Summary
De metoder som beskrivs i detta dokument visar hur man konverterar en kommersiell bläckstråleskrivare i en bioprinter med samtidig UV-polymerisation. Skrivaren klarar av att bygga 3D-vävnadsstruktur med celler och biomaterial. Studien visade här konstruerat en 3D neocartilage.
Abstract
Bioprinting, som bygger på termisk bläckstråleutskrift, är en av de mest attraktiva möjliggörande teknik inom området tissue engineering och regenerativ medicin. Med digital kontrollceller, byggnadsställningar och tillväxtfaktorer kan exakt deponeras till önskad tvådimensionell (2D) och tredimensionella (3D) platser snabbt. Därför är denna teknik en idealisk metod för att tillverka vävnad härma deras infödda anatomiska strukturer. För att konstruera brosk med infödda zoner organisation, extracellulärmatrix sammansättning (ECM), och mekaniska egenskaper, utvecklade vi en bioprinting plattform med hjälp av en kommersiell bläckstråleskrivare med samtidig photopolymerization kapabel för 3D broskvävnadsteknik. Mänskliga kondrocyter suspenderade i poly (etylenglykol) akrylat (PEGDA) trycktes för 3D neocartilage konstruktion via lager-för-lager församling. De tryckta cellerna fixerades vid sina ursprungliga insatta lägen, med stöd av surroINANSIERING byggnadsställning på samtidig fotopolymerisationen. De mekaniska egenskaperna hos den tryckta vävnaden var liknande den nativa brosk. Jämfört med konventionell vävnadstillverkning, som kräver längre UV-exponering, livskraft de tryckta celler med samtidig photopolymerization var betydligt högre. Tryckt neocartilage visade utmärkt glykosaminoglykan (GAG) och kollagen typ II-produktion, vilket var i linje med genuttryck. Därför är denna plattform idealisk för exakt fördelning cell och arrangemang för anatomisk vävnadsteknik.
Introduction
Bioprinting baserad på termisk bläckstråleutskrift är en av de mest lovande möjliggörande teknik inom området tissue engineering och regenerativ medicin. Med digital kontroll och hög genomströmning skrivhuvuden celler, ställningar, och tillväxtfaktorer kan exakt deponeras till önskad tvådimensionell (2D) och tredimensionella (3D) positioner snabbt. Många framgångsrika ansökningar har uppnåtts med hjälp av denna teknik i vävnadsteknik och regenerativ medicin 1-9. I detta papper, var en bioprinting plattform upprättas med en modifierad Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 termisk bläckstråleskrivare och en samtidig fotopolymerisa system. Syntetiska hydrogeler formulerade från poly (etylenglykol) (PEG) har visat sig ha förmågan att upprätthålla kondrocyt livskraft och främja kondrogen ECM produktion 10,11. Dessutom är fototvärbindbar PEG mycket lösliga i vatten med låg viskositet, vilket gör den idealisk för samtidig polymerization under 3D bioprinting. I detta papper, mänskliga chondrocyter suspenderade i poly (etylen) glykoldiakrylat (PEGDA, MW 3400) var exakt tryckt att konstruera neocartilage lager-för-lager med 1.400 dpi i 3D-upplösning. Homogen fördelning av deponerade celler i en 3D klätterställning observerades, vilket genererade broskvävnad med utmärkta mekaniska egenskaper och förbättrad produktions ECM. Däremot i manuell tillverkning cellerna ackumulerad vid botten av gelén istället för deras initialt deponerade positionerna på grund av långsammare scaffold polymerisation, vilket ledde till inhomogen broskbildning efter odling 2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bioprinting Platform Etablering
Skrivaren ändring grundas på en HP Deskjet 500 termisk bläckstråleskrivare och HP 51626A svart bläckpatron.
- Ta bort den övre plastkåpan på skrivaren och försiktigt loss panelen från locket.
- Lossa kabelanslutningarna 3 mellan den övre delen och botten skrivare. Ta bort den övre delen skrivaren från basen.
- På skrivarens övre delen, ta bort den lilla plast-och gummi tillbehör (skrivhuvudet rengöringssystem) på höger sida i bläckpatronen.
- Ta bort basen av pappersfacket med fjädrar.
- Ta bort metallplattan som täcker plastpappersmatningsfältet.
- Klipp av plastpappersmatning bar vid mittmatningshjulet position med hjälp av en handsåg eller annat skärande verktyg.
- Ta bort de två pappersmatningshjulen utsatta efter föregående steg. Hjulet plast är mycket hårt och en elektronisksågen kommer att vara hjälpsam.
