Summary
نحن يبرهن على وجود بروتوكول زراعة الخلايا لدراسة مباشرة لمكونات الخلايا العصبية والدبقية في الجهاز العصبي المعوي. ويتم إعداد الخلايا العصبية / الدبقية ثقافة مختلطة coverslips على من الضفيرة العضلية المعوية من فأر بالغ توفير القدرة على فحص الخلايا العصبية الفردية وظيفة الخلايا الدبقية التي كتبها الكهربية، المناعى،
Abstract
الجهاز العصبي المعوي هو عبارة عن شبكة واسعة من الخلايا العصبية والدبقية يمتد على طول القناة الهضمية التي تتحكم ظيفيا حركية الجهاز الهضمي. ووصف الإجراء لعزل وثقافة يسكنها خليط من الخلايا العصبية والدبقية من الضفيرة العضلية المعوية. يمكن الحفاظ على الثقافات الأولية لأكثر من 7 أيام، مع وصلات بين الخلايا العصبية النامية والدبقية. يتم تجريد قطاع العضلات الطولية مع المرفقة العضلية المعوية الضفيرة من العضلات الدائرية الكامنة وراء الدقاق الماوس أو القولون وتعرض لعملية الهضم الأنزيمية. في ظروف معقمة، والحفاظ على الخلايا العصبية والدبقية معزولة السكان داخل الكرية التالية الطرد المركزي ومطلي coverslips على. في غضون 24-48 ساعة، يحدث محوار ثمرة ويمكن التعرف على الخلايا العصبية بواسطة علامات عموم العصبية. بعد يومين في الثقافة، والخلايا العصبية معزولة إمكانات العمل النار كما لوحظ من الدراسات المشبك التصحيح. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن يكون الدبقية المعوية identifالعبوات الناسفة من قبل GFAP تلطيخ. وهناك شبكة من الخلايا العصبية والدبقية في بدل وثيقة تشكل في غضون 5-7 أيام. يمكن أن الخلايا العصبية المعوية يكون بشكل فردي ودرس مباشرة باستخدام أساليب مثل المناعية، الكهربية، والتصوير الكالسيوم، وحيدة الخلية PCR. وعلاوة على ذلك، هذا الإجراء لا يمكن أن يؤديها في الحيوانات المعدلة وراثيا. هذه المنهجية هي بسيطة وغير مكلفة لأداء. وعموما، هذا البروتوكول إلى الكشف عن مكونات الجهاز العصبي المعوي بطريقة التلاعب بها بسهولة حتى نتمكن من اكتشاف أفضل وظيفة في الولايات ENS العادي والمرض.
Introduction
الجهاز العصبي المعوي (ENS) هي شبكة واسعة من الأعصاب والخلايا الدبقية التي تمتد على طول كامل من الجهاز الهضمي (GI) المسالك. وENS تسيطر وظيفيا جميع جوانب الهضم، بما في ذلك التمعج، وامتصاص السوائل / إفراز، والإحساس من المحفزات، الخ (للمراجعة انظر 1). أنه يحتوي على أكثر من 500 مليون خلية عصبية، أكثر من الموجودة في الحبل الشوكي، ويحتوي على كل فئة الناقلات العصبية الموجودة في الدماغ. علاوة على ذلك، ENS هي فريدة من نوعها من حيث أنها يمكن أن تعمل بالغريزة دون مدخلات من الجهاز العصبي المركزي 2. فهم ENS أمر بالغ الأهمية، ليس فقط لفهم دورها فسيولوجية طبيعية، ولكن لفهم مشاركتها في مجموعة متنوعة من اعتلال الأعصاب الذي يمكن أن يكون خلقي (مرض هيرشسبرونغ)، المكتسب (داء شاغاس)، الثانوية لمرض دول (خزل المعدة السكري)، ومكافحة المخدرات التي يسببها (متلازمة الأمعاء الأفيونية)، أو بسبب الاصابة (العلوص بعد الجراحة) 1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الخلايا العصبية المعوية تكون إعادةservoir لعدوى فيروسية (الحماق النطاقي) 3. بسبب التشابه إلى الدماغ ومستويات مرتفعة من السيروتونين في الأمعاء، والأدوية التي تهدف إلى علاج عيوب الجهاز العصبي المركزي غالبا ما يكون لها آثار جانبية غير مرغوب فيها على ENS 2. ومن الجدير بالذكر أيضا أن العديد من اعتلالات الأعصاب مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون تظهر التغيرات الخلوية مماثلة في الخلايا العصبية المعوية طويلة قبل ظهورها في الخلايا العصبية المركزية، مما يجعل ENS نموذج الوصول إليها لدراسة المرضية لهذه الأمراض 4. لذلك، فهم شامل للENS هو ضرورة في فهم الحالات المرضية ومنع / توقع الآثار الجانبية الدوائية.
