Abstract
Protein-protein interaksjoner medierer de fleste av prosessene i den levende cellen, og styre homeostase av organismen. Nedsatt protein interaksjoner kan føre til sykdom, noe som gjør protein interaksjoner viktige narkotika mål. Det er derfor svært viktig å forstå disse interaksjonene på molekylnivå. Protein interaksjoner blir studert ved anvendelse av en rekke teknikker som strekker seg fra cellulære og biokjemiske analyser i kvantitative analyser biofysiske, og disse kan utføres enten med full-lengde proteiner, med proteindomener eller med peptider. Peptider tjene som gode verktøy for å studere protein interaksjoner siden peptider kan lett syntetiseres og la fokus på spesifikke interaksjons nettsteder. Peptid arrays muliggjøre identifisering av interaksjonsseter mellom to proteiner, så vel som for screening peptider som binder mål-protein for terapeutiske formål. De lar også høy gjennomstrømning SAR studier. For identifisering av bindingsseter, et typical peptid matrise inneholder vanligvis delvis overlappende 10-20 rester peptider avledet fra de fullstendige sekvenser av en eller flere partnerproteiner av det ønskede målproteinet. Screening matrisen for binding målproteinet avslører bindende peptider, tilsvarende bindingsstedene i partnerlandene proteiner, på en enkel og rask metode med bare liten mengde protein.
I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for screening peptid arrays for å kartlegge samspillet sider mellom et mål protein og dets partnere. Peptid rekke er utformet basert på sekvenser av partnerproteiner som tar hensyn til deres sekundære strukturer. Arrays som brukes i denne protokollen var Celluspots arrays utarbeidet av INTAVIS Bioanalytical Instruments. Matrisen er blokkert for å hindre uspesifikk binding, og deretter inkubert med proteinet undersøkt. Påvisning ved hjelp av et antistoff-bindings avslører peptider som svarer til de spesifikke interaksjonsseter mellom proteinene.
Introduction
Protein-protein interaksjoner medierer de fleste av prosessene i den levende celle. Nedsatt protein interaksjoner kan føre til sykdom, noe som gjør protein interaksjoner viktige narkotika mål. Det er derfor svært viktig å forstå disse interaksjonene på molekylnivå. Protein interaksjoner blir studert ved anvendelse av en rekke teknikker som strekker seg fra cellulære og biokjemiske analyser i kvantitative analyser biofysiske, og disse kan utføres enten med full-lengde proteiner, med proteindomener eller med peptider. Peptider tjene som gode verktøy for å studere protein interaksjoner. Dette er fordi peptider lett kan syntetiseres, og tillate å fokusere på en spesifikk interaksjon område på den ene side og på flere protein målene i en høy gjennomstrømning måte på den annen side 1,2. Peptid matrise screening er en rask, enkel å utføre fremgangsmåten for oppnåelse av en stor mengde data om interaksjoner av et målprotein med tallrike partnere i en kort tid 3-. I motsetning til andre biokjemiske eller biofysiske fremgangsmåter for påvisning og analyse av protein-protein interaksjoner, peptid matrise screening krever en meget lav konsentrasjon av protein og kan detektere meget svak binding. Peptid matriser kan anvendes for mange anvendelser i peptid-protein interaksjoner som kartlegging av protein-protein eller reseptor-ligand-interaksjon sider 4, homo- eller hetero-oligomerisering grensesnitt, karakteriserende antistoffer epitoper 5, 6 studerte enzymaktivitet og høy gjennomstrømning struktur- aktivitetsforhold (SAR) studerer 7. For en grundig vurdering om peptid rekke screening se Katz et al. 4
Flere typer av peptid matriser for øyeblikket eksisterer. Det er to viktige syntetiske strategier for fremstilling av peptid-matriser: syntese av peptidene før feste dem til den faste bærer, eller syntese av peptider direkte på den faste bæreren, hovedsakelig ved hjelp av SPOT teknikken 4,8. DenPeptidene blir syntetisert på den faste bærer vanligvis med 9-fluorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc) 8 kjemi. Blant de vanligste syntetiske ordninger er peptid vedlegg via N-terminalen (f.eks JPT pepstar arrays 9) og peptid vedlegg gjennom C endestasjonen (f.eks PEPSCAN pepchip arrays 10, JPT pepspot arrays 9 og INTAVIS celluspot arrays 11) 4. Den faste bærer kan variere, og det gjør kjemien for peptidkobling til den. Cys-terminerte peptider kan festes til glassplater via tiolgruppen 12. Den N-terminale ende av et peptid kan være kovalent bundet til en hydroksylgruppe på cellulose- membran gjennom forestring av aminosyren 8 festet.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for screening av peptid-arrays som en fremgangsmåte for å studere protein-protein interaksjoner. Matrisen vi brukte er den Celluspots matrise, som er en mikro-matrise inneholdende store amount av flekker (duplikater av inntil 384 plasser) på et lite cellulose membran støttet av en glass-slide. Dette gjør det mulig å jobbe med lave mengder protein og antistoffer og få betydelig mengde data per enkelt eksperiment. Denne rekken inneholder også høy peptid tetthet som tillater påvisning av lav affinitet bindende. Matrisen ble brukt for å kartlegge STIL-CHFR samhandling, noe som er svært viktig for å kontrollere normal celledeling 13. Ukontrollert interaksjon mellom de to proteiner kan føre til utvikling av kreft. Ved å kartlegge dette samspillet har vi funnet den spesifikke bindingssetet og bindende rester 14. Dette baner vei for å utforme rasjonelle hemmere som hemmer dette proteinet-protein interaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utforme en Peptide Array
- Fordel sekvensen av målproteinet i delvis overlappende 10-20 rester peptider. Variere mengden av overlapping av den spesifikke eksperimentet, og ressursene i laboratoriet å utføre, men i prinsippet desto lenger jo bedre overlapping. Ved utformingen av peptider ta hensyn til kjente sekundære strukturelementer i proteinet som kan være ansvarlig for interaksjonen.
