Summary
De in dit document beschreven methoden zien hoe je een commerciële inkjet printer omzetten in een bioprinter met gelijktijdige UV-polymerisatie. De printer is geschikt voor het construeren van 3D-weefselstructuur met cellen en biomaterialen. De studie hier toonde construeerde een 3D neocartilage.
Abstract
Bioprinting, die is gebaseerd op thermische inkjettechnologie, is een van de meest aantrekkelijke technologieën op het gebied van tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Met digitale controle cellen, scaffolds en groeifactoren nauwkeurig kan worden gestort op de gewenste tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) locaties snel. Daarom is deze technologie is een ideale aanpak van weefsels nabootsen van hun eigen anatomische structuren te fabriceren. Om kraakbeen ingenieur met inheemse zonale organisatie, extracellulaire matrix samenstelling (ECM) en mechanische eigenschappen, ontwikkelden we een bioprinting platform met behulp van een commerciële inkjet printer met gelijktijdige fotopolymerisatie staat voor 3D kraakbeen tissue engineering. Menselijke chondrocyten gesuspendeerd in poly (ethyleenglycol) diacrylaat (PEGDA) werden 3D neocartilage bouw via laag-voor-laag assemblage afgedrukt. De gedrukte cellen werden gefixeerd op hun oorspronkelijke posities afgezet, ondersteund door de omgevibeuken erin steiger in gelijktijdige fotopolymerisatie. De mechanische eigenschappen van de gedrukte weefsel waren vergelijkbaar met de natieve kraakbeen. Vergeleken met conventionele weefsel fabricage, die langer UV belichting vereist, de levensvatbaarheid van de afgedrukte cellen met gelijktijdige fotopolymerisatie was significant hoger. Gedrukt neocartilage aangetoond uitstekend glycosaminoglycaan (GAG) en collageen type II-productie, die consistent zijn met de genexpressie was. Daarom is dit platform is ideaal voor nauwkeurige cel distributie en regeling voor anatomische tissue engineering.
Introduction
Bioprinting basis van thermische inkjet printen is een van de meest veelbelovende technologieën op het gebied van tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Met digitale regeling en hoge doorvoer printkoppen cellen, scaffolds en groeifactoren nauwkeurig kan worden gestort op de gewenste tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) posities snel. Vele succesvolle toepassingen zijn gerealiseerd met behulp van deze technologie in de tissue engineering en regeneratieve geneeskunde 1-9. In dit artikel werd een bioprinting platform opgericht met een gemodificeerde Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 thermische inkjet printer en een gelijktijdige fotopolymerisatiesysteem. Synthetische hydrogels samengesteld uit poly (ethyleenglycol) (PEG) hebben het vermogen handhaven chondrocyte levensvatbaarheid en bevorderen chondrogene ECM produktie 10,11. Daarnaast fotoverknoopbare PEG is zeer goed oplosbaar in water met een lage viscositeit, waardoor het ideaal is voor gelijktijdige Polymer maaktrization tijdens 3D bioprinting. In deze paper, menselijke chondrocyten gesuspendeerd in poly (ethyleen) glycoldiacrylaat (PEGDA; MW 3400) werden juist afgedrukt op neocartilage laag-voor-laag te bouwen met 1.400 dpi resolutie in 3D. Homogene verdeling van afgezette cellen in een 3D steiger waargenomen, die kraakbeenweefsel gemaakt met uitstekende mechanische eigenschappen en verbeterde ECM produktie. Daarentegen handmatige fabricage de cellen geaccumuleerde onderaan de gel in plaats van de oorspronkelijk gedeponeerd posities door tragere polymerisatie steiger, die tot inhomogene kraakbeen na kweek 2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bioprinting Platform Oprichting
De printer wijziging was gebaseerd op een HP Deskjet 500 thermische inkjet printer en HP 51626A zwarte inktcartridge.
- Verwijder de bovenste plastic kap van de printer en voorzichtig los van het bedieningspaneel van de dekking.
- Maak de 3 kabelverbindingen tussen de printer bovenste gedeelte en de basis. Verwijder de printer bovenste gedeelte van de basis.
- Op de printer bovenste gedeelte, verwijder de kleine plastic en rubber onderdelen (printkop reinigingssysteem) aan de rechterkant onder de inktpatroon.
- Verwijder de voet van de papierlade met veren.
- Verwijder de metalen plaat die de plastic papierinvoer bar.
- Snij het plastic papierinvoer bar in het midden voedingswiel positie met behulp van een handzaag of een ander snijgereedschap.
- Verwijder de 2 papierinvoer wielen blootgesteld na de vorige stap. Het wiel plastic is erg hard en een elektronischzaag zal nuttig zijn.
- Maak de stof en vuil met behulp van ingeblikte lucht en ethanol doekjes.
- Bevestig de printer bovenste gedeelte naar de basis.