وقد تم دراسة الخلايا العصبية في ENS تقليديا في خنزير غينيا استخدام مستحضرات wholemount 5-7 أو الخلايا العصبية مثقف 8. وعلى الرغم من سهولة في والتي يمكن دراستها الخلايا العصبية في هذه الحيوانات الكبيرة، وهذا النموذج لديه الكثير من القيود بما في ذلكعدم وجود سلالات معدلة وراثيا، والافتقار إلى الكواشف محددة لهذا النوع، والتكلفة العالية المرتبطة اشتري هذه المواضيع والإسكان. تطوير نموذج الجهاز العصبي المعوي الفئران لديه ميزة فريدة من طرق مختلفة من أنظمة، مجموعة واسعة من المنهجيات الأخرى المنشأة التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع تقنية زراعة الخلايا، والقدرة على توفير التحقق من صحة لنموذج خنزير غينيا .
ويتألف من ثلاثة ENS بلكسى التي تعمل على طول القناة الهضمية: والعضلية المعوية الضفيرة الخارجي (بين العضلات الطولية والدائرية) التي هي المسؤولة أساسا عن تصرفات تحوي من الأمعاء، وكذلك بلكسى تحت المخاطية والمخاطية، ( وجدت تحت وداخل الغشاء المخاطي، على التوالي) التي تسيطر إلى حد كبير امتصاص السوائل / إفراز والكشف عن المنبهات 1. يبدأ هذا الأسلوب مع العزلة من الضفيرة إعداد العضلات / العضلية المعوية طولية (LMMP) عن طريق تقشيرقبالة طبقة العضلات الخارجي من الجهاز الهضمي. هذا يخفض بشكل كبير بانخفاض بشأن قضايا التلوث التي تنشأ عندما تشارك الطبقة المخاطية في عزلة. ونتيجة لذلك، وهذه العملية هي مثالية لدراسة السيطرة العصبية في القدرة على الحركة بدلا من الإجراءات إفرازية من ENS.
الطريقة المعروضة هنا النتائج في ثقافة مختلطة من الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية. واثنين على الأقل من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية موجودة على أساس الملاحظات الكهربية وimmunocytochemical السابقة 9. وجود الخلايا الدبقية هو مفيد للغاية، لأنها ليست سوى نوع من الخلايا الهامة للدراسة في حد ذاتها، ولكن لأنها تسهم في بقاء الخلايا العصبية المعوية 10 والحفاظ على التعبير مستقبلات الأم على سطح الخلية العصبية 11. وعلاوة على ذلك، قد نقص من الدبقية المعوي يؤدي إلى غير طبيعي الجهاز الهضمي الحالات المرضية حركية، صاغ 12 '-gliopathies العصبية'. ولذلك، فإن ثقافة ENS المقدمة هنا Results في العديد من أنواع الخلايا التي أصبحت جاهزة للتحقيق فيها.
مزايا لهذه المنهجية هي سهولة العزلة، ومتطلبات أداة غير مكلفة، وفترة زمنية قصيرة لإتقان هذه التقنية من قبل موظفي المختبر ذوي الخبرة. القيود المفروضة على منهجية تشمل انخفاض العائد خلية الإجمالي من وحدات تخزين الأنسجة عالية واستبعاد الخلايا العصبية ENS من بلكسى المخاطية وتحت المخاطية. وسوف يكون هذا الإجراء مفيدا للغاية للعلماء المتخصصين في الكهربية، المناعية، وحيدة الخلية PCR، والمنهجيات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كانت كل رعاية الحيوان والإجراءات التجريبية وفقا للوافقت عليها لجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان في جامعة فرجينيا كومنولث.
1. إعداد العقيمة coverslips الزجاج بولي-D-يسين وLaminin مغلف بالمطاط في 24 لوحات جيدة
- يتم تنفيذ جميع الإجراءات للخطوة 1 في ظروف معقمة؛ تحت غطاء محرك السيارة، ومع الكواشف معقمة. ويجب تعقيم coverslips الزجاج والماء منزوع الأيونات المزدوجة ([ده 2 O) مقدما. إعداد لوحات ويمكن القيام تصل إلى أسبوعين قبل الخلايا العصبية العزلة.
- تحت غطاء محرك السيارة، واستخدام ملقط معقم لوضع coverslips الزجاج تعقيمها في 12 بئرا من 24 لوحة جيدا.
- إعداد الأوراق المالية بولي-D-يسين في وقت مبكر. إضافة 50 مل من ddH2O العقيمة إلى 5 ملغ بولي-D-يسين. دوامة وتخزينها في 3 مل aliquots في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد مأخوذة قبل الاستخدام.
- لتركيز النهائي من 1 مل الأسهم بولي-D-يسين لكل 25 سم 2: ماصة 80 ميكرولترمن الأسهم بولي-D-يسين على رأس كل منهما الزجاج ساترة (2 سم 2). اسمحوا حل تسوية لمدة 10 دقيقة.
- إزالة بولي-D-يسين باستخدام فراغ وشطف coverslips على 3x مع العقيمة DDH 2 O.
- السماح لوحات لتجف لمدة لا تقل عن 2 ساعة تحت غطاء محرك السيارة.
- قد يتم تخزين لوحات في 4 درجة مئوية أو - 20 درجة مئوية قبل الشروع في طلاء laminin.
