Abstract
Le système nerveux entérique est un vaste réseau de neurones et de cellules gliales sur toute la longueur du tractus gastro-intestinal fonctionnel qui contrôle la motilité gastro-intestinale. Une procédure pour l'isolement et la culture d'une population mixte de neurones et de cellules gliales du plexus myentérique est décrite. Les cultures primaires peuvent être maintenus pendant plus de 7 jours, avec des connexions en développement parmi les neurones et les cellules gliales. La bande de muscle longitudinal avec le plexus myentérique joint est extrait du muscle circulaire sous-jacente de l'iléon de la souris ou du côlon, et soumis à une digestion enzymatique. Dans des conditions stériles, la population neuronale et la glie isolées sont conservées au sein de la centrifugation suivant granulés et étalées sur des lamelles. 24-48 h, neurites se produit et les neurones peuvent être identifiés par des marqueurs pan-neuronales. Après deux jours de culture, les neurones isolés incendie potentiels d'action comme observé par des études de patch-clamp. En outre, les cellules gliales entériques peut aussi être identifIED par GFAP coloration. Un réseau de neurones et de cellules gliales en étroite apposition forme au sein de 5-7 jours. Neurones entériques peuvent être individuellement et directement étudiée en utilisant des méthodes telles que l'immunohistochimie, l'électrophysiologie, imagerie calcique, et PCR unicellulaire. En outre, cette procédure peut être effectuée sur des animaux génétiquement modifiés. Cette méthode est simple à réaliser et peu coûteux. Dans l'ensemble, ce protocole expose les éléments du système nerveux entérique d'une manière facile à manipuler de sorte que nous puissions mieux découvrir les fonctionnalités de l'ENS dans les états normaux et pathologiques.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
ddH2O | Can prepare in lab | ||
15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
F12 media | Gibco | 11330 | |
Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
Equipment | |||
LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
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