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Biology

Identifier les sites d'interaction protéine-protéine à l'aide de peptides tableaux

Published: November 18, 2014 doi: 10.3791/52097
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

Abstract

Les interactions protéine-protéine médient la plupart des processus dans la cellule et le contrôle de l'homéostasie de l'organisme vivant. Les interactions entre protéines peut provoquer une baisse de la maladie, ce qui rend les interactions entre protéines cibles médicamenteuses importantes. Il est donc très important de comprendre ces interactions au niveau moléculaire. Les interactions protéiques sont étudiés en utilisant une variété de techniques allant de dosages biochimiques et cellulaires à des analyses quantitatives biophysiques, et ceux-ci peuvent être réalisés soit avec des protéines de pleine longueur, avec des domaines de protéines ou de peptides. Les peptides sont d'excellents outils pour étudier les interactions entre protéines depuis peptides peuvent être synthétisés facilement et permettre la mise au point sur des sites d'interaction spécifiques. Tableaux peptidiques permettent l'identification des sites d'interaction entre les deux protéines, ainsi que le dépistage de peptides qui se lient à la protéine cible à des fins thérapeutiques. Ils permettent également des études SAR haut débit. Pour l'identification des sites de liaison, un Typical réseau de peptides contient habituellement se chevauchant partiellement 10-20 résidus des peptides dérivés des séquences complètes d'un ou plusieurs protéines partenaires de la protéine cible souhaitée. La sélection de la gamme pour la liaison de la protéine cible révèle les peptides de liaison, correspondant aux sites de liaison dans les protéines partenaires, dans une méthode facile et rapide à l'aide de seulement petite quantité de protéines.

Dans cet article, on décrit un protocole de criblage de matrices de peptides pour la cartographie des sites d'interaction entre une protéine cible et de ses partenaires. Le réseau peptidique est conçue sur la base des séquences des protéines partenaires compte tenu de leurs structures secondaires. Les tableaux utilisés dans ce protocole étaient Celluspots tableaux préparés par Intavis Instruments de bioanalyse. L'ensemble est bloqué pour éviter une liaison non spécifique et ensuite incubé avec la protéine étudiée. La détection en utilisant un anticorps révèle des peptides de liaison correspondant à des sites d'interactions spécifiques entre les protéines.

Introduction

Les interactions protéine-protéine médient la plupart des processus dans la cellule vivante. Les interactions entre protéines peut provoquer une baisse de la maladie, ce qui rend les interactions entre protéines cibles médicamenteuses importantes. Il est donc très important de comprendre ces interactions au niveau moléculaire. Les interactions protéiques sont étudiés en utilisant une variété de techniques allant de dosages biochimiques et cellulaires à des analyses quantitatives biophysiques, et ceux-ci peuvent être réalisés soit avec des protéines de pleine longueur, avec des domaines de protéines ou de peptides. Les peptides sont d'excellents outils pour étudier les interactions entre protéines. En effet, les peptides peuvent être facilement synthétisés et permettent la mise au point d'un site d'interaction spécifique d'une part, et sur ​​plusieurs cibles protéiques d'une manière à haut débit, d'autre part de 1,2. dépistage de réseau de peptides est un moyen rapide, facile à réaliser procédé pour obtenir une grande quantité de données sur les interactions d'une protéine cible avec de nombreux partenaires dans un court laps de temps 3. Contrairement à d'autres méthodes biochimiques ou biophysiques pour détecter et analyser les interactions protéine-protéine, le criblage de la matrice de peptide nécessite une très faible concentration de protéine et peut détecter de très faible liaison. matrices de peptides peuvent être utilisés pour de nombreuses applications dans les interactions peptide-protéine tels que la cartographie de la protéine-protéine ou des sites d'interaction ligand-récepteur 4, les interfaces d'homo- ou d'hétéro-oligomérisation, des anticorps caractérisant épitopes 5, étudier les activités enzymatiques 6 et un débit élevé structure- relation de l'activité (SAR) étudie 7. Pour un examen approfondi sur le dépistage du réseau de peptides voir Katz et al. 4