- إعداد الأوراق المالية laminin في وقت مبكر. ذوبان الجليد laminin على الجليد والحفاظ على الجليد أثناء الاستخدام. تمييع إلى تركيز 50 ميكروغرام / مل؛ الالتفات إلى الكثير تركيز؛ كل كبيرة وسوف تكون مختلفة. اعتمادا على تركيز الكثير، سيتم إضافة ما يقرب من 20 مل ده 2 O إلى كل قارورة من laminin. قسامة (5 مل) وتخزينها في -80 درجة مئوية. ذوبان الجليد مأخوذة على الجليد قبل الاستخدام.
- coverslips على معطف مع 5 ميكروغرام / سم 2 laminin؛ ماصة 200 ميكرولتر من الأسهم laminin على كل ساترة.
- احتضان حل laminin coverslips على لمدة 1 ساعة.
- نضح الحل laminin المتبقية وشطف coverslips على مرة واحدة مع[ده 2 O. تجنب كشط سطح coverslips على.
- لوحات تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
2. الإعداد المسبق من الخلية العصبية العزلة حلول
- يعد حل كريبس (في ملي: 118 كلوريد الصوديوم، 4.6 بوكل، 1.3 ناه 2 ص 4، 1.2 MgSO 4، 25 NaHCO 3، 11 الجلوكوز، و 2.5 و CaCl 2). المكان 13.79 غرام كلوريد الصوديوم (FW 58.44)، 0.686 غرام بوكل (FW 74.55)، 0.312 غ ناه 2 ص 4 (FW 120)، 0.289 غرام MgSO 4 (FW 120.4)، 4.20 غرام NaHCO 3 (FW 84.01)، 3.96 غرام جلوكوز (FW 180.2)، و0.555 غرام و CaCl 2 (FW 111) في 2 L [ده 2 0. هدئ إلى 4 درجات مئوية.
- إعداد شطف وسائل الإعلام (F12 وسائل الإعلام مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) والمضادات الحيوية / مضاد فطري): لزجاجة 500 مل من F12 سائل الإعلام، إضافة 50 مل FBS و 5 مل من مضاد حيوي / مضاد فطري السائل 100X (GIBCO).
- إعداد وسائل الاعلام الخلايا العصبية المعوية (Neurobasal A وسائل الاعلام مع B-27، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ FBS، 10 نانوغرام / مل، الدبقية مشتقة Neurotrعامل ophic (GDNF)، ومضاد حيوي / مضاد فطري السائل 100X). لجعل الأسهم GDNF، إضافة 1 مل ddH2O إلى 10 ميكروغرام GDNF وتجميد مرة أخرى في 50 ميكرولتر مأخوذة، مخزن في -80 درجة مئوية. لقارورة مل 50 من وسائل الاعلام الخلايا العصبية كاملة، والجمع بين 47.5 مل Neurobasal A وسائل الاعلام، 1 مل B-27 (50X)، 500 ميكرولتر FBS، 500 ميكرولتر 200 مم L-الجلوتامين (GIBCO) 50 الأسهم GDNF ميكرولتر، و 500 ميكرولتر مضاد حيوي / السائل 100X فطري. يرصد وسائل الاعلام في 50 دفعات صغيرة مل لضمان نضارة GDNF وتجنب تلوث كميات كبيرة من هذه الخلية مكلفة خليط سائل الإعلام.
3. الحصاد الطولية العضلات / العضلية المعوية الضفيرة (LMMP) من إعداد الفئران
- وينبغي أن تكون الأخلاقيات الوطنية والمؤسسية المناسبة في المكان قبل تنفيذ التجارب على الحيوانات. ويعيش الكبار السويسري وبستر الفئران وزنها أكثر من 25 غرام (عادة أكثر من 8 أسابيع من العمر) في مجموعات من 6 قبل التجارب. وتستخدم الأنسجة من اثنين من الفئران لعزل الخلايا العصبية المعوية اللفائفية والدبقية وتستخدم ثلاثة الفئران للعزل الخلايا القولون.
- إعداد المنطقة الجراحية. جمع مقص صغير جراحية، ملقط الزاوية، ومسحات القطن، وثلاثة أكواب زجاج 200 مل، وقضيب الزجاج / البلاستيك (الرسام). ضمان غسلها جيدا كل اللوازم وتشطف قبل استخدامها للحد من التلوث. هذه الخطوة لا يمكن أن يؤديها قبل يوم من التجربة.
- وضع حل كريبس على الجليد وفقاعة مع كربوجين (95٪ أكسجين و 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة على الأقل لتحقيق الاستقرار في درجة الحموضة.
- بدوره على مختلف المعدات والمواد الكيميائية دافئ لتحقيق الاستقرار في درجات الحرارة المطلوب؛ حمام مائي حرارة (ق) إلى 37 ° C، الطرد المركزي بارد إلى 4 درجات مئوية، مكان محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) والتربسين 0.5٪ في حمام ماء (37 ° C ). ينبغي أن تظل وسائل الإعلام الخلايا العصبية كاملة وشطف سائل الإعلام المبردة.
- فقاعات مكان 150 مل الجليد الباردة كريبس في ثلاثة أكواب زجاج 200 مل المسمى 'القذرة'، 'نظيفة'، و 'LMMP'. دورق فقاعة المسمى 'LMMP' مع كربوجين.
