Summary
نقدم لبروتوكول لإعادة برمجة الخلايا الجسدية من كفاءة الإنسان في صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) باستخدام نواقل فيروس ترميز Oct3 / 4، Sox2، Klf4 و C-myc (OSKM) وتحديد hiPSC برمجتها بشكل صحيح عن طريق تلطيخ على الهواء مباشرة مع هيئة تنظيم الاتصالات 1-81 الأجسام المضادة.
Abstract
هنا نطرح على بروتوكول إعادة برمجة الخلايا الليفية بالغ الإنسان في صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) باستخدام نواقل فيروس ترميز Oct3 / 4، Sox2، Klf4 و C-myc (OSKM) في وجود الزبدات الصوديوم 1-3. استخدمنا هذه الطريقة لإعادة برمجة مرور في وقت متأخر (> P10) الليفية الكبار حقوق الإنسان مستمد من المريض رنح فريدريك (GM03665، Coriell مستودع). نهج إعادة برمجة وتشمل كفاءة عالية باستخدام بروتوكول تنبيغ الطرد المركزي المتكررة من الخلايا الليفية في حضور وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس. وقد تم تحديد المستعمرات hiPSC برمجتها باستخدام المناعية الحية لترا-81-1، علامة سطح الخلايا المحفزة، وفصلها عن الخلايا الليفية غير برمجتها وpassaged 4،5 يدويا. ثم تم نقل هذه hiPSC لوحات Matrigel ونمت في ظروف التغذية، مجانا، مباشرة من لوحة إعادة برمجة. ابتداء من المقطع الاول، المستعمرات hiPSC شرح الخصائص HES-Lآيك التشكل. ويمكن استخدام هذا البروتوكول أن أكثر من 70٪ من المستعمرات المختارة بنجاح موسع، وأنشأ في خطوط الخلايا. عرض خطوط أنشئت hiPSC علامات تعدد القدرات المميزة بما في ذلك علامات سطح TRA-1-60 و SSEA-4، فضلا عن علامات النووية Oct3 / 4، وSox2 Nanog. تم تأسيس بروتوكول المقدمة هنا واختبار باستخدام الخلايا الليفية الكبار التي تم الحصول عليها من المرضى رنح فريدريك والأفراد سيطرة 6، الليفية الوليد الإنسان، فضلا عن الخلايا الكيراتينية البشرية.
Protocol
1. إنتاج فيروس وتنبيغ
- لوحة فينيكس الخلايا التقابل في كثافة ~ 7-8X10 6 في لوحة 10 سم في 10 مل من المتوسط DMEM (DMEM الجلوكوز المرتفعة، و 10٪ FBS حرارة المعطل، 2 مم L-الجلوتامين، أي المضادات الحيوية). مكان في الحاضنة والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- في اليوم التالي transfect الخلايا فينيكس باستخدام 12 ميكروغرام من ترميز متجه إما Oct3 / 4، Sox2، Klf4، ج myc، أو GFP الجين (Addgene البلازميدات 17217، 17218، 17219، 17220) و 35 Fugene ميكرولتر 6. إعداد مزيج ترنسفكأيشن في 500 ميكروليتر من وسط DMEM (DMEM الجلوكوز المرتفعة، 2 مم L-الجلوتامين، لا FBS والمضادات الحيوية). احتضان 20 دقيقة. ماصة بلطف المجمعات الحمض النووي في لوحات 10 سم تحتوي على 70-80٪ متكدسة الخلايا فينيكس.
- تحل محل وسائل الاعلام 6-8 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع متوسط DMEM (DMEM الجلوكوز المرتفعة، و 10٪ FBS حرارة المعطل، 2 مم L-الجلوتامين) التي تحتوي على البنسلين والستربتومايسين.
- في وقت لاحق، وجمع من الفيروسات التي تحتوي على وسائل الاعلام 4 مرات في 12 ساعةفترات، والجمع بين جميع أجزاء وتصفيتها باستخدام ميكرومتر 0.45 فلتر لإزالة خلايا منفصلة والحطام (يمكن أن تظل وسائل الإعلام التي تحتوي على جزيئات فيروسية في الثلاجة لمدة 2 اسابيع دون ان تفقد نشاط المعدية، ولكن لا ينصح التجميد).