- Uv de gewijzigde printer minstens 2 uur in een laminaire stroming kap steriliseren voor gebruik.
- Snijd de dop van een HP 51626A inktcartridge met behulp van een handzaag of een ander snijgereedschap.
- Leeg de inkt en verwijder het filter dat de bodem goed reservoir van het kraakbeen behandelt.
- Spoel de cartridge grondig met stromend water.
- Ultrasonicate de patroon in gedeïoniseerd (DI) water gedurende 10 minuten om de resterende inkt te verwijderen.
- Onderzoek de cartridge om ervoor te zorgen dat alle inkt is verwijderd. Spoel of spuit de cartridge grondig met 70% ethanol voor de sterilisatie, gevolgd door gesteriliseerd DI water.
- Opzetten van een lange-golflengte ultraviolet lamp boven de drukplatform gelijktijdige fotopolymerisatie capaciteit te bieden.
- Meet UV-intensiteit bij de drukkerij-platform met behulp van een UV-lichtmeter. Stel de afstand tussen de UV lamp en het printerplatform zodat de intensiteit bij het afdrukken onderwerp van 4-8 mW / cm 2 (ongeveer 25 cm van licht naar printerplatform).
2. Bioink Voorbereiding
- Monolaag chondrocyten expansie
- Plate 5.000.000 humane chondrocyten in elk T175 weefselkweekfles voor celexpansie in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 10% kalfsserum en 1 x penicilline-streptomycine-glutamine (PSG). Cultuur cellen bij 37 ° C met bevochtigde lucht met 5% CO2. Verander het kweekmedium om de 3 dagen totdat de kolf is 85% samenvloeiing. Gebruik cellen van dezelfde passage.
- Los PEGDA in PBS tot een eindconcentratie van 10% w / v. Foto-initiator I-2959 Naar een eindconcentratie van 0,05% w / v. Filter steriliseren van de oplossing.
- Opschorten gekweekte menselijke chondrocyten in de bereide PEGDA oplossing bij 5 x 10 6 cellen /ml.
3. Kraakbeenweefsel Printing
- Zet de printer en de laptop.
- Maak een drukkerij patroon van een rondje met 4 mm in diameter met behulp van Microsoft Word of Adobe Photoshop.
- Pas de positie van het patroon en zorg ervoor dat het precies in de plastic mal te drukken.
- Bereken het aantal afdrukken nodig is om de gewenste dikte van de steiger bereiken. Voor 4 mm hoog zijn 220 drukt om de gewenste steiger creëren.
- Laad de bioink in de inkt cartridge. Bedek de cartridge met aluminiumfolie om te beschermen tegen de directe blootstelling aan UV tijdens het afdrukken.
- Stuur printopdracht naar de printer. Trek het papier sensor als de printer begint af te drukken. Het hele drukproces zou minder dan 4 minuten om een steiger met 4 mm in diameter en 4 mm hoog.
- Afgedrukt overdracht neocartilage een 24-well plaat en voeg 1,5 ml kweekmedium aan elk putje.
- Incubeer de gedrukte neocartilage in live / DEAD Leefbaarheid / cytotoxiciteit werkende oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten in het donker.
- Snijd de cel beladen hydrogel in de helft en neem fluorescerende beelden van de snij-gebied.
- Count live-(groen) en dode (rode) cellen door een geblindeerde waarnemer op vijf willekeurig genomen beelden. Bereken cellevensvatbaarheid door het aantal levende cellen door het totale aantal levende en dode cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gewijzigde thermische inkjet printer in staat was voor cel-en steiger afzetting bij hoge doorvoer en uitstekende levensvatbaarheid van de cellen. Combineren met gelijktijdige fotopolymerisatie en lichtgevoelige biomaterialen, deze technologie kan de cellen en andere gedrukte stoffen vast aan de oorspronkelijk gedeponeerd locaties. Volgens de eigenschappen van de gemodificeerde thermische inkjetprinter, de 2D afdrukresolutie is 300 dpi met een inktdruppel volume van 130 pl. Er zijn 50 bakken sproeiers in elke printkop met 3,6 kHz spuitfrequentie 12,13. Dus voor een representatief construct van 4 mm diameter en 4 mm hoogte, het volume en de dikte van elke gedrukte laag in laag-voor-laag constructie was 0,23 pl en 18 urn respectievelijk. Het hele drukproces duurde minder dan 4 minuten aan de kraakbeenweefsel (figuur 1) construeren.
