Introduction
Le poisson zèbre (Danio rerio) est une petite espèce de poissons téléostéens originaires de l'Inde qui est un organisme modèle utile pour comportementale 1 et 2,3 médicale recherche. Le poisson zèbre sont aussi couramment utilisé dans l'essai de diverses substances pharmacologiques afin de caractériser leur impact sur le comportement. Diverses doses et schémas d'administration de médicaments ont été utilisés pour étudier le comportement du poisson zèbre après l'administration de composés tels que des stimulants, des anxiolytiques 4 et 5 de l'éthanol 8/6.
Notre laboratoire a étudié les effets de différents schémas d'administration de l'éthanol sur l'anxiété poisson zèbre et de la locomotion à la lumière / obscurité essai bien validé 9, 20, aussi communément appelé le test scototaxic. Un nouveau procédé d'administration de l'éthanol a été développé pour améliorer l'efficacité de répétition, l'administration quotidienne pendant une longue période de temps (21 jours) 6 10-12. Bien que cette méthode est largement acceptée, filets de poisson zèbre peut augmenter la variabilité dans le temps nécessaire pour introduire et retirer le poisson de la solution médicamenteuse. Par conséquent, l'exposition exacte du composé d'intérêt peut varier au cours d'une expérience impliquant des doses répétées. Une méthode qui permet de réduire les sources d'erreurs résultant de la variabilité des temps de transport est donc souhaitable. Avec notre méthode, nous sommes en mesure de déplacer tous les poissons en même temps, résultant en temps de dosage identique dans chaque poisson. Après l'exposition de l'éthanol (décrit ici), le poisson-zèbre peut être testé en number de tests comportementaux, y compris ceux qui évaluent l'anxiété. Dosage des groupes de poissons à l'aide de la nouvelle méthode a des applications pratiques au-delà de la capacité de se répliquer et de normaliser le dosage entre les sujets et entre les groupes de poissons avec précision. L'avènement d'un nouveau logiciel qui permet de faire le suivi de plusieurs poissons à la fois peut voir les chercheurs utilisent nos méthodes pour assurer la reproductibilité et la précision dans leurs expériences. Compte tenu de l'utilisation généralisée de poisson zèbre comme organisme modèle pour neurosciences comportementales, cette méthode permettra d'accroître l'efficacité et de praticité dans les futures études pharmacologiques.
Dans le paradigme actuel, un calendrier de dosage répété était employé qui reflète approximativement horaires de consommation humaine. Les poissons ont été assignés au hasard à l'un des trois groupes: contrôle, quotidien modéré, ou hebdomadaire frénésie. Le programme de dosage était de 21 jours dans la durée, choisi parce qu'il a dépassé de manière significative les temps d'exposition dans les études précédentes 7. poissons de commande reçu alco zérohol, poisson quotidien modéré reçu 0,2% d'alcool une fois par jour, et le poisson hebdomadaire binge reçu 1,4% d'alcool une fois par semaine. La tâche clair / foncé a été utilisé pour évaluer l'anxiété après 2 jours de retrait. Ceci est un test relativement simple à administrer qui utilise une arène rectangulaire dans laquelle les parois d'un côté, sont de couleur blanche et de l'autre côté sont sombres 9. Poisson zèbre adulte préfèrent robuste le côté sombre de la scène dans des conditions de contrôle 6,9,13. Augmentation de l'anxiété est opérationnel correspond à beaucoup plus de temps passé dans la zone sombre et une diminution de l'anxiété peut supposer lorsque le poisson passe relativement plus de temps passé dans la zone de lumière. Avec le logiciel de suivi de mouvement, d'autres variables d'information peuvent également être quantifiés, y compris la vitesse moyenne, l'immobilité, sinueux, et les transitions zone 14.
