Introduction
ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は 、行動1および医学研究2,3ための有用なモデル生物であるインド発の小さな硬骨魚種である。ゼブラフィッシュは、一般に行動への影響を特徴付けるために、様々な薬理学的物質の試験において使用されている。薬物投与の様々な投与量およびスケジュールは、覚せい剤4、抗不安5およびエタノール6-8のような化合物の投与後のゼブラフィッシュの挙動を調査するために使用されてきた。
私たちの研究室はまた、一般scototaxicアッセイと呼ばれる、よく検証ダーク/ライトアッセイ9、20にゼブラフィッシュ不安や歩行にエタノール投与の異なるスケジュールの影響を調査しました。エタノール投与の新しい方法は、6時間の長い期間（21日間）にわたって反復、毎日の投与のための効率を高めるために開発された10~12の適切な混合物を含む別に相殺され、転送される。この方法は広く受け入れられているが、ゼブラフィッシュを相殺すること導入し、薬物溶液から魚を除去するために要する時間のばらつきを増大させることができる。そのため、目的の化合物への正確な露出は反復投与を伴う実験の過程にわたって変化し得る。輸送時間の変動に起因する誤差の発生源を減少させる方法がが望ましい。私たちの方法では、我々はそれぞれの魚で同一の投与時間で、その結果、同時にすべての魚を移動することができます。 （ここで説明）エタノール曝露後、ゼブラフィッシュは、任意のnumbeにおいて試験することができる不安を評価するものも含めて行動アッセイ、のrを。新しいメソッドを使用して、魚のグループを投与すると、正確に被験者間や魚のグループ間での投与を複製し、標準化する能力を超え、実用用途があります。一度に複数の魚の追跡を可能にする新しいソフトウェアの出現は、研究者が実験に複製能と精度を確保するために、私たちの方法を利用することがあります。行動神経科学のためのモデル生物としてゼブラフィッシュの普及を考えると、この方法では、将来の薬理学的研究における効率性と実用性が向上します。
現在のパラダイムでは、反復投与スケジュールは、およそ人間の飲用スケジュールを反映していることを採用した。コントロール、毎日の中等度、または毎週-どんちゃん騒ぎ：魚を無作為に3つの群に割り当てた。投与スケジュールは、それが大幅に過去の研究7に露光時間を超えたため選ばれ、期間は21日であった。対照魚はゼロALCOを受けHOL、毎日の中等度の魚は1日1回、0.2％アルコールを受け、毎週-どんちゃん騒ぎの魚は、1週間に1回1.4％アルコールを受け取った。明/暗タスクが離脱の2日後に不安を評価した。これは、一方の側の壁が白色であり、他の側に9暗いする矩形アリーナを使用している管理するための比較的簡単な試験である。アダルトゼブラフィッシュは、ロバスト制御条件の下で6,9,13アリーナのダークサイドを好む。不安の増大は、運用上、暗いゾーンで過ごしたかなり多くの時間として定義され、魚が光ゾーンで過ごした、比較的多くの時間を費やしている時に不安を想定することができます減少する。モーショントラッキングソフトウェアを使用すると、他の有益な変数も平均速度、不動、蛇行を含め、定量することができる、そしてゾーンは14に移行します。
我々の研究室で開発された投与方法は、水溶性化合物は、1つ以上のzebrafiに投与される任意の研究に適用することができるSH。この方法論から利益を得ることができる他の多くの薬理学的薬剤は、現在、ゼブラフィッシュで検証されています。一般的に試験された化合物は、エタノールと同様の方法で溶解させ、ニコチン、クロルジアゼポキシド、ブスピロン、およびスコポラミンが挙げられる。水に化学物質の適切な量を混合することによって。したがって、この手順の一般的な範囲ははるかに広いとエタノールに限定されるものではない。さらに、複数の日のための薬物を投与した後、明/暗タスクを使用することができる多くの行動試験の1つにすぎません。薬物投与後、または引き抜きの間、利用できる他の一般的なアッセイは新しいタンクダイビングテスト15など16の浅水として社会的行動のテストが含まれています。次の手順を繰り返し、目的の薬理学的な化合物を含む溶液に魚や個々の魚のグループを転送する効率的な方法を概説します。さらに、明/暗テストとテスト不安のプロセスアルコール投与の長いスケジュールにさらされた後に撤退している魚のグループに説明する。
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Protocol