Plusieurs types de tableaux peptidiques existent actuellement. Il existe deux stratégies de synthèse pour la fabrication de grands ensembles de peptides: synthèse des peptides avant de les attacher au support solide, ou la synthèse de peptides directement sur ​​le support solide, en utilisant essentiellement la technique de 4,8 SPOT. Leles peptides sont synthétisés sur le support solide généralement par 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc) 8 chimie. Parmi les schémas de synthèse courantes sont l'attachement peptide par l'extrémité N-terminale (par exemple, les JPT PepStar tableaux 9) et la fixation de peptides grâce à l'extrémité C-terminale (par exemple, des tableaux de PEPSCAN pepchip 10, JPT pepspot tableaux 9 et Intavis tableaux de celluspot 11) 4. Le support solide peut varier et il en va de la chimie du couplage peptidique pour elle. Peptides Cys-terminés peuvent être fixés à des lames de verre par l'intermédiaire du groupe thiol 12. L'extrémité N-terminale d'un peptide peut être lié de manière covalente à un groupe hydroxyle sur la membrane de cellulose par estérification de l'acide aminé fixé huit.

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour cribler des matrices de peptides en tant que méthode pour l'étude des interactions protéine-protéine. Le tableau que nous avons utilisé est le tableau Celluspots, qui est un micro-array contenant grand amount de taches (doublons de 384 points) sur une petite membrane de cellulose pris en charge par une lame de verre. Cela permet de travailler avec de faibles volumes de protéines et d'anticorps et d'obtenir quantité importante de données par expérience unique. Ce tableau contient également la densité de peptide élevé qui permet la détection de faible affinité de liaison. La matrice a été utilisé pour cartographier l'interaction STIL-CHFR, ce qui est très important pour le contrôle de la prolifération cellulaire 13 normal. Interaction non contrôlée entre les deux protéines peut conduire au développement d'un cancer. En cartographiant cette interaction, nous avons trouvé le site de liaison spécifique et les résidus 14 de liaison. Cela ouvre la voie à la conception d'inhibiteurs rationnels qui inhibent cette interaction protéine-protéine.

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Protocol

1. Concevoir un tableau Peptide

  1. Diviser la séquence de la protéine cible en se chevauchant en partie les résidus 10 à 20 peptides. Varier la quantité de chevauchement sur l'expérience spécifique et les ressources du laboratoire performant, mais en principe, plus le chevauchement le mieux. Lors de la conception des peptides prennent en compte les éléments connus de la structure secondaire de la protéine qui peut être responsable de l'interaction.
  2. Commandez le réseau de peptides conçu par les fournisseurs commerciaux. Ici, l'utilisation des peptides liés de façon covalente à la matrice par l'intermédiaire du C-terminal.

Non-spécifique 2. bloquer la liaison

  1. Ajouter une solution de tampon Tris 50 mM et de phosphate contenant 0,05% de Tween 20 (TBST / PBST) et ajuster au pH désiré avec une quantité mesurée de HCl ou de NaOH (pour connaître la force ionique précis) et de la force ionique désirée avec NaCl . Ici, en utilisant un pH de 7,5 et une force ionique de 150 mM.
  2. Faire une solution de blocage de2,5% (p / v) de lait écrémé en poudre dans du TBST / PBST.
  3. Pour éviter la liaison non spécifique, immerger la matrice dans 5 ml d'une solution de blocage. Incuber la gamme de 2 à 4 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C sur un agitateur.

3. L'incubation avec la protéine

  1. Laver le premier réseau avec 5 ml de solution de blocage pendant 30 secondes et ensuite deux fois avec 5 ml de TBST / PBST pendant 5 min sur un agitateur à température ambiante.
  2. Incuber la gamme lavé avec 5 ml de His-solution de protéines contenant 2,5% (p / v) de lait écrémé en poudre pour éviter la liaison non spécifique. Ici, en utilisant 4,5 M de solution de protéine (STIL 500-650) dissous dans la solution de blocage décrite.
    NOTE: Habituellement 5-10 protéine uM sont utilisés pour le dépistage, mais la concentration de protéine peut être même aussi bas que 2-3 uM, en fonction de l'affinité de liaison et les concentrations locales des peptides qui se lient à la matrice (l'efficacité de la synthèse). Le tampon dans lequel la protéineest dissous peut varier mais est commun pour diluer la protéine en utilisant la même solution de blocage décrite ci-dessus.
  3. Incuber la matrice dans la solution de protéine de 3-8 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C.