- Rengör damm och skräp med hjälp av konserverad luft och etanol våtservetter.
- Fäst toppdel skrivaren till basen.
- UV sterilisera den ändrade skrivaren i minst 2 timmar i ett laminärt flöde huva före användning.
- Skär av locket på en bläckpatron HP 51626A använder en handsåg eller annat skärande verktyg.
- Töm bläcket och ta bort filtret som täcker botten väl reservoar av brosket.
- Skölj kassetten noggrant med rinnande vatten.
- Ultrasonicate patronen i avjoniserat (DI) vatten under 10 min för att avlägsna kvarvarande bläck.
- Undersök patronen för att se allt bläck har tagits bort. Skölj eller spray kassetten noggrant med 70% etanol för sterilisering, följt av steriliserat avjoniserat vatten.
- Inrätta en långvågigt ultraviolett lampa över utskrifts plattform för att ge samtidig fotopolymerisationen kapacitet.
- Mät UV-intensitet vid utskrift plattform med hjälp av en UV-ljusmätaren. Justera avståndet mellan UV-lampan och skrivaren plattformen så intensiteten vid utskrift motivet är mellan 4-8 mW / cm 2 (ca 25 cm från lampan till skrivaren plattform).
2. Bioink Framställning
- Monolayer kondrocyt expansions
- Plate 5000000 humana kondrocyter in i varje T175 vävnadsodlingskolv för cell expansion i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) kompletterat med 10% kalvserum och 1 x penicillin-streptomycin-glutamin (PSG). Kultur-celler vid 37 ° C med fuktad luft innehållande 5% CO2. Ändra odlingsmedium var 3 dagar tills kolven är 85% konfluens. Använda celler från samma passage.
- Lös PEGDA i PBS till en slutlig koncentration av 10% vikt / volym Lägg fotoinitiator I-2959 till en slutkoncentration av 0,05% vikt / volym Filtrera sterilisera lösningen.
- Häng odlade humana broskceller i beredd PEGDA lösningen på 5 x 10 6 celler /ml.
3. Brosk Tissue utskrift
- Slå på skrivaren och laptop.
- Skapa en utskrift mönster av en fylld cirkel med 4 mm i diameter med Microsoft Word eller Adobe Photoshop.
- Justera placeringen av mönstret och se till att det kommer att skrivas ut exakt i plastform.
- Beräkna antalet tryck som behövs för att nå den önskade tjockleken hos ställningen. För 4 mm höga, är 220 utskrifter som krävs för att skapa önskad schavotten.
- Fyll på bioink in i bläckpatronen. Täck patronen med aluminiumfolie för att skydda från direkt UV exponering under utskrift.
- Sänd kommando utskrift till skrivaren. Dra ut papperssensorn när skrivaren börjar skriva ut. Hela tryckprocessen bör ta mindre än 4 min i en byggnadsställning med 4 mm i diameter och 4 mm i höjd.
- Transfer tryckt neocartilage till en 24-brunnsplatta och tillsätt 1,5 ml odlingsmedium till varje brunn.
- Inkubera den tryckta neocartilage i LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity arbetslösning vid rumstemperatur under 15 min i mörker.
- Skär cell-laden hydrogel på mitten och ta fluorescerande bilder av skärområdet.
- Räkna levande (grönt) och döda (röd) celler av en blindad observatör på fem slumpmässigt tagna bilder. Beräkna cellviabiliteten genom att dividera antalet av levande celler med totala antalet levande och döda celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den modifierade termiska bläckstråleskrivare var kapabel för cell-och byggnadsställning deponering vid hög genomströmning och utmärkt cellernas livskraft. Kombinera med samtidig fotopolymerisation och ljuskänsliga biomaterial, är denna teknik kunna fixera cellerna och andra tryckta ämnen till de ursprungligen avsatta platser. Enligt egenskaperna hos den modifierade termiska bläckstråleskrivare, 2D utskriftsupplösning var 300 dpi med en enda bläckdroppvolym på 130 pl. Det finns 50 bränning munstycken i varje skrivhuvud med 3,6 kHz avfyrningsfrekvens 12,13. Därför för en representativ konstruktion av 4 mm diameter och 4 mm höjd, volym och tjockleken på varje utskriven lager under lager-för-lager konstruktion var 0,23 l och 18 nm, respektive. Hela tryckprocessen tog mindre än 4 min för att konstruera brosk-vävnad (Figur 1).
