrammierung späten Passage, erwachsene Körperzellen häufig deponiert in Zelle Repositories. Zusätzlich zur detaillierten Charakterisierung von mehreren iPSC Linien zu ermöglichen und um neue Modelle menschlicher Erkrankungen zu schaffen und High-Throughput-Drogen-Bildschirme leiten, Reprogrammierung von somatischen Zellen mit viralen Lieferung von Transkriptionsfaktoren ist eine angemessene Strategie. Um mehr als 20 Studien bis heute berichtet Generation von Patienten-spezifischen IPSCs zu Modell menschlichen neurologischen und neuromuskulären Erkrankungen. In allen Fällen aber ein die IPSCs wurden unter Verwendung lentivirale oder retrovirale Transduktion 16.
Unsere Daten zeigen, dass ein einfaches Protokoll auf Basis von the retrovirale Lieferung von OSKM Transkriptionsfaktoren können verwendet werden, um effizient zu programmieren adulten humanen Fibroblasten, auch von einem hohen Durchgang werden. Die Menge des Virus aus einer Transfektion von Phoenix Zellen auf 10 cm Platte erhalten ist ausreichend für mehr als 10 Anpassung Experimenten. Es gibt drei kritischen Schritte in der Anpassung Protokoll adulten Fibroblasten: (i) hocheffiziente virale Transduktion durch einen zusätzlichen Zentrifugationsschritt bei Transduktion, die dramatisch erhöht die Effizienz der Transduktion erleichtert, (ii) Aussaatdichte von der transduzierten Fibroblasten auf die MEFs und ( iii) von Live-Färbung verwendet mit der Tra-1-81 Marker-Antikörper, um die Auswahl von potenziell vollständig umprogrammiert Kolonien, die direkt an Feeder-freien Kulturen übertragen werden können, zu erleichtern. Die Effizienz der Reprogrammierung wird maßgeblich durch die Verwendung von Natrium-Butyrat zweiten Woche während der Reprogrammierung verbessert. Darüber hinaus beobachteten wir, dass ein größerer Anteil des IPSC Kolonien in den kultiviertendas Vorhandensein der Droge kann ausgebaut und etabliert werden in vollständig neu programmiert iPSC Linien.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Friedreich-Ataxie Research Alliance und einer Pilot-Zuschuss von Arnold Family Foundation und dem Zentrum für Stammzellen und Entwicklungsbiologie am MD Anderson Cancer Center unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| KSR | Invitrogen | 10828 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 | |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8628 | |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S | |
| Tra-1-60 antibody | EMD Millipore | MAB4360 | |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S | |
| SSEA4 | EMD Millipore | MAB4304 | |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G | |
| Objective marker | Nikon Instruments | MBW10010 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 05850 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Fugene 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Object marker | Nikon Instruments | MBW10010 |
References
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