4. Incubation avec l'Anticorps

  1. Laver le tableau trois fois avec 5 ml de TBST / PBST. Le premier lavage est de 30 secondes, suivi de deux lavages de 5 min sur un agitateur à température ambiante.
  2. Incuber la gamme lavé avec 5 ml d'anticorps conjugué à HRP dilué (1: 1500) dans un tampon d'incubation contenant les mêmes ingrédients à la même concentration que la solution de blocage, pendant 1 heure sur un agitateur à température ambiante. L'anticorps peut se lier soit à la protéine cible ou l'étiquette.
  3. Réaliser des expériences de contrôle de tester l'interaction de l'anticorps avec des peptides sur le réseau, surtout si le tableau contient des peptides de la protéine cible (par exemple, pour oligomérisation études) en répétant le même protocole sans step 3, l'incubation avec la protéine.
  4. Laver le tableau trois fois avec 5 ml de TBST / PBST. Le premier lavage est de 30 secondes, suivi de deux lavages de 5 min sur un agitateur à température ambiante.

5. La lecture du tableau

  1. Effectuer le développement de chimiluminescence avec un kit de substrat Western blot ECL.
  2. Effectuer la détection avec un analyseur d'image luminescent.
  3. Analyser les résultats. Assurez-vous que les deux exemplaires de la matrice montrent les mêmes signaux, de sorte que les résultats sont fiables. Si la structure de la partenaire de protéine est connue, la recherche sur la structure des peptides de liaison et de chercher les sites de liaison. Même les peptides qui sont bien dans la séquence peuvent être rapprochés dans la structure tertiaire et de créer un site de liaison.

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Representative Results

STIL est une protéine très importante centrosomale. Il contrôle la division cellulaire normale et la prolifération cellulaire 13,15 - 19. STIL interagit avec plusieurs protéines 18,20,21, et la plupart des interactions se produisent à travers sa partie centrale, qui est une région désordonnée intrinsèque (IDR) 14. Nous avons conçu un tableau composé de peptides dérivés de la protéine de liaison CHFR STIL. CHFR est un gène suppresseur de tumeur qui est induite en réponse à un stress 22 mitotique. Puisque la structure du domaine de liaison de STIL CHFR était inconnue à l'époque, nous avons divisé le domaine de la protéine de 15 résidus de long peptides avec un chevauchement de 7 résidus, comme décrit dans l'étape 1.1 dans le protocole. Nous avons effectué une série de peptide de dépistage pour identifier les sites de liaison CHFR-STIL, comme indiqué dans le protocole ci-dessus et illustré à la figure 1. Nous avons utilisé un tableau Intavis Celluspot composé de 384 peptides en double, qui peut fournir une énorme quantité d'informations comme le montre la figure 2. L'utilisation de ce réseau de peptides, nous avons trouvé les sites de liaison pour STIL dans sa protéine de liaison CHFR (figure 3). Chaque point noir dans le tableau représente un peptide dérivé CHFR qui liait STIL. A noter que chaque peptide apparaît deux fois, car il existe en double exemplaire, qui vérifie la fiabilité des résultats. L'interaction entre STIL et CHFR a déjà été démontré au niveau de la protéine 13,14. Le dépistage de la baie de peptide a révélé 7 peptides CHFR dérivés qui délimitent STIL IDR, les résidus 500-650 (Figure 3, Amartely et al. 14). Ces résultats nous ont permis de cartographier le site de liaison de STIL sur CHFR. Malgré la distance de ces 7 peptides sur la séquence primaire CHFR ils créent un site de liaison bien défini pour STIL dans CHFR (figure 4) 14.