Figur 2A visar en jämn cellfördelning printed chondrocyter i 3D byggnadsställning på grund av samtidig fotopolymerisation av den omgivande byggnadsställning under cell nedfall. Däremot utan samtidig fotopolymerisation (scaffold polymeriserad efter cellsådd), de avsatta cellerna sjönk till botten eller zonal gränssnitt i stället för deras initialt deponerade platser på grund av tyngdkraften (Figur 2B). Denna cell ackumulering observerades också i tidigare rapporter om manuell tillverkning av broskvävnad 14,15. De tryckta humana broskceller i 3D PEG hydrogel återvunna kondrogen fenotyp och visade successivt ökat proteoglykanproduktion under kultur (Figur 3) 3.
Figur 1. Tryckt neocartilage vävnad. A) Schematisk bild av brosk bioprinting med samtidig fotopolymerisation och läggaER-för-lager montering. B) En tryckt neocartilage vävnaden med 4 mm i diameter och 4 mm i höjd. Scale Bar = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kondrocyter märkta med grönt och orange fluorescerande färger visade det zonal brosk bioprinting genomförbarhet. A) Tryckta celler upprätthålls deras initialt deponerade positioner i 3D-hydrogel. Tryckningen och fotopolymeriseringen process avslutas i 4 min med cell livskraft 90% (n = 3). B) Celler ackumulerats på botten eller gränssnitt på grund av tyngdkraften utan samtidig fotopolymerisationen. Det tog 10 min för UV-exponering för att gela konstruktet med samma storlek på A med en cell livsduglighet63% (n = 3). Skalstrecken = 100 um.
Figur 3. Safranin-O färgning av tryckta kondrocyter i PEG hydrogel visar ökad proteoglykanproduktion under kultur. Skala barer = 100 ìm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna 3D bioprinting system med samtidig photopolymerization förmåga ger en betydligt högre utskriftsupplösning än de bästa tidigare rapporterats metod i tryckning av osteokondrala defekter med hjälp av spruta extruderas en cellulär alginat hydrogel 16 situ. Högre utskriftsupplösning är särskilt kritisk för broskvävnadsteknik för att återställa den anatomiska brosk zonal organisation. Samtidig fotopolymerisation under lager-på-lager-montering är avgörande för att upprätthålla exakt deposition av celler och biomaterial ställningar för 3D-konstruktion. Mikro med varje tryckt skikt resulterade också i mjuka övergångar mellan zonal skikt, vilket minimerar risken för nedbrytning på grund av delaminering. Genom att finjustera bioprinting parametrar och komponenter i bioink, kommer vi att kunna tillverka de komplicerade 3D-strukturer som krävs för att bota en mängd olika broskskador.
Med synergistic tillväxtfaktorstimulering, den bioprinted neocartilage hade bästa kondrogen fenotyp och mest cellproliferering 3. Därför cellsåddtäthet som används i denna studie, som är möjligt för bioprinting, är också idealisk för broskregenerering vid behandling med lämpliga tillväxtfaktorer. Broskreparation med användning av autologa kondrocyter är starkt begränsad i kliniska applikationer på grund av det begränsade antalet kondrocyter skördade i biopsi. Implantation de direkt skördade autologa kondrocyter eller mesenkymala stamceller (MSC) tillsammans med biomaterial för broskreparation utan monolager expansionen är ytterst attraktiv. Därför är det avgörande för att expandera de tryckta cellantal till optimal celldensitet krävs för broskbildning utan att kompromissa med kvaliteten på broskmatrisen hänsyn till de begränsade cellantal. Vidare begränsar initiala celldensiteten kommer att kraftigt optimera och bioprinting upplösning. Således bioprinting metod som beskrivs här är fullt kompatibel med de låga cellantal i klinisk miljö och har potential att användas för broskvävnadsteknik.
Sammanfattningsvis visar vårt arbete möjligheten att tillverka anatomiska broskstrukturer genom att leverera kondrocyter och biomaterial ställningsmaterial till exakta riktade positioner. En PEG hydrogel med humana broskceller kontinuerligt bioprinted via lager-för-lager församling. Samtidig fotopolymerisationen underhålls de tryckta celler vid sina ursprungliga deponerade positioner och minskad fototoxicitet. Celler i den tryckta neocartilage underhålls kondrogen fenotyp med konsekvent genuttryck och biokemisk analys 2. Därför är denna teknik ett lovande framsteg för anatomisk broskvävnadsteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga ekonomiska intressen i denna studie.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för stödet från New York huvudstadsregionen Research Alliance Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
References
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
- Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
- Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
- Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
- Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
- Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
- Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).
