Abstract
Белок-белковых взаимодействий посредником большинство процессов в живой клетке и управления гомеостаза организма. Нарушениями белковых взаимодействий может привести к болезни, что делает белковых взаимодействий важные цели наркотиков. Таким образом, крайне важно понимать эти взаимодействия на молекулярном уровне. Белковых взаимодействий изучаются с использованием различных методик, начиная от клеточных и биохимических анализов, чтобы количественных биофизических анализов, и они могут быть выполнены либо с полноразмерные белки, с белковыми доменами, или пептидами. Пептиды служить превосходными инструментами для изучения белковых взаимодействий, так как пептиды могут быть легко синтезированы и позволяют упором на конкретных участках взаимодействия. Пептидные массивы позволяют идентифицировать сайты взаимодействие между двумя белками, а также для скрининга пептидов, которые связывают белок-мишень для терапевтических целей. Они также позволяют высокую пропускную способность исследования SAR. Для идентификации сайтов связывания, в typiкал пептид массив обычно содержит частично перекрывающихся 10-20 остатков пептиды, полученные из полных последовательностей одного или нескольких партнеров белков желаемого целевого белка. Скрининг массив для связывания белок-мишень раскрывает обязательные пептиды, соответствующие сайты связывания в белках партнеров, в простой и быстрый метод, используя только небольшое количество белка.
В этой статье мы опишем протокол для скрининга пептидных массивы для отображения сайтов взаимодействия между белком-мишенью и ее партнеров. Массив пептид разработан на базе последовательностей белков-партнеров с учетом их вторичные структуры. Массивы, используемые в настоящем протоколе были Celluspots массивы, подготовленные INTAVIS биоаналитических инструменты. Массив заблокирован, чтобы предотвратить неспецифическое связывание и затем инкубировали с исследуемой белка. Обнаружение с использованием антитела раскрывает связывающие пептиды, соответствующие определенным сайтам взаимодействия между белками.
Introduction
Белок-белковых взаимодействий посредником большинство процессов в живой клетке. Нарушениями белковых взаимодействий может привести к болезни, что делает белковых взаимодействий важные цели наркотиков. Таким образом, крайне важно понимать эти взаимодействия на молекулярном уровне. Белковых взаимодействий изучаются с использованием различных методик, начиная от клеточных и биохимических анализов, чтобы количественных биофизических анализов, и они могут быть выполнены либо с полноразмерные белки, с белковыми доменами, или пептидами. Пептиды служить превосходными инструментами для изучения белковых взаимодействий. Это потому, что пептиды могут быть легко синтезированы и позволяют фокусировки на определенном участке взаимодействия с одной стороны, и на нескольких целевых белков в высокой пропускной образом, с другой стороны 1,2. Скрининг Пептид массив быстро, легко выполнить метод получения большого количества данных о взаимодействиях белка-мишени с многочисленными партнерами в течение короткого времени 3, В отличие от других биохимических или биофизических методов обнаружения и анализа белок-белковых взаимодействий, скрининг пептид массив требует очень низкую концентрацию белка и может обнаружить очень слабое связывание. Пептидные массивы могут быть использованы для многих приложений в пептид-белковых взаимодействий, таких как отображение белок-белок или рецептор-лиганд сайтов взаимодействия 4, гомо- или гетеро-олигомеризации интерфейсов, характеризующие антитела, эпитопы, 5, изучении активности ферментов 6 и высокую пропускную способность корпусного Активность отношения (SAR) изучает 7. Для обзора о скрининге пептид массива углубленного см Кац и др. 4
Несколько типов пептидных массивов в настоящее время существуют. Существуют две основные стратегии синтетические пептидные для создания массива: синтез пептидов перед прикреплением их к твердому носителю, или синтеза пептидов непосредственно на твердом носителе, главным образом, с использованием метода SPOT 4,8.пептиды синтезируют на твердом носителе, как правило, с помощью 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) химии 8. Среди общих синтетических схем пептид привязанность через N-конца (например, JPT pepstar массивы 9) и привязанность пептид через С-конца (например, PEPSCAN pepchip массивы 10, JPT pepspot массивы 9 и INTAVIS celluspot массивы 11) 4. Твердый носитель может варьировать, и так же химический состав пептидной связью с ней. Cys-концевыми пептиды могут быть прикреплены к предметные стекла с помощью тиольной группы 12. N-конец пептида может быть ковалентно связан с гидроксильной группой на целлюлозной мембране через этерификации аминокислоты присоединены 8.