すべての手順および行動試験は、実験動物の管理と使用のための動物ケアのガイドラインについては、カナダ人評議会に準拠しているプロトコル番号06-11-12、下マキュワン大学の動物実験倫理委員会によって承認された。
1.投与タンク、ソリューション、および投与スケジュールを準備
- 動物は視覚刺激に時間やバイアスのいずれ交絡を避けるために、同じ環境で、一日の同じ時間の間に投与されるような投与スケジュールを準備します。
- グループサイズの数に対して必要な限り多くの同一、1.5 L、明確なポリプロピレン産卵タンクを入手します。魚の2つのグループを可能にし、タンクあたり8魚の使用グループは手順で後述日あたりテストされる（ ステップ3を参照）。 1保持タンクやグループごとに1つの投与タンク（グループの2倍合計数）を使用します。
- すべての保持タンクに400μmの産卵インサートを置きます。 F病気生息水でタンクまたは温度魚と一致している（ゼブラフィッシュのため、25〜28℃）、正しい温度で逆浸透水は、通常に収容されている。
注：一部の薬剤および緩衝生息水の化学成分間の望ましくない化学的相互作用が存在し得る。この状況では、逆浸透薬物投与のための最小または全く水槽塩で緩衝水、ならびに対照群のために使用する。 - タンクは、投薬時に外部視覚刺激にコンディショニングの魚を避けるために、中立的な環境であることを確認します。
- すべての保持タンクに400μmの産卵インサートを置きます。 F病気生息水でタンクまたは温度魚と一致している（ゼブラフィッシュのため、25〜28℃）、正しい温度で逆浸透水は、通常に収容されている。
- 薬液を準備します。産卵タンクで生息地の水と適切な量の薬剤を混ぜる。水1497ミリリットルでハイグレードのエタノール（95％非変性エタノール）の3ミリリットルを組み合わせることにより、0.2％エタノール溶液を調製します。水1479ミリリットルとエタノール21ミリリットルを組み合わせることにより、1.4％エタノール溶液を調製します。
2.ネッティング魚、そしてEthanol管理手順
- 慎重にネット生息タンクから魚や産卵挿入物を含む適切な保持タンクに移す。理想的には、産卵中の家の魚は完全にネッティングを排除するために挿入します。
- それぞれの保持タンク内のすべての魚と、優しく保持タンクの外に挿入し、適切な薬液タンク（ 図1A）にそれを置いて産卵を持ち上げる。
- 必要に応じて、投与時間を記録します。ここで説明する手順のためのエタノール溶液に30分を使用してください。
- 可能な場合、アシスタントは、正確な投薬時間を確保すると同時に薬液を全ての実験群の転送を支援している。代替的に、一度に1つのグループを転送し、個々のグループの投薬回数（ 図1A）を追跡する。
- 必要な投与期間の終わりに、慎重に産卵インサートを持ち上げることにより、エタノール溶液から魚を外す薬液のうち、背面保持タンクに優しく置く。
- 優しくネット保持タンク内の魚や次回のスケジュール、投与時まで戻って自分の生息地にそれらを配置するか、産卵を配置ネッティングを排除するために戻って保持タンクに挿入します。
- 動物の住宅設備機器、住宅貯蔵タンクとして使用されているものと同じタンクと産卵インサートにおける動物のパラメータの範囲内で以前に、可能な場合に述べたように。これは投与手順の間に完全にネッティングがなくなります。
3.行動試験
- 長い55センチメートルと白の防水床（ 図1B）との深い9.5センチメートル9.5センチ幅の明/暗アリーナを取得します。黒で覆われた白と半分に覆われたアリーナの半分で、マジックテープを使用して、アリーナの内壁に白と黒の防水無反射紙を貼る。 25-28℃の温度で、生息地の水で5cmの深さにアリーナを埋める。通販テスト全体でこの温度をAINの。
- アリーナ内に位置されるためには、白三面囲いを構築することにより、外部視覚刺激をMinimalize。テストエリアが水面上に反射を起こさない頭上の照明を拡散持って、まだ十分に運動追跡ソフトウェア、またはポストのために明るいあることを確認してくださいビデオ画像から-hoc手動定量。
- エンクロージャにアリーナを置き、行動追跡ソフトウェアの記録と運動解析パラメータを設定します。研究課題に応じて、5〜15分までの試用期間を設定します。
注：ここでは、5分を使用していました。 - 魚の群が生息タンク内の研究領域にテストされる輸送し、アリーナエンクロージャの外に配置します。 10分間の魚を順応さ。
- 明/暗アリーナの中央に該当するグループと場所から静かにネット魚は、AVOするアリーナの長軸に平行に配置されたとき、魚を解放することを確認され光や暗いゾーンに魚をバイアスするID。