- بعد موافقة لجنة الأخلاقيات، الموت ببطء م[أوس] من قبل خلع عنق الرحم أو CO 2 الاختناق.
- ضع الماوس في رقود ظهري على سطح الجراحية، والجلد نظيف مع 70٪ ETOH، ورفع جلد البطن باستخدام ملقط. باستخدام مقص، وتجويف البطن مفتوحة وتكشف عن الجهاز الهضمي الداخلية.
- إزالة طول الجهاز الهضمي من خلال رفع قسم من الدقاق والكشف عن مساريق لها. قصاصة من خلال مساريق مع مقص لإزالة بلطف وكشف الدقاق والقولون، والحرص على عدم سحب مساريق من الدقاق / القولون.
- بعد كشف كامل طول الأمعاء، وإزالة الدقاق من خلال قطع الأمعاء القاصي إلى المعدة والأقرب إلى الأعور ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذا الإجراء مع أنسجة القولون عن طريق إزالة القولون من القاصي إلى الأعور إلى الأقرب إلى فتحة الشرج.
- الأنسجة ويمكن تقسيم آخر بين القولون القريبة والبعيدة، وjejenum، والدقاق. وسوف تبقى من هذا الإجراء الرجوع إلى عزلة الدقاق؛ ركان الإجراء هو نفسه لعزل LMMP القولون. وضع الدقاق كامل في وعاء زجاجي مع الثلج الباردة كريبس ملحوظ 'القذرة'.
- إنشاء أداة لتنظيف الدقاق؛ حادة كبير 20 إبرة G باستخدام الحجر الايداع وإرفاقه حقنة كبيرة (10 مل) تحتوي على الجليد الباردة كريبس.
- تنظيف البراز من الدقاق من قبل باجتزاء الدقاق إلى ثلاثة أو أكثر من القطع الكبيرة. إزالة القسم اللفائفية من كوب ووضع إبرة اضعافها في نهاية مقال اللفائفية.
- تشغيل بلطف كريبس من خلال قسم الأمعاء حتى تتم إزالة جميع البراز في وعاء النفايات منفصلة. وضع قسم تنظيف في وعاء من كريبس ملحوظ 'نظيفة'. كرر حتى يتم تنظيف الدقاق بأكمله.
- لإزالة LMMP، وقطع الدقاق الى شرائح صغيرة، حوالي 2-4 سم. ضع شريحة من الدقاق على البلاستيك أو الزجاج قضيب؛ الدقاق ينبغي أن تناسب سنججلي لكن لا تكون فضفاضة أو مشدود (~ 2 مم). بدء إزالة LMMP عن طريق إزالة بلطف بت من مساريق لا تزال تعلقإد إلى (GI) الجهاز الهضمي باستخدام ملقط. منع الجهاز الهضمي من تدور حول قضيب تعلق بها بلطف أنبوب للقضيب باستخدام الإبهام.
- فصل LMMP من العضلات الدائرية الأساسية؛ الأول فرك بلطف على حافة ملقط على طول الخط كله حيث كان يعلق على مساريق، من أعلى إلى أسفل للجزء، وخلق بلطف وجود فجوة في العضلة الطولية. ثم ندف بلطف بعيدا العضلات الطولية باستخدام مسحة القطن مبلل مع كريبس.
- تبدأ في الجزء العلوي من الفجوة في العضلات الطولية وندف بعيدا باستخدام أخف السكتة الدماغية الأفقي أثناء تطبيق الضغط الخفيف جدا حتى العضلات الطولية يبدأ فقط لفصل من العضلات الدائرية؛ القيام بذلك أسفل الشريط بأكمله على طول نقطة التعلق مساريق.
- ثم تبدأ بلطف للعمل على أنبوب GI؛ والانتقال من الأعلى إلى الأسفل والخلف كما يتم فصل العضلات الطولية ببطء من العضلات الدائرية على طول الطريق حول الأنبوب. عندما كاملة، وLMMP سوف تأتي بشكل طبيعي قبالة ما تبقى من الأنبوب الهضمي.
- وضع قطاع رقيقة الناتج من العضلات الطولية في الدورق ملحوظ 'LMMP'. كرر لجميع القطاعات.
- بعد أن تم جمع كل شرائح من LMMP من الماوس واحد، كرر إجراء أي الفئران الأخرى المستخدمة. شطف جيدا في الأكواب 'القذرة' و 'نظيف' قبل إعادة استخدامها.
- شطف LMMP 3X لإزالة التلوث البيولوجي. ملء ثلاثة 2 مل إيبندورف أنابيب مع الثلج الباردة كريبس. وضع شرائط LMMP في الأنبوب الأول وتدور لمدة 30 ثانية في 356 XG في جهاز للطرد المركزي يتم تبريده الى 4 درجات مئوية. إزالة بعناية طاف مع ماصة ونقل شرائط LMMP إلى التالي نظيفة كريبس أنبوب شغلها. كرر هذا الإجراء لكل أنبوب المتبقية.
4. هضم LMMP
- يعد حل الهضم عن طريق وضع 13 ملغ كولاجيناز من النوع 2 و 3 ملغ BSA في 10 مل كربوجين-فقاعات حل كريبس.