- Bestill designet peptid rekke gjennom kommersielle leverandører. Her bruker peptidene er kovalent bundet til matrisen via den C-terminale ende.
2. Blokkering uspesifikk binding
- Foreta en 50 mM Tris eller fosfat-bufferløsning inneholdende 0,05% Tween 20 (TBST / PBST) og juster til den ønskede pH med en målt mengde av HCl eller NaOH (for å vite den nøyaktige ionestyrke) og den ønskede ionestyrke med NaCl . Her bruker en pH-verdi på 7,5 og en ionestyrke på 150 mM.
- Lag en blokkering løsning av2,5% (vekt / volum) skummet melkepulver i TBST / PBST.
- For å forhindre ikke-spesifikk binding, dyppes matrise i 5 ml blokkeringsløsning. Inkuber array for 2-4 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C på en ristemaskin.
3. Inkubering med Protein
- Vask matrisen først med 5 ml blokkeringsløsning i 30 sekunder og deretter to ganger med 5 ml TBST / PBST i 5 minutter på en ristemaskin ved romtemperatur.
- Inkuber matrise vasket med 5 ml His-merkede proteinløsning inneholdende 2,5% (w / v) skummetmelkpulver for å forhindre ikke-spesifikk binding. Her bruker 4,5 uM av proteinløsning (STIL 500-650) oppløst i den beskrevne blokkeringsløsning.
MERK: Vanligvis 5-10 uM protein anvendes for screening, men proteinkonsentrasjonen kan være så lavt som 2-3 uM, avhengig av bindingsaffiniteten og de lokale konsentrasjonene av de peptider som er bundet på matrisen (effektiviteten av syntese). Bufferen i hvilken proteineter oppløst kan variere, men er vanlig å fortynne proteinet ved å bruke den samme blokkeringsløsningen beskrevet ovenfor. - Inkuber array i proteinoppløsningen for 3-8 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
4. Inkubering med antistoffet
- Vask matrisen tre ganger med 5 ml TBST / PBST. Den første vask er i 30 sek etterfulgt av to vaskinger på 5 min rister ved romtemperatur.
- Inkuber matrise vasket med 5 ml fortynnet HRP-konjugert antistoff (1: 1500) i en inkuberingsbuffer som inneholder de samme bestanddeler i de samme konsentrasjoner som den blokkerende løsning, i 1 time på et risteapparat ved romtemperatur. Antistoffet kan binde enten målproteinet eller merkelappen.
- Utføre kontrolleksperimenter testing av interaksjonen av antistoffet med peptider på matrisen, særlig hvis matrisen inneholder peptider fra målproteinet (f.eks, for oligomerisering undersøkelser) ved å gjenta den samme protokoll uten step 3, inkubering med protein.
- Vask matrisen tre ganger med 5 ml TBST / PBST. Den første vask er i 30 sek etterfulgt av to vaskinger på 5 min rister ved romtemperatur.
5. Lese Array
- Gjennomføre chemiluminescence utvikling med en ECL western blotting underlaget kit.
- Utfør deteksjon med en selvlysende bilde analysator.