- 動物が解放された直後に記録動作を開始します。魚を追跡または魚のジャンプや凍結のための任意のソフトウェアの問題を監視します。被験者の半数に起因アリーナの端が筐体の開口端に向かって配向されているから生じる偏見にどんな交絡を防ぐためにテストされた後に、アリーナを180°回転させます。
- 裁判の後、終了優しくネットと保持タンクや生息地のタンクにアリーナから魚を削除しています。
4.分析
- ダークゾーンに対する光の中で費やされた時間を調べます。グループごとに、それぞれの魚、光と闇のゾーンで過ごした相対的な時間を得て、1 標本t -test使用して分析する（またはウィルコクソンをノンパラメトリックデータのための順位検定を締結し、総試行時間の（半分）150秒との違い）グループは大幅に他の上の1つの領域を好むかどうかを判断する。
- 環境設定を比較するには、prefeを計算暗いゾーンで過ごした時間からの光帯に過ごし、群間の差を比較する時間を減算することによりrenceインデックス。 のt-試験は、2つのグループを比較するために使用され得る。 TukeyのHSDポストホックテスト、必要な場合（ノンパラメトリックデータ用またはクラスカル·ワリス検定Dunnの多重比較ポストホック付きテスト）を利用した一元配置分散分析で複数のグループを比較してください。
- 速度、ゾーン遷移の数、蛇行、およびグループ間で不動の比較。 TukeyのHSDポストホック検定を用いた一元配置分散分析を使用して、必要に応じて（Dunnの多重比較、ノンパラメトリックデータのための事後検定又はクラスカル·ワリス検定）。
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Representative Results
上記のようにゼブラフィッシュと薬理学的研究の精度および制御を維持するためには、一貫して正確にエタノール投与の持続時間が重要である。我々の手順では、投与手順の容易性とスループットを向上させることができる。毎週-過食や毎日の中等度のスケジュールのいずれかに対するエタノールの投与は、対照と比較して、明/暗テストで測定し、変化した不安レベルをもたらした。二日、最後の投薬後試験した場合、（全くアルコールを受けていないが、それでも、投薬タンクに移動された）対照群のゼブラフィッシュは、（アリーナの暗い側の制御の魚の支出が大幅に多くの時間と行動の予想されるパターンを、表示された他の研究6,9,13におけるナイーブゼブラフィッシュに似図2A）。 （ 図2B彼らの最後のエタノール投与後2日間を試験したとき、毎週のどんちゃん騒ぎグループ内の魚は、タスク内の光や暗いいずれかのゾーンには好みを示さなかった図2C）のライト側好ましい。対照群とは対照的である。優先度は、対照と毎日中程度のグループ（ 図2D）との間の有意差を示した。そこ遊泳速度、またはグループ間で不動（ 表1）に有意差はなかったので、この効果は、魚における運動障害によるものではなかった。
図1：転送手順及びライト/ダークアリーナこれらの写真は転送手順を説明する（A）まず、魚は、転送タンク（左）に位置しています。。エタノールを含有するタンクを投与するエタノール溶液に転送タンクから魚を移動する（右）。（BC）に描かreseaを必要とする産卵を持ち上げるrcher転送タンクから出て、エタノール溶液槽に挿入します。（D）明/暗アリーナを深くし、55センチ9.5センチメートル9.5センチ幅で測定示されているように。白色の床は、明暗のゾーンを作成する、他の半分のアリーナ（左）と白い壁の半分の黒い壁に沿って、使用されている。
図2：代表的な結果と2日間の撤退後のゼブラフィッシュの三つのグループに対するエタノール投与手順のtrackplots。 （A）5分間の明/暗トライアルを通じて単一の制御ゼブラフィッシュの移動経路の代表trackplot。下の魚は、各ピクセルによって表される場所で過ごした時間に基づいて、裁判を通じてゼブラフィッシュの動きの着色表現であるヒートマップとして表現同じゼブラフィッシュtrackplotである。（B）のA repres5分の明/暗タスクを通して毎週-どんちゃん騒ぎグループから単一のゼブラフィッシュのentative trackplot。以下に、同じゼブラフィッシュからヒートマップである。（C）を 5分間の明/暗裁判を通じて一日一回から中等度のゼブラフィッシュの動きの代表trackplot。以下同じゼブラフィッシュからヒートマップである。（D）選好指標は暗いゾーンで過ごした時間からの光帯に費やされた時間を減算することによって、全ての群について計算した。負の数はダークゾーンの好みを示す。正の数は、光ゾーンの好みを示す。結果は、対照2日間離脱*はp <0.05 の （一方向ANOVA）で毎日の中程度の群の間で優先的に有意な差を示している。対照群、p <0.05 の （1 標本t -test、0との差）、毎日の中程度のグループ内の光のための重要な好み、p <0.05 の （一つのサンプル中の暗いための重要な嗜好もあるメモ<EM> T -test、0からの差分）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 速度 | 不動 | |