Figuur 2A toont een gelijkmatige verdeling van de cel printed chondrocyten in 3D steiger als gevolg van gelijktijdige fotopolymerisatie van de omliggende steiger tijdens cel depositie. Daarentegen, zonder gelijktijdige fotopolymerisatie (scaffold gepolymeriseerde na zaaien van cellen), de gedeponeerde cellen zonk naar de bodem of zonale interface in plaats van de oorspronkelijk gedeponeerd bestemmingen van de zwaartekracht (figuur 2B). Deze cel accumulatie werd waargenomen in eerdere verslagen handmatige fabricage van kraakbeenweefsel 14,15. De gedrukte menselijke chondrocyten in 3D PEG hydrogel hersteld chondrogenische fenotype en gedemonstreerd geleidelijk verhoogd proteoglycaan productie in de cultuur (figuur 3) 3.
Figuur 1. Gedrukt neocartilage weefsel. A) Schematische voorstelling van kraakbeen bioprinting met gelijktijdige fotopolymerisatie en leger-voor-laag assemblage. B) Een gedrukte neocartilage weefsel met 4 mm in diameter en 4 mm hoog. Scale Bar = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Chondrocyten gelabeld met groen en oranje fluorescerende kleurstoffen toonde de zonale kraakbeen bioprinting haalbaarheid. A) Gedrukt cellen behouden hun oorspronkelijk gedeponeerd posities in de 3D-hydrogel. Het drukken en fotopolymerisatie proces voltooid in 4 minuten met cel levensvatbaarheid van 90% (n = 3). B) Cellen verzameld om de bodem of interface door zwaartekracht zonder gelijktijdige fotopolymerisatie. Het duurde 10 minuten UV-blootstelling aan de construct gel met dezelfde grootte van een met een cel levensvatbaarheid van63% (n = 3). Schaal bar = 100 urn.
Figuur 3. Safranine-O kleuring van gedrukte chondrocyten in PEG hydrogel blijkt te zijn toegenomen proteoglycaan productie in de cultuur. Schaal bars = 100 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze 3D bioprinting systeem met gelijktijdige fotopolymerisatie capaciteit geeft een significant hogere printresolutie dan de beste eerder beschreven methode in situ drukken van osteochondrale defecten middels spuit geëxtrudeerd cellulair hydrogel 16. Hogere resolutie printen is bijzonder kritisch voor kraakbeen tissue engineering aan de anatomische kraakbeen zonale organisatie te herstellen. Gelijktijdige fotopolymerisatie in laag-voor-laag assemblage cruciaal nauwkeurige afzetting van cellen en biomateriaal scaffolds voor 3D constructie behouden. Microfabricage met elke bedrukte laag ook tot vloeiende overgangen tussen zonale lagen, het minimaliseren van de mogelijkheid van afbraak door delaminatie. Door het nauwkeurig instellen van de bioprinting parameters en componenten van de bioink, zullen we in staat zijn om de complexe 3D-structuren nodig zijn om een breed scala van kraakbeenletsels te genezen fabriceren.
Met synergistic groeifactor stimulatie, de bioprinted neocartilage had de beste chondrogenische fenotype en meest celproliferatie 3. Daarom is de cel zaaidichtheid gebruikt in deze studie, die haalbaar is voor bioprinting is ook ideaal voor het herstel van kraakbeen bij behandeling met geschikte groeifactoren. Kraakbeenherstel die autologe chondrocyten sterk beperkt in klinische toepassingen vanwege het beperkte aantal chondrocyten geoogst in biopsie. Implantatie van de rechtstreeks geoogste autologe chondrocyten of mesenchymale stamcellen (MSC's) samen met biomaterialen voor kraakbeenherstel zonder monolaag uitbreiding is buitengewoon aantrekkelijk. Daarom is het essentieel om de afgedrukte celaantallen uitbreiden naar de optimale celdichtheid vereist voor kraakbeenvorming zonder de kwaliteit van de kraakbeenmatrix gezien het beperkte aantal cellen. Bovendien beperken de initiële celdichtheid sterk zal optimaliseren en de bioprinting resolutie. Aldus de bioprinting hier beschreven werkwijze is volledig compatibel met de lage celaantallen in klinische omgeving en heeft het potentieel om te worden gebruikt voor kraakbeen tissue engineering.
Tot slot, ons werk toont de haalbaarheid van het vervaardigen van anatomische kraakbeen structuren door het leveren van chondrocyten en biomateriaal steiger materialen om nauwkeurig gerichte posities. Een PEG hydrogel met humane chondrocyten werd continu bioprinted via layer-by-layer assembly. Gelijktijdig fotopolymerisatie handhaafde de geprinte zonnecellen op hun eerste gedeponeerde posities en verminderde fototoxiciteit. Cellen in de gedrukte neocartilage onderhouden chondrogenische fenotype met consistente expressie van genen en biochemische analyse 2. Daarom is deze technologie is een veelbelovende vooruitgang voor anatomische kraakbeen tissue engineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financieel belang in deze studie.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de steun van de New York Hoofdstedelijk Gewest Research Alliance Grant erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
References
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
- Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
- Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
- Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
- Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
- Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
- Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).