- Analysere resultatene. Sørg for at begge duplikater på tabellen viser de samme signalene, slik at resultatene er pålitelige. Dersom strukturen av proteinpartneren er kjent, søk på strukturen for de bindende peptider og se etter de bindingssteder. Selv peptider som er langt i sekvensen kan være tett sammen i den tertiære struktur og skape en bindingssete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
STIL er en svært viktig centrosomal protein. Den styrer normal celledeling og cellevekst 13,15 - 19. STIL samhandler med flere proteiner 18,20,21, og de fleste av interaksjoner oppstår gjennom sin sentrale delen, som er en egen uordnede region (IDR) 14. Vi har utformet en rekke bestående av peptider som stammer fra STIL bindende protein CHFR. CHFR er et svulsthemmer som blir indusert i respons til mitotisk stresset 22. Siden strukturen av STIL bindende domene av CHFR var kjent på tidspunktet, delt vi protein domene til 15 rester lange peptider med overlapping av 7-rester, slik det er beskrevet i trinn 1.1 i protokollen. Vi utførte en peptid-matrise screening for å identifisere de CHFR STIL-bindingsseter, som beskrevet i den ovennevnte protokoll og illustrert i figur 1. Vi brukte en INTAVIS Celluspot matrise bestående av peptider i 384 dubletter, noe som kan gi en enorm mengde informasjon som vist i Figur 2. Ved hjelp av denne peptid matrise vi fant bindingsstedene for STIL i sin bindende protein CHFR (figur 3). Hvert svart flekk i matrisen representerer en CHFR avledet peptid som bandt STIL. Legg merke til at hvert peptid vises to ganger, siden det eksisterer i to eksemplarer, som verifiserer påliteligheten av resultatene. Samspillet mellom STIL og CHFR ble tidligere demonstrert på proteinnivået 13,14. Peptidet matrise screening avslørte 7 CHFR-avledede peptider som bandt STIL IDR, rester 500-650 (figur 3, Amartely et al. 14). Disse resultatene tillatt oss å kartlegge bindingssetet av STIL på CHFR. Til tross for avstanden til disse 7 peptider på CHFR primære sekvensen skaper de en veldefinert bindingssete for STIL i CHFR (figur 4) 14.
7 / 52097fig1highres.jpg "/>
Figur 1: En ordning med peptid rekke screening A- Å designe et peptid matrise som består av delvis overlappende peptider som stammer fra en eller flere partnerproteiner, tar hensyn til deres sekundære strukturer;. B- Inkubering med målproteinet; C- Inkubere med et antistoff for deteksjon; D- deteksjon (kan gjøres ved kjemiluminescens, fluorescens, etc.); E- analysere resultatene for å avsløre proteinbindingsseter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Et eksempel på peptid rekke screening Detection oppnås ved hjelp chemiluminescence Raset inneholder to identiske arrays som duplikater..es / ftp_upload / 52097 / 52097fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Screening et peptid array for binding av STIL IDR til CHFR protein: 4,5 mikrometer Hans-merket STIL 500-650 ble screenet for binding rekken. Hvert svart flekk indikerer binding mellom STIL fragment og CHFR-avledet peptid 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: STIL bindested i CHFR vist på strukturen i CHFR Cys rik domenenavn (rester 424-661, PDB ID: 2XPO) Den syv.peptider som bandt STIL i peptid rekke screening kan deles i tre regioner farget rosa, oransje og rødt, som er fjernt i det primære sekvensen, men tett sammen i 3D-struktur skaper en bindingssetet. Denne full regionen danner et forpliktende lomme for STIL i dimer CHFR 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Peptid rekke screening er et utmerket verktøy for å identifisere bindingsstedene for et mål protein i sine partnere. Denne analysen er rask og enkel å utføre, og resultatene kan bli oppnådd i en eller to dager. Peptid-screening matrise er allsidig og kan anvendes til mange formål. Den kan brukes for å karakterisere legg oversettings modifikasjoner som for eksempel fosforylering og identifisering av substrater for kinaser. For eksempel: FLT3 kinase, som er relatert til akutt myelogen leukemi, phosphorylates Tyr-holdige substrat peptider funnet av et peptid rekke screening 6. De hemmende egenskaper av tyrosinkinaseinhibitorer pazopanib og lapatinib ble testet ved hjelp av peptid rekke screening 23. Peptider matrise kan brukes til å identifisere de områder som medierer protein-protein interaksjoner. Eksempler på slike proteiner studert i vårt laboratorium ved hjelp av denne fremgangsmåten er: samspillet mellom HIV-1-Vif-proteinet, og A3G cellulært protein ble karakterisert ossing et peptid matrise 24; peptid rekke screening ble brukt til å studere samspillet av anti-apoptotiske BCL-2 familien med den pro-apoptotiske ASPP2 protein 25 og for å studere bindingen av tBID, medlem av BCL-2-familien, med mitokondrie protein MTCH2 26; intra-molekylære samspillet mellom Myosin IIC domener ble analysert ved hjelp av peptid rekke screening 27. Her presenterer vi et eksempel på hvordan vi brukte peptid rekke screening for å identifisere de områder som medierer STIL-CHFR interaksjon, et protein-protein interaksjon viktig i spredning og kreft 14. Avslører den eksakte bindingssete kan tjene som grunnlag for rasjonell utforming av hemmere av studert samspillet.