- شرائح مكان LMMP المشطوفة إلى حل الهضم وSCIS استخدامSORS إلى قص LMMP إلى قطع صغيرة.
- هضم LMMP لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مع شاكر في حين يجري فقاعات بلطف مع كربوجين.
- بعد اكتمال عملية الهضم، وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 356 XG في أجهزة الطرد المركزي يتم تبريده الى 4 درجات مئوية.
- من هذه النقطة إلى الأمام يجب أن تتم جميع الإجراءات تحت ظروف معقمة في غطاء ثقافة الخلية! يجب تعقيم جميع الكواشف والحاويات قبل الاستخدام.
- أثناء الطرد المركزي، وإعداد 0.05٪ التربسين الحل من خلال وضع 1 مل تحسنت 0.25٪ التربسين و 4 مل تحسنت HBSS في العقيمة 50 مل أنبوب خلية ثقافة.
- بعد الطرد المركزي، وإزالة وتجاهل طاف. لا تستخدم فراغ، وهذا من المرجح أن تمتص الخلية بيليه بسبب الطرد المركزي بسرعة منخفضة. إزالة بعناية بيليه الخلية ومكان في أنبوب نظيفة مع 5 مل من محلول التربسين 0.05٪.
- هضم الخلايا في حل التربسين 0.05٪ في 37 ° C حمام الماء مع اهتزاز لمدة 7 دقائق. لا تتجاوز 7 ميلن من مجموع العلاج التربسين أو الخلايا العصبية سوف يهلك.
- تحييد التربسين مع 10 مل من وسائل الاعلام شطف الباردة بعد 7 دقائق من العلاج التربسين.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 8 دقائق في ز X 356. إزالة وتجاهل وسائل الإعلام.
- أثناء الطرد المركزي، وتحقيق التوازن قسم من تعقيم شبكة Nitex على رأس العقيمة 15 مل أنبوب خلية ثقافة.
- بعد الطرد المركزي، وإزالة وتجاهل طاف. بلطف خليط الخلية resuspend من قبل الطحن في 3 مل وسائل الاعلام الخلايا العصبية كاملة. تجنب توليد فقاعات الهواء خلال هذه الخطوة وجميع الخطوات المستقبلية التي triturated خليط الخلية. يجب أن تتم جميع triturations بلطف جدا. تصفية حل الخلية من خلال شبكة Nitex في نظيفة 15 مل أنبوب خلية ثقافة.
- اختياري: كاب خلية أنبوب الثقافة والمكان في خلاط حولا المبردة (أو أي خلاط التي توفر دوران) مع المتداول لطيف ويميل لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة اختيارية ولكن الموصى بها.
- اختياري: بعد خلاط حولا، إضافة 2 مل شطف سائل الإعلام البارد لغسل الخلايا.
- جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي (8 دقائق، 356 x ج). إزالة وتجاهل طاف.
- Resuspend الخلايا في 1،200 ميكرولتر وسائل الاعلام الخلايا العصبية كاملة. يسحن الخلايا بلطف باستخدام 1 مل من البلاستيك غيض ماصة. لا تولد فقاعات الهواء. ماصة ببطء وبلطف حتى يتم تقسيم معظم أجزاء يصل ويتم تعليق الخلايا في السائل.
- إضافة 750 ميكرولتر من وسائل الإعلام كاملة إلى كل من الآبار 12 تحتوي على ساترة الزجاج قبل المغلفة وإضافة 100 ميكرولتر من الحل خلية triturated.
- احتضان الخلايا العصبية في خلية ثقافة حاضنة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2.
- تغيير نصف من وسائل الإعلام خلية كل يوم 2.
- الخلايا العصبية على استعداد للتسجيلات الكهربية بعد 1-2 أيام في الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سوف العزلة التالية مباشرة من الخلايا المشتقة من LMMP، الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى لا يكون واضحا بسهولة. المعيشة، ويمكن رؤية خلايا جولة من النمط الظاهري غير واضحة وكذلك المخلفات الأنسجة من شظايا الأنسجة هضمها بشكل غير كامل والنسيج الضام. هذا هو حطام سفينة من أي قلق وسوف يتم إزالتها إلى حد كبير مع تغير وسائل الاعلام لأول مرة في يومين. لا تحاول تنظيف الشرائح قبل هذا وسيتم إزالة، خلايا قابلة للحياة صحية كذلك.
بعد يوم واحد في الثقافة، وسوف تبدأ الخلايا العصبية لإظهار ثمرة neurite. تحديد محددة من الخلايا العصبية قد تكون لا تزال غير واضحة في هذا الوقت. وفرت الخلايا الملتصقة بما يكفي لنقل إلى الغرفة التجريبية، وأنها ستكون على استعداد لدراسة الكهربية بعد يوم واحد من الثقافة. ومع ذلك، فإن الخلايا هي أكثر تمسكا بعد يومين في الثقافة ومثالية للدراسات وظيفة (الكهربية، والتصوير الكالسيوم) من أيام تقريبا 2-5.