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Figure 1: Un schéma de contrôle de réseau peptidique A- La conception d'un réseau de peptides qui se compose de peptides qui se chevauchent partiellement dérivées d'une ou plusieurs protéines partenaires, en tenant compte de leurs structures secondaires;. B- L'incubation avec la protéine cible; C- incubation avec un anticorps de détection; Détection D- (peut être effectué par chimiluminescence, fluorescence, etc.); E- L'analyse des résultats de révéler les sites de liaison des protéines. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Un exemple de réseau de peptides dépistage détection obtenue en utilisant la chimioluminescence La diapositive contient deux tableaux identiques que les doublons..es / ftp_upload / 52097 / 52097fig2large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Examen d'un réseau de peptides pour la liaison de STIL IDR à la protéine CHFR: 4,5 uM marquée par His STIL 500-650 a été projeté pour la liaison du tableau. Chaque point noir indique la liaison entre le fragment STIL et le peptide dérivé CHFR-14. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Le site de liaison STIL dans CHFR montré sur la structure du domaine riche en CHFR Cys (résidus 424 à 661, APB ID: 2XPO) Les sept.des peptides qui se lient à la STIL criblage de la matrice de peptide peuvent être divisés à trois régions de couleur rose, orange et rouge, qui sont éloignés dans la séquence primaire, mais proches dans la structure 3D création d'un site de liaison. Cette région pleine forme une poche de liaison pour STIL dans le CHFR dimère 14. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Dépistage du tableau peptide est un excellent outil pour identifier les sites de liaison d'une protéine cible dans ses partenaires. Ce test est rapide et facile à réaliser et les résultats peuvent être obtenus dans un ou deux jours ouvrables. Dépistage du tableau peptide est polyvalent et peut être utilisé à de nombreuses fins. Il peut être utilisé pour caractériser les modifications de traduction soumettre comme la phosphorylation et l'identification des substrats de kinases. Par exemple, la kinase FLT3, qui est lié à la leucémie myéloïde aiguë, phosphoryle Tyr-peptides contenant de substrat trouvés par un réseau peptidique criblage 6. Les propriétés inhibitrices de la inhibiteurs de tyrosine kinase et lapatinib pazopanib a été testé en utilisant le criblage de peptides tableau 23. Peptides matrice peut être utilisée pour identifier les sites qui assurent la médiation des interactions protéine-protéine. Des exemples de telles protéines étudiées dans notre laboratoire en utilisant cette méthode sont les suivants: l'interaction entre la protéine HIV-1 Vif et protéines A3G cellulaire nous a été caractériséement un réseau de peptides 24; dépistage de réseau de peptides a été utilisé pour étudier les interactions de l'anti-apoptotique famille Bcl-2 avec le pro-apoptotique des protéines ASPP2 25 et d'étudier la liaison de tBID, un membre de famille Bcl-2, avec la protéine mitochondriale MTCH2 26; l'interaction intra-moléculaire entre les domaines myosine SII a été analysée par réseau de peptides de dépistage 27. Nous présentons ici un exemple de la façon dont nous avons utilisé réseau de peptides de dépistage pour identifier les sites qui interviennent dans l'interaction STIL-CHFR, une interaction important dans la prolifération et le cancer 14 protéine-protéine. Révélant l'emplacement exact de liaison peut servir de base pour la conception rationnelle d'inhibiteurs de l'interaction étudiée.