La méthode de dosage développé dans notre laboratoire peut appliquer à toute recherche dans lequel les composés solubles dans l'eau sont administrés une ou plusieurs zebrafish. Beaucoup d'autres agents pharmacologiques qui peuvent bénéficier de cette méthode sont actuellement testés chez le poisson zèbre. Généralement les composés testés sont la nicotine, le chlordiazépoxyde, la buspirone, et la scopolamine, que l'on dissout d'une manière similaire à l'éthanol; en mélangeant la quantité appropriée de la substance chimique dans l'eau. Par conséquent, la portée générale de cette procédure est beaucoup plus large et non limitée à l'éthanol. En outre, après l'administration de médicaments pour plusieurs jours, la tâche de lumière / obscurité est seulement un des nombreux tests comportementaux qui pourraient être employées. Après l'administration du médicament ou durant le retrait, d'autres tests populaires qui peuvent être utilisés comprennent le test de plongée roman de réservoir 15 et des tests de comportement social tels que shoaling 16. La procédure suivante présente une méthode efficace de transfert à plusieurs reprises des groupes de poissons ou individuelle dans des solutions contenant un composé pharmacologique d'intérêt. En outre, le processus de test anxiété avec le test lumière / obscuritédans les groupes de poissons qui sont en retrait après avoir été exposés à de longues listes d'administration d'alcool sera décrit.
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Protocol
Toutes les procédures et les tests comportementaux ont été approuvés par le Conseil d'éthique de la recherche animale de l'Université MacEwan sous le numéro de protocole 11/06/12, qui est en conformité avec le Conseil canadien pour les directives de protection des animaux pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Préparer Réservoirs de dosage, des solutions et le schéma d'administration
- Préparer un calendrier d'administration tels que les animaux sont traités dans le même environnement et dans le même temps de la journée pour éviter les facteurs de confusion de temps ou de sollicitation à des stimuli visuels.
- Obtenir le plus grand nombre, 1,5 L, réservoirs en polypropylène de frai claires identiques nécessaires pour le nombre de tailles de groupe. Utilisez les groupes de 8 poissons par bassin, ce qui permet pour 2 groupes de poissons à tester par jour plus tard dans la procédure (voir l'étape 3). Utiliser une cuve de retenue et une cuve de dosage par groupe (2x nombre total de groupes).
- Placez 400 um inserts de frai dans tous les bassins de rétention. Famal les réservoirs avec de l'eau ou de l'habitat eau par osmose inverse à la bonne température (pour le poisson-zèbre, 25-28 ° C) qui est compatible avec le poisson de température sont normalement logés à.
REMARQUE: Il peut y avoir des interactions chimiques indésirables entre certains médicaments et les composants chimiques de l'eau de l'habitat tamponnée. Dans cette situation, utiliser de l'eau par osmose inverse tamponné avec des sels d'aquarium minimales ou pas pour l'administration du médicament, ainsi que pour les groupes de contrôle. - Veiller à ce que les réservoirs sont dans un environnement neutre pour éviter de conditionnement du poisson à des stimuli visuels extérieurs pendant le dosage.
- Placez 400 um inserts de frai dans tous les bassins de rétention. Famal les réservoirs avec de l'eau ou de l'habitat eau par osmose inverse à la bonne température (pour le poisson-zèbre, 25-28 ° C) qui est compatible avec le poisson de température sont normalement logés à.
- Préparer la solution de médicament. Mélanger la quantité appropriée de ce médicament avec de l'eau de l'habitat dans les bassins de ponte. Préparation de la solution d'éthanol à 0,2% en combinant 3 ml d'éthanol à une forte teneur (95% d'éthanol non dénaturé) avec 1497 ml d'eau. Préparation de la solution d'éthanol à 1,4% en combinant 21 ml d'éthanol avec 1 479 ml d'eau.
2. La compensation poisson et EtProcédure d'administration Hanol
- Filet de pêche avec soin à partir de leurs réservoirs de l'habitat et le transfert dans le réservoir de retenue approprié contenant l'insert de frai. Idéalement, abritera le poisson dans l'insert de frai pour éliminer compensation tout à fait.
- Avec tous les poissons dans leurs réservoirs de stockage respectifs, soulevez doucement le frai insérer sur le réservoir de stockage et le placer dans le réservoir de solution appropriée des médicaments (figure 1A).
- Noter le temps de dosage requis. Utiliser 30 min dans la solution d'éthanol à la procédure décrite ici.
- Si possible, les assistants aident au transfert de tous les groupes expérimentaux à la solution de médicament à la fois à assurer un temps de dosage précis. Sinon, transférer un groupe à la fois et de garder trace de dosage fois (figure 1A) de groupes individuels.