Здесь мы представляем подробный протокол для скрининга пептидных массивы в качестве метода для изучения белок-белковых взаимодействий. Массив мы использовали массив Celluspots, который является микро-массив, содержащий большое АМОЕНТ пятен (дубликаты до 384 мест) на небольшом целлюлозной мембране, поддерживаемых предметное стекло. Это дает возможность работать при низких объемов белка и антител и получение значительного количества данных в одном эксперименте. Этот массив содержит также высокую плотность пептид, который позволяет обнаруживать низким сродством связывания. Массив был использован для отображения взаимодействия СТИЛ-CHFR, которая очень важна для управления распространением нормальный клеточный 13. Неконтролируемое взаимодействие между двумя белками могут привести к развитию рака. Нанеся на карту этого взаимодействия мы нашли конкретное сайт связывания и связывания остатков 14. Это открывает путь для разработки рациональных ингибиторы, которые препятствуют это взаимодействие белок-белок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Проектирование массив пептид
- Разделить последовательность целевого белка в частично перекрывающихся 10-20 остатков пептидов. Вары величину перекрытия на конкретном эксперименте и ресурсы, выполняющего лаборатории, но, в принципе, больше перекрытия, тем лучше. При проектировании пептиды учитывать известно элементов вторичной структуры в белке, которые могут быть ответственны за взаимодействие.
- Заказать разработанный массив пептид через коммерческих поставщиков. Здесь используют пептиды, ковалентно связанный с массива через С-конце.
2. Блокирование неспецифическое связывание
- Сделать буферного раствора 50 мМ Трис или фосфатным, содержащим 0,05% Tween 20 (TBST / PBST) и регулировать до нужного рН с измеренным количеством HCl или NaOH (для того, чтобы знать точное ионной силы) и желаемой ионной силы с NaCl , Здесь используют рН 7,5 и ионную силу 150 мм.
- Сделать блокирующий раствор2,5% (вес / объем) сухое обезжиренное молоко в TBST / PBST.
- Чтобы предотвратить неспецифическое связывание, погружать массив в 5 мл блокирующего раствора. Инкубируйте массив в течение 2-4 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С на качалке.
3. Инкубация с белком
- Промыть массив первых 5 мл блокирующего раствора в течение 30 сек, а затем дважды 5 мл TBST / PBST в течение 5 мин на шейкере при комнатной температуре.
- Инкубируют промытые массив с 5 мл His-меченого раствора белка, содержащего 2,5% (вес / объем) сухое обезжиренное молоко, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. Здесь используют 4,5 мкМ раствора белка (стил 500-650), растворенного в описанном блокирующего раствора.
Примечание: Обычно 5-10 мкМ белка используются для скрининга, но концентрация белка может быть даже по цене от 2-3 мкМ, в зависимости от аффинности связывания и местных концентраций пептидов, которые связаны с массива (КПД Синтез). Буфер, в котором белокрастворяют может варьироваться, но является общим для разбавления белка с использованием того же блокирующий раствор, описанный выше. - Инкубируйте массив в белковом растворе в течение 3-8 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
4. Инкубация с антителом
- Вымойте массив со трижды 5 мл TBST / ФБРТ. Первый стирки в течение 30 сек с последующим двух промывок 5 мин на шейкере при комнатной температуре.
- Инкубируют промытые массив с 5 мл разбавленного HRP-конъюгированного антитела (1: 1500) в инкубационном буфере, содержащем те же ингредиенты в тех же концентрациях, блокирующим раствором, в течение 1 часа на шейкере при комнатной температуре. Антитело может связываться либо целевой белок или тег.
- Выполнение контрольных экспериментов тестирования взаимодействие антитела с пептидами на массив, особенно если массив содержит пептиды из белка-мишени (например, для олигомеризации исследований), повторив тот же протокол без Steр 3, инкубации с белком.
- Вымойте массив со трижды 5 мл TBST / ФБРТ. Первый стирки в течение 30 сек с последующим двух промывок 5 мин на шейкере при комнатной температуре.
5. Чтение массива
- Провести разработку хемилюминесценции с западной промокательной комплекта подложки ECL.
- Выполните обнаружение с люминесцентным анализатора изображений.
