Summary
このホワイトペーパーで説明する方法は、同時UV重合とbioprinterに市販のインクジェットプリンターを変換する方法を示しています。プリンタは、細胞と生体材料との三次元組織構造を構築することが可能である。ここに実証研究では、3Dの新軟骨を構築した。
Abstract
サーマルインクジェット印刷に基づいていますBioprintingは、組織工学や再生医療の分野で最も魅力的な実現技術の一つです。急速にデジタルコントロール細胞、足場、および成長因子が正確に所望の2次元（2D）に付着させることができるとともに、三次元（3D）の位置。そのため、この技術は、ネイティブの解剖学的構造を模倣組織を作製するための理想的なアプローチです。天然の帯状組織、細胞外マトリックス組成物（ECM）、および機械的特性を有する軟骨を操作するために、我々は3次元軟骨組織工学のための可能な同時重合を有する市販のインクジェットプリンタを用いbioprintingプラットフォームを開発した。ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（PEGDA）に懸濁したヒト軟骨細胞を、レイヤーバイレイヤーアセンブリを介して3D新軟骨構築のために印刷した。印刷された細胞は、surroでサポートされて、元の堆積の位置に固定し、同時光重合に足場をunding。印刷された組織の機械的特性は、天然の軟骨と同様であった。長いUV露光を必要とする従来の組織の製造と比較して、光重合と同時印刷細胞の生存率は有意に高かった。印刷された新軟骨は、遺伝子発現と一致した優れたグリコサミノグリカン（GAG）およびコラーゲン型II産生を実証した。そのため、このプラットフォームは、解剖学的、組織工学のための正確な細胞の分布や配置に最適です。
Introduction
サーマルインクジェット印刷に基づくBioprintingは、組織工学や再生医療の分野で最も有望な実現技術の一つです。デジタル制御および高スループットのプリントヘッドを有する細胞、足場、および成長因子は、正確に迅速に所望の2次元（2D）および3次元（3D）の位置に堆積させることができる。多くの成功したアプリケーションは、組織工学および再生医療1-9に、この技術を用いて達成されてきた。本論文では、bioprintingプラットフォームが変更されたヒューレット·パッカード社（HP）DeskJet 500サーマルインクジェットプリンタと同時光重合系に設立されました。ポリ（エチレングリコール）（PEG）から配合する合成ヒドロゲルは、軟骨細胞の生存能力を維持し、軟骨ECM産生を促進10,11の容量を示している。また、光架橋PEGは同時polymeに最適です低粘度、水への溶解性が高いです。3次元bioprinting中にrization。本論文では、ポリ（エチレン）グリコールジアクリレート（PEGDA、MW 3400）に懸濁させ、人間の軟骨細胞を精密に3次元解像度1,400 dpiので新軟骨の層ごとに構築するために印刷した。 3D足場における細胞の堆積の均一な分布は、優れた機械的性質および拡張ECM産生に軟骨組織を生成した、観察された。対照的に、マニュアル製造において細胞は、培養後の2,3不均一な軟骨形成をもたらし代わりに遅い足場重合によるそれらの最初に堆積位置のゲルの底部に溜まった。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。Bioprintingプラットフォームの確立
プリンタ修飾は、HPデスクジェット500サーマルインクジェットプリンタおよびHP 51626Aブラックインクカートリッジに基づいていた。
- プリンタの上部のプラスチックカバーを取り外し、慎重にカバーからコントロールパネルを取り外す。
- プリンタ頂部と基部との間に3ケーブルの接続を外します。ベースからプリンタのトップ部分を取り外します。
- プリンタのトップ部には、インクカートリッジの下に右側に小さなプラスチックとゴム付属品（プリントヘッドクリーニングシステム）を外します。
- スプリングを用紙トレイのベースを取り外します。
- プラスチック、紙送りバーをカバーする金属製のプレートを取り外します。
- ハンドのこぎり又は他の切断ツールを使用して中央給電車輪位置におけるプラスチック、紙送りバーを切り落とした。
- 前のステップの後に公開される2給紙ホイールを取り外します。ホイールプラスチックは非常に難しいと電子であるSAWは参考になります。
- 缶詰の空気とエタノールワイプを使用してほこりやごみを清掃してください。
- ベースにプリンタ頂部を取り付けます。
- UVは、使用する前に、層流フード内で少なくとも2時間変性プリンタを滅菌する。