- A la fin de la période de traitement nécessaire, retirer le poisson de la solution d'éthanol en soulevant soigneusement l'insert de fraide la solution de médicament et mettre doucement dans le réservoir de retenue.
- Doucement net les poissons dans les réservoirs de rétention et remettez-les dans leur habitat jusqu'à la prochaine fois de dosage régulier, ou placer le frai insérer dans le réservoir de retenue pour éliminer filet.
- Comme mentionné précédemment, si possible dans les paramètres de l'équipement de locaux d'élevage, les animaux de la maison même réservoir et insertion de reproduction qui est utilisé comme réservoir de stockage. Cela permettra d'éliminer complètement filets pendant la procédure d'administration.
3. tests comportementaux
- Obtenir une lumière / obscurité arène 9,5 cm de large par 55 cm de long et 9,5 cm de profondeur avec un plancher imperméable blanc (figure 1B). Fixez papier non réfléchissant blanc et noir étanche sur les parois intérieures de la scène à l'aide du velcro, avec la moitié de l'arène couverte en blanc et à moitié recouvert de noir. Remplir l'arène à une profondeur de 5 cm avec de l'eau de l'habitat à une température de 25-28 ° C. Maintain cette température tout au long de l'essai.
- Minimaliser stimuli visuels externes en construisant une enceinte à trois faces blanc pour l'arène pour être situé dans. Assurer la zone de test a diffuser un éclairage zénithal qui ne provoque pas de réflexions sur la surface de l'eau, mais est suffisamment lumineux pour le logiciel de suivi de mouvement, ou par la poste quantification -hoc manuel à partir d'images vidéo.
- Placer l'arène dans l'enceinte et définir les enregistrement et d'analyse de mouvement paramètres du logiciel de suivi du comportement. Réglez la durée de l'essai de 5-15 min, en fonction de la question de recherche.
NOTE: Ici, nous avons utilisé 5 min. - Transporter le groupe de poissons à tester à la zone de recherche dans le réservoir de l'habitat et de les placer à l'extérieur de l'enceinte de l'arène. Acclimater les poissons pendant 10 minutes.
- Un poisson doucement net du groupe et endroit approprié dans le centre de la lumière / obscurité arène, en étant sûr de libérer le poisson quand il est positionné parallèlement à l'axe de l'arène pour avoid sollicitant le poisson à la lumière ou de la zone sombre.
- Commencez comportement enregistrement immédiatement après que l'animal est relâché. Soyez attentif aux problèmes de logiciels avec le suivi du poisson ou pour le saut de poisson ou de gel. Tournez la scène à 180 ° après la moitié des sujets ont été testés pour éviter les facteurs de confusion en raison de biais résultant de quelle extrémité de l'arène est orientée vers l'extrémité ouverte de l'enceinte.
- Après la fin du procès, doucement net et retirer le poisson de l'arène pour un réservoir de retenue ou réservoir de l'habitat.
4. Analyse
- Examiner le temps passé à la lumière par rapport à des zones sombres. Pour chaque groupe et chaque poisson, obtenir le temps relatif passé dans les zones claires et sombres et d'analyser l'aide d'un t -test d'un échantillon (ou de Wilcoxon rank test pour les données non paramétrique; différence de (la moitié du temps d'essai totale) 150 sec) pour déterminer si les groupes préfèrent nettement une zone sur l'autre.
- Pour comparer les préférences, calculer un instaindice rence en soustrayant le temps passé dans la zone la lumière du temps passé dans la zone sombre et comparer les différences entre les groupes. tests t peut être utilisé pour comparer deux groupes. Comparez plusieurs groupes avec une analyse unidirectionnelle de variance en utilisant le test HSD post hoc de Tukey le cas échéant (ou Kruskal-Wallis test avec comparaison multiple de Dunn de test post hoc des données non paramétrique).
- Comparer la vitesse, le nombre de transitions de zone, sinueux, et l'immobilité entre les groupes. Utilisez une analyse de variance en utilisant le test HSD post hoc de Tukey le cas échéant (ou Kruskal-Wallis test avec comparaison multiple de Dunn de test post hoc des données non paramétrique).