- للفيروسات الليفية تنبيغ لوحة، وبالغ الإنسان (مرور 10، Coriell مختبرات) من 24 ساعة المجمدة الأوراق المالية قبل اليوم الأخير من جمع وسائل الاعلام فيروسات. بذور الخلايا على 6 لوحات مغطاة بشكل جيد الجيلاتين في الخلايا كثافة 5 1x10 لكل بئر في جلوكوز DMEM عالية، و 10٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، البنسلين، الستربتومايسين وغير الأساسية والأحماض الأمينية.
- البديل اليوم التالي DMEM وسائل الاعلام مع وسائل الإعلام التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية التي تم الحصول عليها من خلايا فينيكس. إضافة وسائل الاعلام الفيروسية (1 مل من كل Oct4، Sox2، Klf4، و C-myc وسائل الاعلام، 4 مل الكل) تستكمل مع 6 ميكروغرام / مل من polybrene إلى كل بئر من لوحة 6 جيدا لثقافات الليفية وأجهزة الطرد المركزي في ل1600g 1H عند 20 درجة مئوية. ما يقرب من 12 ساعة بالعربيةثالثا في تنبيغ، تحل محل وسائل الاعلام الفيروسية مع الثقافة المتوسطة الليفية. أداء عدوى فيروسية والطرد المركزي 3 مرات في فترات 24 ساعة.
- الليفية ثقافة في وسائل الاعلام DMEM لمدة 48 ساعة بعد الإصابة الأخيرة. تحقق كفاءة العدوى عن طريق transductions بالتوازي مع وسائل الاعلام معربا عن فيروسات GFP. ويوضح الشكل 1 كفاءة الطرد المركزي التي تيسرها عدوى فيروس من الخلايا الليفية الإنسان.
2. إعادة برمجة
- يعامل إعداد 6 لوحات بشكل جيد مع γ-المشع طبقات التغذية MEF بواسطة بذر خلايا MEF في مناطق ذات كثافة الخلايا 2x10 5 ~ لكل بئر من الجيلاتين 6 لوحة جيدا في المتوسط نمو الخلايا الليفية. انقسام في اليوم التالي الليفية الإنسان بالعدوى باستخدام 0.05٪ التربسين / EDTA والبذور لهم في كثافة 1.2x10 ~ 4 في بئر في المتوسط نمو الخلايا الليفية.
- في اليوم التالي يحل محل وسائل الاعلام مع وسائل الاعلام HES (DMEM/F12، المصل خروج المغلوب 20٪ بدل فاقد، غير الاساسيين من الأحماض الأمينية، العسائلن / الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين و 0.1 ملي β-المركابتويثانول، 20 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية القاعدية (bFGF)، على أن تستكمل مع 0.5 مم الزبدات الصوديوم لل7 ايام الأولي للبرمجة. تغيير وسائل الإعلام يوميا.
- رصد تغيرات شكلية في الخلايا transduced يوميا. والمستعمرات من الوركين تشبه الخلايا تبدأ في الظهور حوالي 5 - 10 أيام بعد نقل الخلايا الليفية transduced على الخلايا المغذية. المستعمرات hiPSC على استعداد لتكون معزولة حوالي 14 - 28 يوما بعد تصفيح لهم على الخلايا المغذية MEF.
3. العزلة من المستعمرات hiPSC
- وقبل يوم من اختيار المستعمرات hiPSC إعداد 24 جيد مع لوحات γ-المشع الخلايا المغذية MEF (~ 4x10 4 خلايا لكل بئر) في متوسط نمو الخلايا الليفية. ويمكن في هذه المرحلة أيضا المستعمرات hiPSC يتم تحويلها الى ثقافة التغذية الحرة باستخدام Matrigel والمتوسطة mTeSR1.
- قبل عزل المستعمرات hiPSC إعداد لوحات MEF عن طريق إزالة الخلايا الليفية ميديو نموم والشطف MEFs مع برنامج تلفزيوني لإزالة آثار FBS. بعد ذلك إضافة 0.5 مل HES المتوسطة (أو mTeSR1 المتوسطة في حالة الآبار المغلفة Matrigel) مع 10 ميكرومتر المانع ROCK Y27632 إلى كل 7،8 جيدا.