| さ（cm /秒） | （秒） | |
| 2日間Wdは | 2日間Wdは | |
| 制御た（n = 13） | 9.1±0.6 | 1.9±0.6 |
| 過食た（n = 14） | 9.8±0.5 | 0.8±0.2 |
| 慢性た（n = 15） | 10.3±0.5 | 2.5±1.0 |
表1：光/暗試験時の平均速度と不動 。撤退の2日後のゼブラフィッシュの代表的なグループの平均泳ぐ速度（CM /秒）と不動（秒）（平均±SEM）。ここで、速度または不動のいずれかに有意差は認められなかった。ホルコムら 、（2013）からの許可を得て使用。
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Discussion
ゼブラフィッシュにおける薬剤投与を伴う以前の研究では、単純に薬物溶液12,16に自宅タンクからそれらを輸送するために魚をネッティングに頼ってきた。ネッティングは常に一貫していないとしばしばかなりの個体差があるゼブラフィッシュの逃避応答に予想よりも時間がかかります。伝統的な転送方法は、有用ではあるが、魚が水の外に費やす合計時間を減少させるだけでなく、動物の間の転送時間の変動量を減少させることによって大幅に改善することができる。実用性の向上に加えて、この方法は、研究者の時間の正確な量は溶液中で同時に魚の大用量群できるようになります。以前の方法は、どちらかが単一の魚を投与、または同時に魚のグループをネット全体を試みる必要があります。後者は厄介で困難な作業であるのに対し、前者は、低速であり、スループットを低下させる。さらに、運動追跡システム、そのC一度に複数の魚の挙動を評価することは、この方法の精度の恩恵を受けることができます。魚は産卵から直接転送することができたすべての魚のためのアリーナへの同時暴露の近くに保証するであろう浅水アリーナ、挿入。
21日間のゼブラフィッシュの三つのグループに実装された場合、この新しい方法を利用すると、有意な結果が得られた。対照魚は全くアルコールを受けていない、毎日の中等度の魚は一日一回少量のアルコールを受け、毎週-どんちゃん騒ぎの魚は21日間にわたって週一回あたりのアルコールの大量投与を受けた。明/暗タスクにおいて、投与手順は、コントロール条件下でのダークゾーンのゼブラフィッシュの通常の設定を変更しませんでした。しかし、エタノール離脱の2日後に、毎日の中等度の群ではゼブラフィッシュは、アリーナの光ゾーン、好みの逆転を好んだ。統計分析は、優先ゾーンにおける有意な変化を確認する。これは、投与が可能である。手順による明るい投与領域への相対的な類似性に起因する魚求めるエタノール（食欲刺激）、および白色ゾーンを好むとの条件付け場所嗜好性（CPP）に探索行動のエタノールが得られた再。最近の研究では、CPPはゼブラフィッシュでゼブラフィッシュをエタノール17,18を投与されている地域で発生する可能性があることを明らかにしている。毎週過食魚は2日エタノールポストプリファレンスを示さず、この知見を占める神経機構に関する証拠が欠如しているが、それはアルコールのまれが、大用量はおそらくゾーンを区別することができない魚を残して、脳に損傷を与える可能性がある。
この投与手順は、研究者に与えることをもう一つの利点は、その一般化である。上述したように、手順はゼブラフィッシュにおける明確かつ有用な結果を生成します。しかしながら、手順は、ゼブラフィッシュのみに限定されるものではない。手続き上の制約が大きさや投薬タンク、動物やTESTIの限界に関連しているngの装置と同様に、データを分析する能力。モーショントラッキングソフトウェアを使用して、最近の研究では、試験の多くの追加の変数を調べた。ホワイトホワイトゾーンに待ち時間回避慣れ、交差した正方形、歩行慣れ、不安定な水泳、接触走（アリーナの壁の近くに費やされた時間）、およびリスク評価にも14を定量することができる。これは、耐性および禁断症状19の役割を調査するために以前に使用されているような金魚などの他のモデル生物において、この手順を使用することが考えられる。他の薬理学的因子または環境毒素の効果を調べることを望んで研究者は、他の行動アッセイ、または他の海洋または淡水動物の使用は、この基本的な方法論を利用することができる。