الأنف والحنجرة "> الميزات المورفولوجية من الخلايا العصبية تصبح متميزة بعد ما يقرب من أسبوع في الثقافة (الشكل 1). يمكن تحديد ملامح immunocyctochemical مثالية بعد حوالي عشرة أيام، عندما عرض الخلايا العصبية إسقاطات طويلة وتنمو في تقريبا 'العقدية' مثل الأزياء تتخللها الدبقية ( الشكل 2). وتشير هذه تلطيخ قد يكون من الممكن لدراسة التفاعلات متشابك من هذه الخلايا باستخدام هذه المنهجية.بعد يوم واحد في الثقافة، ويتم التعرف على الخلايا العصبية التي لها شرط غير كيو أو "السمة المميزة '، وإمكانات العمل (الشكل 3). Electrophysiologically، فإنها يمكن أن تصنف وظيفيا إلى نوعين على الأقل العصبية: الخلايا العصبية التي تحتوي على ما بعد فرط الاستقطاب وزيادة العلاقات الحالية / كثافة من الصوديوم والبوتاسيوم والخلايا العصبية التي لم يكن لديك ما بعد فرط الاستقطاب وأقل بكثير الصوديوم والبوتاسيوم تصرف (الشكل 4). AHP ن الإيجابية والسلبيةتظهر eurons لربط مع ه والخلايا العصبية S ينظر في العمل غينيا السابقة، على التوالي. AHP الخلايا العصبية الإيجابية (الخلايا العصبية ه) لديها توقعات طويلة متعددة منشؤها من جميع أنحاء خلايا الجسم، في حين أن الخلايا العصبية السلبية AHP (S الخلايا العصبية) لديها الإسقاط واحدة طويلة والتي فروع عدة مرات. هذا، جنبا إلى جنب مع الترميز immunocytochemical في الشكل 1، تشير إلى أن الخلايا العصبية السكان غير متجانسة جدا.
الشكل 1. توصيف المناعى للخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية معزولة من العضلات الطولية الماوس. كشف الفحص المجهري متحد البؤر β-III-تويولين (Abcam، أرنب، 1:1،000) تلطيخ الخلايا العصبية الخاصة في جبل بأكمله اللفائفية العضلات الطولية (A) من إعداد الماوس. خلايا معزولة من Lالعضلات / العضلية المعوية الضفيرة (LMMP) الاستعدادات ongitudinal تحتوي على الخلايا العصبية (B؛ β-III-تويولين، Abcam، أرنب، 1:1،000) أن وصمة عار إيجابيا لcalbindin (C) (Chemicon، أرنب، 1:1،000) وcalretinin (D) (Swant، أرنب، 1:2،000). كانت الخلايا الدبقية (E) تصور مع GFAP علامة الدبقية محددة (Chemicon، والماوس، 1:500). كانت الأجسام المضادة عبر تصور المناسبة الماعز الثانوية الأضداد اليكسا 488 (أخضر، المسابر الجزيئية، 1:1،000) 0. نوى كانت تصور باستخدام Hoescht 33342 (الأزرق، CG، 1 ميكروغرام / مل). ولم يلاحظ تلطيخ عندما حذفت الأجسام المضادة الأولية (F). . تعديل وأعيد طبعه من سميث، TH، وآخرون المورفين يقلل المعوية استثارة الخلايا العصبية عن طريق تثبيط قنوات الصوديوم بلوس واحد، دوى:. 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012) انقر هنا لعرض أكبر شخصية <./ P>
الشكل 2. الخلايا العصبية والدبقية معزولة من العضلات الطولية الماوس تنمو على مقربة من بعضها البعض. الصور المجهري متحد البؤر تشير إلى الخلايا العصبية (الخضراء، β-III-تويولين، Abcam، أرنب، 1:1،000) والدبقية (أحمر، GFAP، Chemicon، والماوس ، 1:500) تنمو بسهولة المجاورة لبعضها البعض، ويبدو أن التفاعل في المختبر. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل (3). الكهربية للخلايا العصبية المعوية مثقف والدبقية. في CUوضع المشبك rrent، كل الخلايا العصبية (A) عرض إمكانات العمل على حقن الحالي. الدبقية (B) لا تملك إمكانات العمل ولكن لا عرض إمكانات تيار كهربي كبير في استجابة لحقن الحالي. البروتوكولات في A & B مع بداية الحقن الحالية من -0.01 نا وزيادة إلى 0.09 NA في أحد عشر خطوات 0.01 NA. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4. الخلايا العصبية مثقف من الدقاق الماوس هي مجموعة سكانية غير متجانسة electrophysiologically. في وضع الشبك الحالية، وحقن الحالي من 0.09 NA في الخلايا العصبية النتائج في إمكانات العمل. S الخلايا العصبية (A)، والعودة فورا إلى غشاء المحتملة يستريح جمعةollowing التحفيز. AH-نوع الخلايا العصبية (B) عرض على فرط الاستقطاب التلوي (AHP) بعد التحفيز الذي يقع في غشاء المحتملة يستريح تحت خط الأساس قبل أن تعود ببطء إلى القيمة الأولية. . تعديل وأعيد طبعه من سميث، TH، وآخرون المورفين يقلل المعوية استثارة الخلايا العصبية عن طريق تثبيط قنوات الصوديوم بلوس واحد، دوى:. 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحيوانات المستخدمة