- إذا لزم الأمر، وإزالة الخلايا الليفية المحيطة المستعمرات hiPSC مع إبرة قياس 21 تحت المجهر شنت في غطاء محرك السيارة تدفق رقائقي (الشكل 2A - C). شطف مع لوحات برنامج تلفزيوني وإضافة جديدة وسائل الإعلام التي تحتوي على الأجسام المضادة HES ترا، 1-81 StainAlive محددة (1:200، Stemgent). بعد 30 دقيقة.، تحل محل وسائل الإعلام التي تحتوي على الأجسام المضادة مع وسائل الاعلام HES جديدة تستكمل مع 10 المانع ROCK ميكرومتر. فحص لوحات تحت المجهر الفلورسنت وعلامة ترا-1-81. المستعمرات إيجابي باستخدام علامة الهدف (الشكل 2D)
- قطعت هيئة تنظيم الاتصالات، 1-81 المستعمرات hiPSC إيجابية تحت المجهر في غطاء محرك السيارة الصفحي، الى قطع صغيرة عدة باستخدام إبرة عيار 21 كما هو مبين في الشكل 2E و F.
- استخدام التلقائي شظايا ماصة نقل (P200) من المستعمرات hiPSC إلى دائرة الهجرة والجنسيةividual الآبار من 24 لوحة بشكل جيد مع MEFs أو Matrigel. تجنب نقل غير الوركين الخلايا. وضع لوحات في 37 درجة مئوية، و 5٪ حاضنة CO 2 وتسمح للمستعمرات hiPSC لنعلق ل24-36 ساعة.
- التغيير HES أو mTeSR1 (للمستعمرات نمت على Matrigel) وسائل الاعلام يوميا. وسوف المستعمرات hiPSC مع مورفولوجيا HES تشبه الصحيح أن تكون واضحة بعد 48 ساعة نقل الأولي على طبق من ذهب 24-جيدا.
- يدويا مرور المستعمرات hiPSC كل 6 - 8 أيام في الصعود إلى 12 بشكل جيد وبعد ذلك على طبق من 6 أيضا.
- بعد توسع نسيلي وإنشاء خطوط hiPSC وتحليل التعبير عن علامات تعدد القدرات الهيئة-1-60، SSEA-4، Oct3 / 4، وSox2 Nanog باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية كما هو مبين في الشكل (3). تقييم سلامة الجينومية وإمكانية التفريق بين الخطوط التي تم الحصول عليها باستخدام النمط النووي والتحليلات تشكيل مسخي 6،9.
4. ممثل النتائج
كفاءة تنبيغ مع الفيروس الارتجاعي التي تحتوي على-I وسائل الاعلامق حاسمة لإعادة برمجة ناجحة. فمن المستحسن لإجراء كامل ترنسفكأيشن / عدوى الإجراء باستخدام GFP معربا عن فيروس واحد في كل تجربة إعادة برمجة لمراقبة كفاءة كما هو موضح في الشكل رقم 1. وعيار من الفيروس GFP معربا عن العزم، كما هو موضح في 10، من خلال تنبيغ الخلايا الليفية الإنسان باستخدام غير مركزة وسائل الاعلام الفيروسية وكان عادة في نطاق من 0.5 - 5 × 10 7 الجسيمات الفيروسية لكل مل (نائب الرئيس / مل).