Le dépistage de la baie de peptide est pas un dosage quantitatif. Elle est semi-quantitative, car la quantité de peptide dans chaque tache sur le réseau varie en fonction de la différence de rendement de la synthèse peptidique et la pureté. Ceci à son tour dépend de la Peptséquence d'IDE, longueur, etc. La variation du rendement et la pureté peut aussi conduire parfois à des résultats faussement négatifs ou faussement positifs. La comparaison entre les intensités au sein de la même matrice peut être fait, ce qui entraîne le classement semi-quantitative. Cependant, une telle comparaison entre les différents tableaux ou différentes expériences avec le même tableau ne sont pas fiables. Pour quantifier la liaison, les peptides présents dans le dépistage du réseau peptidique doivent être synthétisés et testés pour la liaison de la protéine cible en utilisant des méthodes biophysiques telles que l'anisotropie de fluorescence, calorimétrie de titration isotherme (ITC), résonance plasmonique de surface (SPR), etc. De tels dosages sont pas toujours sensible à faible liaison car ils nécessitent une forte concentration de la protéine à détecter une telle liaison. Le dépistage de réseau de peptides, d'autre part, est très sensible à la faiblesse de la liaison. Ainsi, certaines des interactions observées dans le dépistage du tableau n'a pas pu être observé ou quantifié en utilisant des méthodes telles que la fluorescence anisot filant 14. Le fait que la projection de la matrice de peptide nécessite de très faibles concentrations de la protéine associée à la grande sensibilité du dosage rendre le réseau peptidique d'une méthode utile pour le criblage d'interactions protéine-peptide dans un large éventail d'affinités.

Des résultats faussement négatifs peuvent également être dû au fait que les peptides linéaires peuvent pas représenter correctement la structure 3D du site de liaison à la protéine. Ceci est toutefois pas un problème avec les protéines intrinsèquement désordonnées, qui sont bien représentés par des peptides. Des résultats faussement positifs peuvent également être provoquées par la liaison de l'anticorps à la matrice. Ceux-ci peuvent être détectés par l'exécution d'une expérience de contrôle, comme décrit dans la section 4.3 de protocole. Des résultats faussement négatifs peuvent également être obtenus si l'épitope de la protéine qui est reconnue par l'anticorps lors de la liaison devient non exposée de la matrice de peptide. Ce problème est commun mais ne peut être résolu en utilisant un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine.

jove_content "> Le criblage de la matrice de peptide peut également être utilisé pour améliorer les peptides de plomb, y compris Alanine scan et SAR étudie 7. Une fois que le site de liaison de la cible est connue, un tableau sur la base de sa séquence peut être conçu avec plusieurs modifications, y compris le remplacement de chaque résidu d'alanine (scan Ala) à identifier les résidus importants pour l'interaction. D'une manière similaire, des études SAR peuvent être réalisées en changeant les propriétés différentes des peptides de liaison. Ceux-ci comprennent la variation de la longueur du peptide, le remplacement des résidus par le D correspondant les acides-aminés et autres modifications telles que la méthylation, la glycosylation et le remplacement par des acides aminés non naturels. De tels peptides modifiés, tous basés sur une séquence cible, peut être synthétisé sur une matrice et criblés pour la liaison de la protéine cible dans une expérience simple et rapide , offrant une mine d'informations pour l'amélioration d'un inhibiteur potentiel et la compréhension du mécanisme moléculaire de l'interaction.

électro-4. Le réseau de peptides décrit ici est à usage unique et ne peut être réutilisé.

Le protocole présenté ici démontre la grande utilité des réseaux peptidiques. Utilisation d'une matrice correctement conçu, entre les deux sites de liaison de protéines peuvent être identifiées en détail. Une fois que le site de liaison est bien caractérisée, il peut être utilisé comme site cible de médicament pour inhiber l'interaction protéine-protéine d'intérêt. Sur la base des peptides de liaison présents dans la projection de la matrice, les petites molécules inhibitrices peuvent être conçus et criblés en tant que fils de médicaments.

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Acknowledgments

AF a été financé par une subvention à partir du Conseil européen de la recherche sous septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7 / 2007-2013) / accord de subvention du CER n ° 203413 et par le Centre Minerva pour Bio-hybride systems.HA complexe et AI sont pris en charge par Dalia et Dan Maydan bourse pour les étudiants de diplôme d'études supérieures à l'Université hébraïque de Jérusalem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe Antibody (H-3) HRP Santa Cruz Biotechnology sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit Biological industries 20-500-120
Skim Milk Becton, Dickinson and Company 232100
LAS-3000 camera  FUJI film

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References

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Molecular Biology Numéro 93 les peptides les matrices de peptides les interactions protéine-protéine des sites de liaison la synthèse des peptides les micro-arrays
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