- Проанализируйте результаты. Убедитесь, что оба дубликаты на массиве показывают те же самые сигналы, так что результаты являются надежными. Если структура белка партнера, как известно, поиск по структуре для связывания пептидов и отыскать сайтов связывания. Даже пептиды, которые гораздо в последовательности может быть близко друг к другу в третичной структуры и создать сайт связывания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
СТИЛЬ является очень важным центросомных белок. Она контролирует нормальное деление клеток и клеточной пролиферации 13,15 - 19. СТИЛ взаимодействует с несколькими белками 18,20,21, и большинство взаимодействий происходить через его центральную часть, которая является по своей природе неупорядоченная область (IDR) 14. Мы разработали множество, состоящий из пептидов, полученных из связывающий белок CHFR СТИЛЬ. CHFR является подавитель опухоли, которая индуцируется в ответ на митотических стресс 22. Поскольку структура связывающего домена СТИЛЬ из CHFR был неизвестен в то время, мы разделили домен белка до 15 остатков длинных пептидов с перекрытием 7 остатков, как описано в шаге 1.1 в протоколе. Мы провели множество пептидный скрининг для выявления связывания CHFR-СТИЛЬ сайты, как указано в приведенном выше протоколе и показано на рисунке 1. Мы использовали массив INTAVIS Celluspot, состоящий из 384 пептидов в двух экземплярах, который может предоставить огромное количество информации, как показано на рисунке 2. Используя этот пептид массив мы нашли сайты связывания для СТИЛЬ в связывающего белка CHFR (рисунок 3). Каждый черное пятно в массиве представляет CHFR полученный пептид, который привязан STIL. Следует отметить, что каждый пептид появляется дважды, поскольку она существует в двух экземплярах, который проверяет достоверность результатов. Взаимодействие между СТИЛЬ и CHFR было показано ранее на уровне белка 13,14. Скрининг пептид массив показал 7 CHFR-пептиды, которые связывали Stil РДЭ, остатки 500-650 (рисунок 3, Amartely др. 14). Эти результаты позволили нам карту сайта связывания СТИЛЬ на CHFR. Несмотря на расстоянии этих 7 пептидов на CHFR первичной последовательности они создают четкую сайт связывания для СТИЛЬ в CHFR (Рисунок 4) 14.
7 / 52097fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1: Схема скрининга пептида массива A- Проектирование массив пептид, который состоит из частично перекрывающих пептидов, полученных из одного или нескольких белков-партнеров, с учетом их вторичной структуры;. B- Инкубация с белком-мишенью; C- Инкубация с антителом для детекции; Обнаружение D- (может быть сделано с помощью хемилюминесценции, флуоресценции, и т.д.); E-Анализируя результаты, чтобы выявить белок сайты связывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Пример пептид массива скрининг обнаружения достигается с помощью хемилюминесценции слайд содержит два идентичных массивы в качестве дубликатов..эс / ftp_upload / 52097 / 52097fig2large.jpg "цель =" _ пустой "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Скрининг массив пептид для связывания СТИЛЬ РДЭ в CHFR белка: 4,5 мкмоль His-меткой Stil 500-650 был показан для связывания массива. Каждый черное пятно указывает связывание между фрагментом СТИЛЬ и CHFR-пептид 14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Связывание сайт СТИЛЬ в CHFR показано на структуру богатого домена CHFR Cys (остатки 424-661, PDB ID: 2XPO) семь.пептиды, которые связывали STIL в скрининге пептид массива можно разделить на три региона цветных розовый, оранжевый и красный, которые удаленная в первичной последовательности, но близко друг к другу в структуре 3D, создавая один сайт связывания. Это полный область образует связывающий карман для СТИЛЬ в димера CHFR 14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Пептид скрининг массив является отличным инструментом для определения сайты связывания белка-мишени в своих партнеров. Этот анализ очень быстро и легко выполнить, а результаты могут быть получены в одном или двух рабочих дней. Пептид скрининг массив является универсальным и может быть использован для различных целей. Он может быть использован для характеристики почтовые модификации перевода, такие как фосфорилирование субстратов и идентификации киназ. Например: в FLT3 киназы, которая связана с острой миелоидной лейкемией, фосфорилирует Тир-содержащих субстратов пептиды найденные массив пептид скрининга 6. В ингибирующие свойства Pazopanib ингибиторы тирозинкиназы и Лапатиниб была протестирована с помощью пептидной массив скрининг 23. Пептиды массив может быть использован, чтобы идентифицировать сайты, которые опосредуют белок-белковых взаимодействий. Примерами таких белков изученных в нашей лаборатории с помощью этого метода являются: взаимодействие между белком ВИЧ-1 VIF и клеточного белка A3G характеризовался насчисле массив пептидный 24; Скрининг пептид массив использовался для изучения взаимодействия антиапоптотического семьи BCL-2 с проапоптотического ASPP2 белка 25 и изучать связывание tBID, член BCL-2 семейства, с митохондриальной белка MTCH2 26; внутри молекулярное взаимодействие между Миозин IIC доменов была проанализирована с помощью пептидной массив скрининг 27. Здесь мы приведем пример того, как мы использовали пептид массив скрининг для выявления участков, которые обеспечивают взаимодействие СТИЛ-CHFR, а белок-белковое взаимодействие важную в пролиферации и рака 14. Выявление точное сайт связывания может служить основой для рационального проектирования ингибиторов изучаемого взаимодействия.