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Representative Results
Pour assurer la précision et le contrôle dans le poisson zèbre avec les études pharmacologiques, il est important pour la durée du temps de l'administration d'éthanol uniforme et précise de la manière décrite ci-dessus. Notre procédé permet d'augmenter la facilité et le débit de la procédure de dosage. L'administration de l'éthanol soit toutes les semaines ou tous les jours binge-modérée horaire a donné lieu à des niveaux d'anxiété altérées, mesurées avec le / test sombre de la lumière, par rapport aux témoins. Lors d'un essai, deux jours après la dernière dose, le poisson zèbre dans le groupe témoin (qui n'a pas reçu de l'alcool, mais ont encore ému aux réservoirs de dosage) affiche le rythme attendu de comportement, les dépenses de poissons de contrôle beaucoup plus de temps sur le côté sombre de l'arène ( Figure 2A) similaire à poisson zèbre naïf dans d'autres études 6,9,13. Poisson dans le groupe de l'hyperphagie hebdomadaire n'a montré aucune préférence pour l'une ou l'autre des zones claires ou sombres de la tâche lorsque testé deux jours après la dernière administration d'éthanol (figure 2B (figure 2C); en contraste avec le groupe témoin. L'indice de préférence indiqué une différence significative entre les groupes témoins et quotidienne modérée (figure 2D). Il n'y avait pas de différences significatives dans la vitesse de nage, ou à l'immobilité entre les groupes (Tableau 1), et par conséquent, cet effet n'a pas été en raison d'un déficit moteur chez le poisson.
Figure 1:. Procédure de transfert et le / aréna Clair Foncé Ces photos illustrent la procédure de transfert (A) d'abord, le poisson est situé dans le réservoir de transfert (à gauche).. Réservoir dosage contenant de l'éthanol est représenté (à droite). (Colombie-Britannique) le déplacement du poisson dans le réservoir de transfert de la solution d'éthanol nécessite la recherrcher de lever l'insert de frai de la cuve de transfert et dans le réservoir de solution d'éthanol. (D) La lumière / obscurité arène comme illustré mesurée de 9,5 cm de large par 9,5 cm de profondeur et 55 cm de long. Revêtement de sol blanc est utilisé, avec des murs noirs sur la moitié de l'arène (à gauche) et les murs blancs de l'autre moitié, la création d'une zone sombre et la lumière.
Figure 2: Les résultats représentatifs et trackplots de procédure éthanol de dosage sur trois groupes de poisson zèbre après 2 jours de retrait. (A) Un trackplot représentant d'un seul chemin de contrôle des mouvements de poissons zèbres se 5 min lumière / obscurité procès. Ci-dessous est la même trackplot poisson zèbre représentée comme une carte de température, qui est une représentation colorée de mouvement du poisson zèbre au long du procès, sur la base du temps le poisson passée dans le lieu représenté par chaque pixel. (B) repré Atrackplot repré- d'un seul poisson zèbre du groupe hebdomadaire frénésie tout au long de la 5 min lumière / obscurité tâche. Ci-dessous est la carte de température à partir de la même poisson zèbre. (C) Un trackplot représentant d'un seul mouvement du poisson zèbre quotidienne modérée tout au long de la 5 min lumière / obscurité procès. Ci-dessous la carte de température à partir de la même poisson zèbre. (D) L'indice de préférence a été calculée pour tous les groupes de temps passé dans la zone de lumière de temps passé dans la zone sombre soustraction. Les nombres négatifs indiquent la préférence pour la zone sombre. Les nombres positifs indiquent préférence pour la zone de lumière. Les résultats indiquent une différence significative de préférence entre les groupes témoins et quotidienne modérée à deux jours de rétractation * p <0,05 (ANOVA à un facteur). Notez qu'il est également une préférence marquée pour sombre dans le groupe témoin, p <0,05 (un échantillon t -test, la différence de 0), et une préférence marquée pour la lumière dans le groupe quotidien modéré, p <0,05 (un échantillon <em> t -test, la différence de 0). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Vitesse | Immobilité | |
| (Cm / sec) | (S) | |
| 2 jours Wd | 2 jours Wd | |
| Témoin (n = 13) | 9,1 ± 0,6 | 1,9 ± 0,6 |
| Binge (n = 14) | 9,8 ± 0,5 | 0,8 ± 0,2 |
| Chronique (n = 15) | 10,3 ± 0,5 | 2,5 ± 1,0 |
Tableau 1: vitesse moyenne et l'immobilité pendant le test lumière / obscurité. La vitesse moyenne de natation (cm / sec) et l'immobilité (s) d'un groupe représentatif de poisson zèbre après 2 jours de retrait (moyenne ± SEM). Ici, pas de différences significatives dans les deux vitesse ou immobilité n'a été trouvé. Utilisé avec la permission de Holcombe et al., (2013).