وقد تم تحسين هذا البروتوكول بالنسبة السويسري الفئران ويبستر. ومع ذلك، وهذه الطريقة غير قابلة للتكيف بسهولة إلى غيرها من الثدييات الصغيرة مثل الفئران وغيرها من سلالات من الفئران. لقد أجرينا بنجاح العزلة الأولية مع C57 الفئران ومستقبلات μ-الأفيونية تدق الرافضة. ومع ذلك، فمن الممكن أيضا أن سلالات أخرى من الفئران قد تكون إشكالية بسبب الاختلافات المورفولوجية في الجهاز الهضمي. وعلاوة على ذلك، هناك اختلافات معروفة بين سلالات الفئران (C57BL / 6 مقابل BALB / ج) في الدوائر العصبية من إعداد LMMP 13، والتي يمكن أن تؤثر على مزيج الناتجة من الخلايا العصبية في العزلة النهائية. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار العمر عند استخدام هذا الأسلوب، كما تحدث خسائر العصبية المرتبطة بالعمر في الضفيرة العضلية المعوية التي هي محددة لالخلايا العصبية كوليني والدبقية المقابلة لها، ويمكن أن ينظر إليه في وقت مبكر من سن 12 شهرا 14. وأخيرا، عندما التكيف مع هذا البروتوكول على SPECI أخرىES من الحيوانات، ينبغي توخي الحذر لضمان أن الضفيرة العضلية المعوية يأتي بعيدا مع العضلات الطولية بدلا من البقاء تعلق على العضلات الدائرية.
أنسجة المستخدمة
الخلايا العصبية والدبقية يمكن تربيتها من كل من اللفائفي والقولون باستخدام هذا البروتوكول. العزلة اللفائفية هي أسهل لأداء نظرا لوجود قدر أكبر من الأنسجة المتاحة وسهولة في العضلات الطولية التي يفصل من عضلة دائرية سميكة. وهناك حاجة إلى ما لا يقل عن اثنين من الحيوانات لاحتلال 12 بئرا من لوحة 24 أيضا لتطبيقات مثل الكهربية أو مناعية. عزل المواد القولون هو أكثر إشكالية. عضلة طولية سميكة القولون هو أكثر صعوبة لفصل من العضلات الدائرية. وعلاوة على ذلك، فإن عضلة دائرية الأساسي هو أرق في القولون، مما يجعلها أكثر عرضة للدموع. أيضا، والقولون هو أقصر بكثير من الدقاق ذلك هناك حاجة إلى ثلاث الحيوانات، في الحد الأدنى، لشغل 12 وأهلا وسهلاLS من 24 لوحة جيدا. كل من اللفائفي والقولون يمكن حصاده ومطلي بشكل منفصل من نفس الحيوان، ولكن سوف تكون هناك حاجة إضافية الحيوانات أو استخدام أقل مساحة طلي الخلية لعزل القولون.
مدة خلية ثقافة
يتم إجراء التسجيلات الكهربية على النحو الأمثل في الخلايا العصبية معزولة المعوية / الدبقية بعد 2-6 أيام في الثقافة، في هذا الوقت الخلايا، الظروف المثالية تقريب ومطواعة لصنع ختم خلية كاملة. بعد أسبوع في الخلايا الثقافة تصبح تملق ويفرق أكثر جمالا مثل خلايا التمسك لوحة. تجارب Immunocytochemical من الأفضل القيام به عندما تعلق الخلايا بشكل أكبر على لوحة، وحول يوم 10، لمنع فقدان الخلية خلال العديد من الخطوات يغسل. وقد تم الحفاظ على الخلايا المعوية الماوس في الثقافة لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع. أنماط من مستقبلات الناقل العصبي والتعبير مع مرور الوقت لم يتم بعد دراستها في هذه الثقافات. ومع ذلك، والدراسات السابقة على بقاء الخلايا العصبيةولقد وجدت البيوكيميائية / التفاضل المورفولوجية في غينيا خنزير العزلة الخلايا العصبية المعوية التقليدية أن الخلايا العصبية على قيد الحياة تصل إلى 15 يوما، والحفاظ على درجة عالية من الخصائص النسيجية والصرفية تصل إلى ثلاثة أسابيع 8، مما يوحي بأن الخلايا العصبية المشتقة من مصادر الحيوانات الأخرى قد تحذو حذوها .
الربح الخلية
العائد الإجمالي من الخلايا من هذه التقنية هو 12 بئرا من 24 لوحة جيدا من اثنين من الفئران عندما عزل من الدقاق. هذا هو عدد قليل نسبيا من الخلايا العصبية مقارنة مع حجم الأنسجة، كما الضفيرة العضلية المعوية يتكون من أقل من 1٪ من إجمالي جدار الأمعاء. عيب واحد إلى هذا الأسلوب هو أن لزيادة عدد الخلايا التي تم الحصول عليها، يجب على المرء أن زيادة عدد الحيوانات المستخدمة. عندما يتم زيادة أعداد الحيوانات، يقترح أن يتعاون العديد من أعضاء المختبر في الخطوة الأولى من عزلة LMMP. وهذا يقلل من مقدار الوقت الذي الخلايا في حالة تعطل قبل النهائي فlating وهذا يزيد من بقاء الخلية.