الليفية تغيير التشكل في أقرب وقت 2 بعد أيام من إصابة آخر. وينبغي أن الخلايا الليفية الإنسان Trypsinized تحسب بعناية قبل البذر منهم على الخلايا المغذية MEF. فمن المستحسن أن خلايا البذور في 3 كثافات مختلفة (6x10 3، 1.2x10 4 و 2.5x10 4 في واحد جيد من لوحة 6 أيضا) لأن كل خط خلية يوضح مختلف الخصائص النمو وكثافة بذر أمر حاسم بالنسبة لكفاءة إعادة برمجة. الزبدات الصوديوم المستخدمة فيالأولي 7-14 أيام من إعادة برمجة يزيد من كفاءة تشكيل hiPSC ما يقرب من 5 أضعاف. في كثير من الأحيان، وخصوصا عندما كان المصنف الليفية المصاب في أعلى كثافة، يمكن أن الخلايا الليفية مثل كسا طبق ثقافة وتغطية المستعمرات hiPSC كما هو مبين في الشكل 2A. في هذه الحالة، يمكن للطبقة الليفية رفع بعناية وإزالة المستعمرات لكشف hiPSC (الشكل 2B). بعد ذلك، يجب أن تشطف المستعمرات hiPSC مع وسائل الاعلام HES وملطخة ترا، 1-81 الأجسام المضادة. اعتمادا على الخلايا الليفية، ما يقرب من 20 - 40٪ من المستعمرات يتظاهرون مع iPSC مثل التشكل لا صمة مع هيئة تنظيم الاتصالات 1-81 الأجسام المضادة. ويمكن نقل المستعمرات hiPSC المحددة من لوحة داخل ال 12 المقبلة - 24H. وحضانة لفترات طويلة يؤدي إلى التمايز السريع لhiPSCs. ويمكن المستعمرات passaged يدويا على أي من الخلايا المغذية MEF أو لوحات Matrigel المغلفة. وينبغي بعد توسع المنشأة يتم اختبار الحيوانات المستنسخة باستخدام hiPSC كيمياء سيتولوجية مناعية (ICC) للتعبير عن pluripotenقبرصي وضع العلامات كما هو موضح في الشكل (3). وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكون توصيف مفصل الجزيئية من خطوط المولدة الخلية الجذع وتشمل: تحليل التعبير الجيني تعدد القدرات باستخدام RT-PCR، دليل على نزع الميثيل الحمض النووي على المروجين للجينات تعدد القدرات وتحليلات لإسكات الجينات المحورة 9.
الشكل 1. كفاءة تنبيغ الفيروسية التي تحدد استخدام الارتجاعي GFP التعبير. (A، B) الليفية الكبار الإنسان المستمدة من المريض رنح فريدريك (GM03665، Coriell مستودع) كانت تصور بعد إصابة شخصين على التوالي مع وسائل الاعلام GFP فيروسات. (C، D) كانوا مصابين الليفية الإنسان مع نفس دفعة من وسائل الإعلام GFP فيروسات تليها الطرد المركزي من الخلايا مباشرة على لوحات 6-جيدا ل1H في 1600g. تم القبض على الصور 48h بعد الإصابة.
الشكل 2. تحديد وعزل المستعمرات hiPSC. (أ) المرحلة صورة على النقيض من لوحة تحتوي على hiPSCs تحيط بها الخلايا الليفية. تم زراعة الخلايا لمدة 21 يوما على وسائل الإعلام HES. (B، C) ومستعمرة نفسه hiPSC بعد إزالة طبقة الخلايا الليفية المحيطة بها. قطع (D) ويتم تحديد المستعمرات hiPSC برمجتها بشكل صحيح عن طريق تلطيخ على الهواء مباشرة مع الجسم المضاد علامة ترا، 1-81 السطح، وذلك باستخدام إبرة معقمة (E، F) وتحويلها إلى آبار منفصلة من لوحة 24-جيدا.
تم تحديد الشكل (3). التعبير من علامات محددة على تعدد القدرات Oct3 / 4، نانوغ (NANOG) Sox2، SSEA4 وترا-1-60 في hiPSCs بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
دراسة الأمراض التي تصيب الإنسان، والجهاز العصبي وخاصة الاعصاب، وقد تم الطعن على نحو خاص بسبب عدم إمكانية الوصول إلى نماذج كافية الخلوية الإنسان. افتتح والقدرة على إعادة برمجة الخلايا الجسدية التي يمكن الحصول عليها بسهولة في الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها وإمكانات لتمييزها إلى أنواع الخلايا المتنوعة إمكانية لخلق نماذج من الأمراض الوراثية الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، iPSCs عقد وعدا كبيرا في مستقبل الطب التجديدي. ولذلك، فمن الضروري لتطوير وتحسين طرق موثوقة وفعالة وآمنة من إعادة برمجة الخلايا الجسدية على تعدد القدرات.