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Discussion
Des études antérieures portant sur l'administration de médicaments chez le poisson zèbre ont simplement compté sur la compensation du poisson pour les transporter à partir de leur réservoir d'origine dans la solution médicamenteuse 12,16. La compensation est pas toujours cohérente et prend souvent plus de temps que prévu en raison de la réaction de fuite du poisson zèbre, qui a la variabilité individuelle importante. Méthodes de transfert classiques, tout en étant utiles, peuvent être améliorées en réduisant la quantité totale de temps les poissons passent à l'extérieur de l'eau, ainsi que la diminution de la quantité de variation dans le temps de transfert entre les animaux. En plus d'améliorer pratique, cette méthode donne aux chercheurs la possibilité de doser les grands groupes de poissons en même temps dans une solution pour un nombre précis d'heures. Les méthodes précédentes nécessitent soit le dosage d'un seul poisson, ou de tenter de compenser des groupes entiers de poissons en même temps. Le premier est lent et diminue le débit, tandis que la seconde est une tâche délicate et difficile. En outre, les systèmes de suivi de mouvement que cune évaluer le comportement des poissons multiple à la fois peut bénéficier de la précision de cette méthode. Le poisson peut être transféré directement à partir de la ponte insert dans le domaine de la formation de bancs, ce qui assurerait près de l'exposition simultanée à l'arène pour tous les poissons.
L'utilisation de cette nouvelle méthode a produit des résultats significatifs lorsque mis en œuvre sur trois groupes de poisson zèbre sur une période de 21 jours. poisson témoin n'a reçu aucun alcool, poisson quotidien modéré a reçu une petite quantité d'alcool une fois par jour, et le poisson hebdomadaire binge reçu une forte dose d'alcool une fois par semaine pendant la période de 21 jours. Dans la tâche de lumière / obscurité, la procédure de dosage n'a pas modifié la préférence normal du poisson zèbre pour la zone sombre dans des conditions témoins. Cependant, après 2 jours de retrait de l'éthanol, le poisson zèbre dans le groupe quotidien modéré préféré la zone de lumière de la scène, un renversement de préférence. L'analyse statistique confirme un changement important dans la préférence de zone. Il est possible que le dosage procêtes entraîné dans de l'éthanol comportement de recherche en raison d'une préférence de place conditionnée (RPC), avec le poisson à la recherche de l'éthanol (un stimulus appétit), et préférant la zone blanche en raison de sa similitude par rapport à la zone de dosage lumineux. Des recherches récentes révèlent que le RPC peut se produire chez le poisson zèbre et dans les zones où le poisson zèbre sont dosés avec de l'éthanol 17,18. Binge-poisson hebdomadaire n'a montré aucune préférence 2 jours après l'éthanol, et si la preuve sur les mécanismes neuronaux qui représentent cette conclusion fait défaut, il est possible que des doses peu fréquentes mais de grandes d'alcool peuvent endommager le cerveau, laissant éventuellement poissons incapables de discriminer entre les zones.
Un autre avantage que cette procédure de dosage confère chercheurs est sa généralisation. Comme décrit, la procédure produit des résultats clairs et utiles chez le poisson zèbre. Cependant, la procédure ne se limite pas uniquement à poisson zèbre. Les contraintes concernant la procédure sont liées à la taille et les limites des réservoirs de dosage, les animaux et testiAppareil ng, ainsi que la capacité d'analyser les données. Avec l'utilisation de logiciels de suivi de mouvement, des études récentes ont étudié de nombreuses autres variables tout au long d'un procès. Blanc éviter l'accoutumance, carrés croisés, locomotion l'accoutumance, la latence de la zone blanche, nage erratique, thigmotaxis (temps passé près des murs de l'aréna), et l'évaluation des risques peuvent également être quantifiés 14. Il est envisageable d'utiliser cette procédure dans d'autres organismes modèles tels que le poisson rouge, qui ont été utilisés précédemment pour étudier le rôle de la tolérance et de retrait 19. Les chercheurs espèrent étudier les effets des autres agents pharmacologiques ou toxiques pour l'environnement, l'utilisation d'autres tests comportementaux, ou d'autres animaux marins ou d'eau douce, pourraient aussi utiliser cette méthode de base.