Скрининг пептид массив не количественный анализ. Это полуколичественный поскольку количество пептида в каждом месте на массиве изменяется из-за разницы в текучести синтеза пептидов и чистоты. Это, в свою очередь, зависит от PeptПоследовательность язь, длина и т.д. изменения выхода и чистоты может привести иногда к ложным отрицательным или ложноположительных результатов. Сравнение интенсивностей в одном массиве может быть, в результате чего полуколичественного рейтинге. Однако такое сравнение между различными массивами или различных экспериментов с тем же массивом не является надежным. Для количественной оценки связывания, пептиды, обнаруженные в скрининге пептид массива должны быть синтезированы и испытаны для связывания белок-мишень, используя биофизических методов, таких как анизотропии флуоресценции, изотермического титрования калориметрии (ITC), поверхностного плазмонного резонанса (SPR), и т.д. Такие анализы не всегда чувствительны к слабым связывания, так как они требуют высокую концентрацию белка, чтобы обнаружить такое связывание. Скрининг пептид массив, с другой стороны, очень чувствительна к слабой связи. Таким образом, некоторые из взаимодействий, наблюдаемых в скрининге массива не могло быть обнаружено или количественно с использованием таких методов, как флуоресценции anisot тягучим 14. Тот факт, что скрининг пептида массив требует очень низкие концентрации белка в сочетании с высокой чувствительности анализа делают пептид массив полезным методом для скрининга белков-пептид взаимодействия в широком диапазоне сродства.
Ложноотрицательных результатов также может быть связано с тем, что линейные пептиды не могут должным образом представлять 3D структуры сайта связывания в белке. Это, однако, не является проблемой, с внутренне неупорядоченных белков, которые хорошо представленных пептидов. Ложные положительные результаты также могут быть вызваны связывание антитела к массиву. Они могут быть обнаружены путем выполнения контрольный эксперимент, как описано в разделе 4.3 протокола. Ложные отрицательные результаты также могут быть получены, если белок эпитоп, который распознается антителом стать неэкспонированные при связывании с массива пептида. Эта проблема не имеет ничего общего, но может быть решена с помощью поликлональных антител против белка.
jove_content "> скрининга пептида массив также может быть использован для улучшения свинца пептиды, включая аланин сканирования и SAR изучает 7. После того, как сайт связывания с мишенью, как известно, является массивом на основе его последовательности могут быть разработаны с нескольких модификаций с заменой друг остаток на аланин (Ala) сканирования, чтобы определить важные остатки для взаимодействия. Аналогичным образом, исследования SAR может быть выполнена путем изменения различных свойств связывания пептидов. Они включают изменения длины пептида, замены остатков на соответствующий D -аминокислоты и другие модификации, такие как метилирование, гликозилирование и замены неприродных аминокислот. Такие модифицированные пептиды, все они основаны на одном последовательности-мишени, могут быть синтезированы на одном массиве и подвергают скринингу на связывание целевого белка в одной быстрой и легкой эксперимента , обеспечивая большой объем информации для улучшения потенциальный ингибитор и понимания молекулярного механизма взаимодействия.электро-4 хемилюминесценции. Массив пептид, описанный здесь, только для одноразового использования и не может быть использован повторно.
Протокол, представленные здесь демонстрирует широкий полезность пептидных массивов. Использование правильно, предназначенный массив, сайты связывания между двумя белками могут быть идентифицированы в деталях. После того, как сайт связывания хорошо характеризуется его можно использовать в качестве сайта-мишени лекарственного средства для ингибирования соответствующий белок-белкового взаимодействия. На основании связывания пептидов, обнаруженных в скрининге массива, ингибирующие малые молекулы могут быть разработаны и просеивают, как ведет наркотиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
AF поддержали исходное гранта от Европейского исследовательского совета при Седьмой рамочной программы Европейского сообщества (FP7 / 2007-2013) / соглашение ERC Грант N ° 203413 и Минерва Центра био-гибридный комплекс systems.HA и ИИ поддерживаются по Dalia и Дэн Майдан стипендий для студентов старших курсов, степень в Еврейском университете в Иерусалиме.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Innovative Peptide Solutions. , http://www.jpt.com (2014).
- PEPSCAN shaping peptides to perfection. , http://www.pepscan.com (2014).
- Intavis Bioanalytical Instruments. , http://www.intavis.com (2014).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, Cambridge, England. 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a, Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