- ハンドソーや他の切削工具を使用して、HPの51626Aのインクカートリッジのキャップを切り取ります。
- インクを空にし、軟骨の下の井戸貯水池をカバーしてフィルタを削除します。
- 水道水を使用して徹底的にカートリッジを洗浄します。
- Ultrasonicate残留インクを除去するために10分間、脱イオン（DI）水中のカートリッジ。
- すべてのインクが削除されていることを確認するカートリッジを調べます。滅菌脱イオン水に続いて殺菌のため70％エタノールで徹底的にカートリッジを、すすぎ又はスプレー。
- 同時光重合能力を提供するために、印刷プラットフォームの上に長波長紫外線ランプを設定する。
- UV光を用いて印刷プラットフォームでのUV強度を測定メートル。印刷対象の強度が4-8の間MW / cm 2と （プリンタプラットフォームへのランプから約25 cm）で すので、UVランプとプリンタプラットフォーム間の距離を調整します。
2。Bioink準備
- 単層の軟骨細胞の拡大
- ダルベッコでの細胞増殖のための各T175組織培養フラスコにプレート500万ヒト軟骨細胞は10％ウシ血清および1×ペニシリン - ストレプトマイシン - グルタミン（PSG）を補足したイーグル培地（DMEM）を修正しました。 5％CO 2を含む加湿空気で37℃で培養細胞。フラスコに85％コンフルエントになるまで、3日ごとに培養液を変更します。同じ継代から細胞を使用してください。
- 10％w / vの最終濃度にPBSでPEGDAを溶解0.05％w / vの最終濃度になるように光開始剤I-2959を追加解決策を滅菌ろ過する。
- 5×10 6細胞で調製PEGDA液中で培養したヒト軟骨細胞を一時停止/ミリリットル。
3。軟骨組織印刷
- プリンタとノートパソコンの電源をオンにします。
- Microsoft WordやAdobe Photoshopのを使用して、直径4ミリメートルと黒丸の印刷パターンを作成します。
- パターンの位置を調整して、プラスチック金型に正確に印刷されることを確認してください。
- 足場の所望の厚さに達するのに必要な印刷部数を計算する。高さ4ミリメートルの場合は、220プリントが必要な足場を作成する必要があります。
- インクカートリッジにbioinkをロードします。印刷中に直接UV暴露から保護するためにアルミホイルでカートリッジを覆う。
- プリンタに印刷コマンドを送信します。プリンタが印刷を開始したときに、用紙センサーを引き出します。全体の印刷プロセスは、直径4ミリメートル、高さ4ミリメートルと足場未満4分を取る必要があります。
- 転写は、24ウェルプレートに新軟骨を印刷し、各ウェルに1.5ミリリットルの培養培地を加える。
- 暗所で15分間室温での生/死生存率/細胞毒性作用溶液で印刷新軟骨を培養する。
- 半分に細胞を含んだハイドロゲルをカットし、切削領域の蛍光画像を撮影。
- 5ランダムに撮影した画像で盲目観察者（緑）、死者（赤）細胞生存数える。生細胞および死細胞の総数によって生細胞数で割ることによって細胞生存率を計算する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
修飾されたサーマルインクジェットプリンタは、高スループット、優れた細胞生存率及び足場における細胞の堆積のために可能であった。同時光重合感光生体材料との組み合わせは、この技術は、最初に堆積場所に細胞および他の印刷された物質を固定することができます。修飾されたサーマルインクジェットプリンタの特性に応じて、2D印刷解像度が130 plの単一のインク滴の体積の300解像度であった。 3.6 kHzの発射周波数12,13と各プリントヘッド内の50の発射ノズルがあります。したがって直径4mmと4ミリメートルの高さ、ボリュームと層ごとの建設中の各印刷層の厚さの代表構築物について、それぞれ、0.23μLおよび18μmであった。印刷プロセス全体は、軟骨組織（ 図1）を構築し未満の4分間かかった。
図2Aは、原則の偶数細胞分布を示しているテッドは、細胞の堆積の間、周囲の足場の同時光重合に3D足場軟骨細胞。これとは対照的に、同時光重合（細胞播種後に重合足場）なしで、堆積した細胞ではなく、重力（ 図2B）に起因する彼らの最初に堆積箇所の底部または帯状インターフェイスに沈んだ。この細胞蓄積はまた、軟骨組織14,15のマニュアル製造の以前の報告で観察された。 3D PEGヒドロゲル中の印刷されたヒト軟骨細胞は、軟骨形成表現型を回復し、培養中に徐々に増加プロテオグリカン生成します（ 図3）3 を示した。