このプロトコルを使用すると、単純かつ効果的である。しかし、結果は予想されないようにした場合、適切なデータの収集を確実にするために、動き追跡システムのトラブルシューティングを考える。 TRACKINgが臨床試験全体でスムーズかつ正確でなければなりません。追跡システムは、常に魚の体の中心の動きを記録すべきである。追跡のいずれかのジャンプや不規則な動きは、そのような水の波紋に光の反射、または結果を混乱させる可能性不適切なトラッキング設定などの視覚的アーチファクトに点在しています。結果の一部の不一致がアリーナの設計や投薬環境の小さな差から生じ得る。複製の確かに、アリーナはとしてゼブラフィッシュにおける追跡の効率を最大化するために白い床を使用することに特に関連して、記述されるべきである。カラーで軽量である他の魚と、暗いフロアはモーショントラッキングを支援するために使用されるべきである。同様に、魚をバイアスする可能性が可能性のある視覚刺激のない環境で魚を投与することは非常に重要です。魚への知覚である任意の異なる色、パターンや色相が結果を混乱させる可能性があります。住宅システムと同様の中立、明るい色の背景が推奨されます。</ pの>
それは魚の他の種のために必要に応じてこのメソッドを変更することが可能ですが、結果は、先天性の明/暗好み20-21の点で異なる場合があります。それは、ここで説明しても、手続きがまだいくつかの応力が発生に留意することも重要である。ネッティングを大幅に低減されるが、手順はまだ魚はおそらくストレス応答を誘導する、水の外でなければならない非常に短い時間を必要とする。ラムゼイと同僚22は網状ゼブラフィッシュが相殺されなかったものに比べて自分の体中のコルチゾールの少なくとも2倍のレベルを持っていたことがわかった。コルチゾルは、ストレス11に連結されたホルモンであるので、これは測定される行動反応を変化させることができる。提案手法はネッティングを低減しながら、それを排除するものではない。しかし、研究者は彼らが産卵インサートハウジングのゼブラフィッシュによって望むならネッティングの発生を排除する機会を与えてくれます。今後の研究では、産卵inserの使用かどうかを調査する必要があります魚の転送のためのtはネッティング相対ストレス応答を減少させることができる。加えて、グループ間の正確な投与時間と転送時間を維持することが極めて重要である。水の外に費やされた時間での投与回数または大きな差の変化は、結果を変えることができます。可能な概日効果を減少させるために、それはまた、一日の時間帯に類似した魚を用量することが重要である。現在の実験魚で午前10時と午後2時の間で投与し、試験した。この手順の正確で信頼性の高いレプリケーションが正確にプロトコルを繰り返すことに依存しています。
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Disclosures
著者らは、図1に使用される彼の写真撮影装置の使用のためにジョシュアギャラップを認める。この作品は、（TJHに）自然科学と工学研究評議会（NSERC）カナダディスカバリーグラントによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three shelf benchtop housing system |  Aquatic Habitats |
N/A | |
| 1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle | Aquatic Habitats |
N/A | |
| Pure Grain Ethanol | Luxco, INC |
N/A | |
| Ethovision XT Motion tracking software | Noldus Information Technology |
||
| Pipette | Eppendorf Canada |
||
| Light/Dark Arena | Custom | Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long. |
References
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