L'utilisation de ce protocole est simple et efficace. Cependant, si les résultats ne sont pas comme prévu, envisager le dépannage du système de suivi de mouvement pour assurer la collecte de données appropriée. Tracking doit être lisse et précis dans les différents essais. Le système de suivi doit être enregistre le mouvement du corps central du poisson à tout moment. Tout le saut ou le mouvement erratique de la dot suivi en raison d'artefacts visuels, tels que des reflets de lumière sur ondulations de l'eau, ou les paramètres de suivi incorrecte peut brouiller les résultats. Certains écarts dans les résultats peuvent provenir de petites différences dans la conception de l'arène ou les environnements de dosage. Pour être sûr de la réplication, la scène doit être tel que décrit, en particulier en ce qui concerne l'utilisation d'un plancher blanc afin de maximiser l'efficacité de suivi chez le poisson zèbre. Avec d'autres poissons qui sont plus légers en couleur, un sol sombre doit être utilisé pour faciliter le suivi de mouvement. De même, le dosage du poisson dans un environnement qui est exempt de stimuli visuels qui pourraient biaiser les poissons est extrêmement important. Toute couleur distincte, le motif ou la teinte qui est perceptible chez les poissons pourraient brouiller les résultats. Un neutre et de couleur claire fond similaire à celle dans le système de logement est recommandé. </ P>
Bien qu'il soit possible de modifier cette méthode comme nécessaire pour d'autres espèces de poissons, les résultats peuvent varier en fonction de la lumière innée / préférence foncé 20-21. Il est également important de noter même la procédure décrite ici provoque toujours un certain stress. Bien que la compensation est réduite de manière significative, la procédure implique toujours une très courte période de temps où les poissons doivent être hors de l'eau, éventuellement induire une réponse de stress. Ramsay et ses collègues 22 ont trouvé que le poisson-zèbre filet avait au moins le double des niveaux de cortisol dans leur corps par rapport à ceux qui ne sont pas compensées. Depuis cortisol est une hormone liée au stress 11 Cela peut modifier la réponse comportementale qui est mesurée. Bien que notre méthode permet de réduire la compensation, il ne l'élimine pas. Cependant, il donne aux chercheurs la possibilité d'éliminer l'incidence de la compensation si elles le désirent par logement poisson zèbre dans les inserts de frai. Les études futures devraient déterminer si l'utilisation de la Inser de frait pour le transfert de poisson peut réduire la réponse au stress relatif à la compensation. En outre, il est extrêmement important de maintenir des temps de dosage précis et de transférer les temps entre les groupes. Les changements de temps ou de grandes différences de dosage dans le temps passé hors de l'eau pourrait modifier les résultats. Pour réduire les effets circadiens possibles, il est également essentiel de doser le poisson pendant les périodes similaires de la journée. Dans le poisson de l'expérience actuelle a été dosé et testé 10 heures-14 heures. Réplication précise et fiable de cette procédure repose sur le protocole de répéter avec précision.
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Disclosures
Les auteurs reconnaissent Joshua Gallup pour l'utilisation de sa photographie équipement utilisé pour la figure 1. Ce travail a été soutenu par un en sciences naturelles et en génie Conseil de recherches en subvention (CRSNG) du Canada Discovery (à TJH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three shelf benchtop housing system |  Aquatic Habitats |
N/A | |
| 1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle | Aquatic Habitats |
N/A | |
| Pure Grain Ethanol | Luxco, INC |
N/A | |
| Ethovision XT Motion tracking software | Noldus Information Technology |
||
| Pipette | Eppendorf Canada |
||
| Light/Dark Arena | Custom | Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long. |
References
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