図1。プリント新軟骨組織。 A）、同時光重合と軟骨bioprintingの回路図およびレイアウトERバイレイヤーアセンブリ直径4mm、高さ4ミリメートルで。B）A印刷新軟骨組織。 = 2ミリメートルスケールバー。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。緑とオレンジの蛍光色素で標識された軟骨細胞は、帯状の軟骨bioprintingの実現可能性を実証した。 A）プリントの細胞は、3Dハイドロゲルでの最初に堆積位置を維持した。 90％の細胞の生存率を4分で完了し、印刷して、光重合プロセス（N = 3）の同時光重合することなく、重力により底部またはインタフェースに蓄積された。B）細胞。これは、細胞生存率を有するAの同じ大きさの構築物をゲル化するためにUV曝露の10分を要し63％（n = 3）であった。スケールバー=100μmである。
図3。PEGヒドロゲルショーにおけるプリント軟骨のサフラニン-O染色が培養中にプロテオグリカン産生を増加させた。スケールバー=100μmである。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
同時光重合能力を持つこの3D bioprintingシステムは、細胞のアルギン酸ハイドロゲル16を押し出し、注射器を用いて骨軟骨欠損のその場での印刷において最高の以前に報告された方法よりもかなり大きい印刷解像度を提供します。高い印刷解像度は、解剖学的軟骨帯状組織を復元するために軟骨組織工学のために特に重要です。層ごとの組み立て中の同時光重合は、3D建設のための細胞や生体材料足場の正確な堆積を維持することが重要です。印刷された各レイヤでの微細加工はまた、層間剥離による劣化の可能性を最小限に抑え、帯状の層の間のスムーズな移行をもたらした。正確bioprintingパラメータ及びbioinkの成分を調整することによって、我々は、軟骨病変の多種多様を癒すために必要な複雑な3D構造を作製することができるであろう。
蛍の光でrgistic増殖因子刺激、bioprinted新軟骨は最高の軟骨形成表現型とほとんどの細胞増殖3を持っていた。適切な成長因子で処理したがって、bioprintingための実行可能である、本研究において使用される細胞播種密度もまた、軟骨再生のために理想的である。自家軟骨細胞を使用した軟骨の修復を大幅生検で採取した軟骨細胞の限られた数のために臨床応用に制限されています。単層の拡大なしで軟骨修復のための生体材料と一緒に直接採取した自己軟骨細胞や間葉系幹細胞（MSC）を注入することは非常に魅力的です。したがって、限られた細胞数所与軟骨マトリックスの品質を損なうことなく、軟骨形成に必要な最適な細胞密度に印刷細胞数を拡大することが重要である。さらに、初期の細胞密度を制限すること大幅bioprinting分解能を最適化し、最大化する。このように、bioprinここで説明ティン方法は臨床環境における低細胞数と完全に互換性があり、軟骨組織工学のために使用される可能性を有している。
結論として、私たちの仕事は正確なターゲット位置に軟骨細胞および生体材料足場材料を提供することにより、解剖学的軟骨構造体を製造することの実現可能性を実証している。ヒト軟骨細胞とPEGヒドロゲルは、継続的に層ごとのアセンブリを経由してbioprintedた。同時光重合は初期堆積位置に印刷細胞を維持し、光毒性を減少させた。印刷された新軟骨の細胞は、一貫性のある遺伝子発現および生化学的解析2と軟骨形成表現型を維持した。したがって、この技術は、解剖学的な軟骨組織工学のための有望な進歩である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、この研究には経済的利害関係を持っていません。
Acknowledgments
著者はニューヨーク·首都圏·リサーチ·アライアンス助成の支援を承認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
References
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
- Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
- Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
- Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
- Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
- Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
- Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).