Peptidet matrise screening er ikke en kvantitativ analyse. Det er semi-kvantitativ fordi mengden av peptid i hvert punkt på matrisen varierer på grunn av forskjellen i syntesen utbytte og renhet peptid. Dette igjen avhenger av PeptIDE-sekvens, lengde osv Variasjonen i utbytte og renhet kan også noen ganger føre til falske negative og falske positive resultater. Sammenligning mellom intensitetene innenfor samme rekke kan gjøres, noe som resulterer i semikvantitativ rangering. Men en slik sammenligning mellom forskjellige matriser eller forskjellige forsøk med den samme matrise er ikke pålitelig. For å kvantifisere bindingen, bør de peptider som finnes i peptidet matrisen screening bli syntetisert og testet for binding målproteinet ved hjelp av biofysiske metoder slik som fluorescens anisotrofi, isoterm kalorimetri titrering (ITC), overflate-plasmonresonans (SPR), etc. Slike assays er ikke alltid er følsom for svak binding, siden de krever en høy konsentrasjon av proteinet for å påvise en slik binding. Peptidet matrise screening, på den annen side, er svært følsom for svak binding. Således noen av de vekselvirkninger som observeres i matrisen screening kunne ikke observeres eller kvantifiseres ved hjelp av fremgangsmåter slik som fluorescens anisot tråaktig 14. Det faktum at peptid-screening matrise krever meget lave konsentrasjoner av protein i kombinasjon med den høye følsomheten til analysen gjør peptidet matrisen en nyttig metode for screening av protein-peptid interaksjoner i et bredt spekter av affiniteter.
Falske negative resultater kan også være på grunn av det faktum at lineære peptider kan ikke på riktig måte representerer 3D-strukturen til bindingssetet i proteinet. Dette er imidlertid ikke et problem med egen uordnede proteiner, som er godt representert av peptider. Falske positive resultater kan også være forårsaket av binding av antistoffet til matrisen. Disse kan påvises ved å utføre en kontrollforsøk som beskrevet i avsnitt 4.3 i protokollen. Falske negative resultater kan også oppnås hvis proteinet epitop som gjenkjennes av antistoffet bli ueksponert ved binding til peptidet array. Dette problemet er ikke vanlig, men kan løses ved hjelp av et polyklonalt antistoff mot proteinet.
jove_content "> kan Peptidet matrise screening også anvendes for forbedring av bly peptider, inkludert alanin skanne og SAR-studier 7. Når bindingssetet av målet er kjent, kan en matrise basert på dens sekvens være utformet med flere modifikasjoner inkludert utskifting av hvert Residuet til alanin (Ala scan) for å identifisere de viktige rester for interaksjon. På lignende måte kan SAR-studier bli utført ved å endre forskjellige egenskaper av de bindende peptider. Disse omfatter å variere lengden av peptidet, ved å erstatte den tilsvarende rester av D a-aminosyrer og andre modifikasjoner som for eksempel metylering, glykosylering og utskifting av ikke-naturlige aminosyrer. Slike modifiserte peptider, alle basert på en targetsekvens, kan syntetiseres på en matrise og screenet for binding av målproteinet i en rask og enkel eksperiment , gir et vell av informasjon for å forbedre en potensiell inhibitor og forståelsen av den molekylære mekanismen for interaksjon.elektro-4 kjemiluminescens. Peptid rekke beskrevet her er kun til engangsbruk og kan ikke gjenbrukes.
Protokollen som presenteres her viser det brede nytten av peptid arrays. Ved hjelp av en riktig utformet array, kan bindingssteder mellom to proteiner bli identifisert i detalj. Når bindingssetet er godt karakterisert at den kan brukes som et medikament for inhibering av målsetet det relevante protein-protein-interaksjon. Basert på bindende peptider som finnes i matrisen screening, kan hemmende små molekyler være utformet og vist som narkotika fører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
AF ble støttet av en startbevilgning fra European Research Council under EFs syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) / ERC Grant avtalen n ° 203413 og ved Minerva Center for Bio-hybrid kompleks systems.HA og AI støttes av Dalia og Dan Maydan Fellowship for avanserte grads studenter ved Det hebraiske universitetet i Jerusalem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Innovative Peptide Solutions. , http://www.jpt.com (2014).
- PEPSCAN shaping peptides to perfection. , http://www.pepscan.com (2014).
- Intavis Bioanalytical Instruments. , http://www.intavis.com (2014).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, Cambridge, England. 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a, Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