كثافة الخلايا
كما هو مكتوب، ويستخدم هذا البروتوكول حيوانين لتسفر عن العزلة اللفائفية من التقاء الخلية منخفض الكثافة (~ 10 - 40٪ قياس بعد يوم واحد في الثقافة). طلي الخلية منخفض الكثافة هو المثل الأعلى في هذه المنهجية للحد من مخاطر التلوث في الثقافة النهائي. ومن المفيد أيضا عندما يتم تنفيذ الكهربية خلية واحدة. ويمكن زيادة عدد الخلايا باستخدام أكثر الحيوانات أو تقليص مساحة الطلاء النهائي، ولكن يزداد خطر التلوث. إلى المقاصة هذه المشكلة عندما يتطلب الأمر كثافة الخلية العالي، إما زيادة يقترح خطوات غسل أو زيادة استخدام المضادات الحيوية.
التجانس الخلية
وتتكون الخلايا العصبية الحصول عليها باستخدام هذه البروتوكولات من اثنين على الأقل من السكان وظيفيا متميزا، كما يتبين من توصيف الكهربية (الشكل 3). ومع ذلك، هناك العديد من أنواع معروفة من الخلايا العصبية مع أنماط الترميز الكيميائية العصبية محددة وجدت في غينيا خنزير 15 ونفس الشيء ربما كان صحيحا من الفأرة. هذا التجانس الخلية على حد سواء ميزة وعيب لهذه المنهجية. التجانس الخلية هو مفيد عند تنفيذ الدراسات الفنية وحيدة الخلية، ومراقبة التفاعلات خلية خلية أو في كيمياء سيتولوجية مناعية، من بين آخرين. عدم التجانس الخلية قد يكون من المفيد بشكل خاص عند دراسة الخلايا العصبية / الدبقية التفاعلات في الثقافة (الشكل 3). ومع ذلك، عدم التجانس الخلية يشكل عائقا أمام منهجيات مثل immunoblotting، حيث التغييرات في تعبير البروتين، وما إلى ذلك، لا يمكن أن يساهم إلى أي نوع من الخلايا واحد أو نوع الخلايا العصبية. وسوف يكون فحص الخلايا الدبقية أقل إثارة للمشاكل كما تظهر اثنين فقط من الأنواع الفرعية في الوجود في إعداد LMMP: intraganglionic والعضلي الدبقية المعوي 16. قد تكون أنواع الخلايا الأخرى موجودة أيضا في هذه الثقافة، مثل الخلايا الخلالي من كاجال أو الخلايا الليفية.
الجيش الشعبي "> خلايا الطلاءفي هذه المنهجية، ومطلي الخلايا في اثني عشر بئرا. في بعض الأحيان، وسوف واحد أو اثنين من هذه الآبار تطوير تلوث في اليوم الأول بعد العزلة. في حالة حدوث ذلك، يتم تجاهل فورا الشرائح من الآبار الملوثة ويتم شطف جيدا مع الايثانول 70٪ لقتل تلوث المتبقية. هذا البروتوكول يمكن تعديلها لوحة كافة الخلايا المعزولة في عدد أقل من الآبار أو في طبق واحد، ونتيجة لذلك، فإن خطر التلوث زيادة. مرة أخرى، عندما يقترح مخاطر زيادة التلوث، خطوات غسل إضافية أو زيادة استخدام المضادات الحيوية. السائل مضاد حيوي / مضاد فطري (GIBCO) المستخدمة في بروتوكول يتكون من الامفوتريسين B، الستربتوميسين، والبنسلين. تركيبات المضادات الحيوية الأخرى أو زيادة تركيزات يمكن استخدامها لتحسين الحد من التلوث أثناء إعداد شطف واستكمال وسائل الاعلام الخلايا العصبية.
خلايا إرفاق
ومطلي الخلايا علىcoverslips على المغلفة مع laminin وبولي-D-يسين. Laminin المهم في بقاء الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية، وتشجع ثمرة neurite والتنمية العصبية 17، وعلى هذا النحو، ويعتبر عنصرا أساسيا في هذه العزلة. ومع ذلك، يجوز محاكمة العوامل مرفق بديل للبولي-D-يسين، مثل الأورنيثين أو Matrigel، كما تريد.
في الختام، هذه العزلة توفر ثقافة مختلطة من الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية مناسبة لمجموعة واسعة من التقنيات الدراسة. هذه المنهجية هي سهلة لإتقان، وغير مكلفة، وفعالة وقت. ويحدونا الأمل في أن هذا النموذج الخلية ستسهم في فهم مختلف الأمراض المرتبطة ENS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه لا توجد المصالح المتنافسة الرئيسية.
Acknowledgments
المعهد الوطني للصحة منح DA024009، DK046367 وT32DA007027.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
- Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
- Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
- Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
- Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
- Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
- Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).
- Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
- Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
- Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
- Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
- Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
- Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
- Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).