من وجهة نظر من التطبيقات العلاجية، من الأهمية بمكان لوضع نهج الآمن للجيل iPSC تفتقر طفرات البصمة في الجينوم المضيف. أساليب إعادة برمجة الخلايا الجسدية دون إدخال تعديلات دائمة في جينوم خلايا برمجتها مثل ترنسفكأيشن ناقلات episomal، واستخدام الهيئة excisablensposons، عدوى الفيروسة الغدانية، والتسليم المباشر من مرنا أو البروتينات أنشئت بالفعل 11-15. حتى الآن كفاءة إعادة برمجة باستخدام هذه الطرق الخالية من التحوير منخفضة ويعتمد على نوع، شخصية وعمر إعادة برمجة الخلايا الجسدية. ولذلك، هذه البروتوكولات ليست مناسبة لإعادة برمجة مرور في وقت متأخر، الكبار الخلايا الجسدية في كثير من الأحيان المودعة في المستودعات الخلية. بالإضافة إلى ذلك، لتمكين توصيف مفصل للخطوط iPSC متعددة وإنشاء نماذج جديدة من الأمراض التي تصيب الإنسان، وإجراء شاشات المخدرات الإنتاجية العالية، إعادة برمجة الخلايا الجسدية باستخدام تسليم الفيروسية من عوامل النسخ هو استراتيجية مناسبة. حتى الآن أكثر من 20 دراسة عن جيل من المريض محددة iPSCs إلى الأمراض التي تصيب الإنسان نموذج العصبية والعضلية. في جميع الحالات ولكن واحدة تم إنشاؤها باستخدام iPSCs تنبيغ lentiviral أو فيروسات 16.
البيانات المتوفرة لدينا تثبت أن بروتوكول البسيط القائم على الويمكن استخدام البريد تسليم فيروسات من عوامل النسخ OSKM لإعادة برمجة الخلايا الليفية بكفاءة الإنسان الكبار، وحتى من ممر مرتفع. من كمية الفيروسات التي تم الحصول عليها من ترنسفكأيشن واحدة من الخلايا فينيكس على لوحة 10 سم يكفي لأكثر من 10 تجارب إعادة برمجة. هناك ثلاث خطوات حاسمة في بروتوكول لدينا إعادة برمجة الخلايا الليفية الكبار: (ط) ترنسدوكأيشن الفيروسية كفاءة عالية سهلت خطوة إضافية خلال تنبيغ الطرد المركزي مما يزيد بشكل كبير من كفاءة تنبيغ، (ب) كثافة البذر من الخلايا الليفية transduced على لMEFs و ( ج) استخدام التلوين على الهواء مباشرة مع الجسم المضاد ترا، 1-81 علامة لتسهيل اختيار من المستعمرات يحتمل برمجتها تماما والتي يمكن نقلها مباشرة إلى وحدة تغذية خالية من الثقافات. ومما يعزز بشكل كبير من كفاءة إعادة برمجة باستخدام الزبدات الصوديوم خلال الاسبوع الثاني من إعادة برمجة. وعلاوة على ذلك، لاحظنا أن أكبر جزء من المستعمرات iPSC زرعها فيويمكن توسيع نطاق وجود الدواء، وأنشأ في خطوط iPSC برمجتها بشكل كامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل تحالف فريدريك البحث رنح ومنحة رائدة من أرنولد العائلة المؤسسة ومركز الخلايا الجذعية وعلم الأحياء التنموي في مركز اندرسون للسرطان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| KSR | Invitrogen | 10828 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 | |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8628 | |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S | |
| Tra-1-60 antibody | EMD Millipore | MAB4360 | |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S | |
| SSEA4 | EMD Millipore | MAB4304 | |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G | |
| Objective marker | Nikon Instruments | MBW10010 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 05850 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Fugene 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Object marker | Nikon Instruments | MBW10010 |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, 713-720 (2011).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines. Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).
- Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. Friedreich's ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability. Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).
- Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O'Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Yu, J., Thomson, J. A. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. Essentials of Stem Cell Biology. Lanza, R. , Elsevier Inc. 331-337 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron. 70, 626-644 (2011).
