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Medicine

स्पाइनल कॉर्ड चोट की प्रायोगिक Contusive मॉडल में तंत्रिका स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण

Published: December 17, 2014 doi: 10.3791/52141
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Pharmacology, Department of Health Sciences, University of Milan, 2Department of Neuroscience, College of Medicine, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

रीढ़ की हड्डी की चोट गंभीर रुग्णता और उच्च मृत्यु का कारण बनता है कि एक दर्दनाक स्थिति है। इस काम में हम विस्तार से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के एक प्रत्यारोपण द्वारा पीछा चूहों में रीढ़ की हड्डी की चोट का एक contusion मॉडल का वर्णन है।

Abstract

रीढ़ की हड्डी में चोट मस्तिष्क संबंधी रोग का एक जटिल द्वारा विशेषता एक विनाशकारी नैदानिक ​​हालत है। रीढ़ की हड्डी में चोट के पशु मॉडल चोट करने के लिए जैविक प्रतिक्रियाओं की जांच करने और संभावित उपचारों का परीक्षण करने के लिए दोनों का इस्तेमाल किया जा सकता है। शल्य चिकित्सा द्वारा उजागर रीढ़ की हड्डी के लिए दिया contusion या संपीड़न चोट विकृति का सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल हैं। इस रिपोर्ट में प्रयोगात्मक कुचलन विशिष्ट चोट मापदंडों की परिभाषा के माध्यम से एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट पशु मॉडल के निर्माण की अनुमति देता है, जो अनंत क्षितिज (एच) Impactor डिवाइस का उपयोग करके किया जाता है। स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण आमतौर पर इस गंभीर स्थिति के इलाज के लिए एक संभावित उपयोगी रणनीति माना जाता है। कई अध्ययनों से स्टेम कोशिकाओं की एक किस्म की रोपाई के प्रभाव का मूल्यांकन किया है। यहाँ हम CD1 चूहों में कोशिकाओं की पूंछ नस में इंजेक्शन द्वारा पीछा रीढ़ की हड्डी की चोट के लिए एक अनुकूलित विधि प्रदर्शित करता है। मैं) सेल लेबलिंग वाई: संक्षेप में, हम करने के लिए प्रक्रियाओं प्रदान करते हैंएक महत्वपूर्ण ट्रेसर वें, द्वितीय) चूहों के पूर्व ऑपरेटिव केयर, एक contusive रीढ़ की हड्डी में चोट के तृतीय) निष्पादन, और पोस्टमार्टम तंत्रिका व्यापारियों के चतुर्थ) नसों में प्रशासन। इस कुचलन मॉडल एक पुनर्योजी चिकित्सा दृष्टिकोण में प्रभावकारिता और स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण की सुरक्षा का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

एक रीढ़ की हड्डी में चोट (एससीआई), खेल और हिंसा एक, मोटर वाहन दुर्घटनाओं की तरह उच्च ऊर्जा आघात के कारण सबसे आम चोट है गिर जाता है। गंभीर एससीआई में चोट बल स्नायविक समारोह के अचानक नुकसान हो, तंत्रिका ऊतक नष्ट कर देता है या नुकसान। घाव एससीआई उम्र के 10 और 40 साल के बीच युवा वयस्कों में अक्सर होता है। यह बहुत रोगी की मानसिक और शारीरिक स्थिति को प्रभावित करता है और समाज दो को भारी आर्थिक प्रभाव का कारण बनता है। तीव्र चरण में इलाज के दृष्टिकोण अक्सर संभवतः आगे की क्षति 3-4 attenuate को corticosteroid, शल्य चिकित्सा स्थिरीकरण और decompression के एक उच्च खुराक के लिए सीमित है, लेकिन एससीआई के बाद हरकत वसूली पर इन विधियों की भूमिका अभी भी विवादास्पद हैं। तीव्र ऊतकों को नुकसान, घाव चोट है और कई प्रकार की कोशिकाओं में 5-6 की अध: पतन का कारण demyelination और मौत के माध्यमिक तंत्र की सक्रियता के अलावा। समारोह की वसूली की डिग्री के कर सकते हैंदस चोट साइट 7 पर बख्शा सफेद पदार्थ की हद तक सहसंबद्ध किया।

एससीआई के पशु मॉडल की चोट के ऊतक के जैविक प्रतिक्रियाओं की जांच करने और संभावित उपचारों का परीक्षण करने के लिए दोनों का इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, एक मानव विकृति का एक उपयोगी पशु मॉडल है कि न केवल हालत के कुछ पहलुओं को पुन: पेश करने के लिए है, लेकिन यह भी प्रत्यक्ष नैदानिक ​​अवलोकन और प्रयोग से अधिक लाभ की पेशकश करनी चाहिए। रीढ़ की हड्डी में चोट के सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल शल्य चिकित्सा द्वारा उजागर रीढ़ की हड्डी 8 के लिए दिया कुचलन या संपीड़न चोट शामिल है। एक नियंत्रित वजन ड्रॉप कुचलन चोट के विकास एससीआई अनुसंधान के इतिहास में एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर का प्रतिनिधित्व करते हैं। ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी रीढ़ की हड्डी अनुसंधान केन्द्र एक कंप्यूटर 9 द्वारा नियंत्रित प्रभाव के मापदंडों के साथ रीढ़ की हड्डी की एक विशेष संपीड़न प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक डिवाइस के तकनीकी चुनौती का प्रयास किया है। यह मूल रूप से उपयोग वाई के लिए डिजाइन किया गया थावें चूहों; इसे बाद में चूहों 10 की दिशा में लागू करने के लिए संशोधित किया गया था। दृष्टिकोण के इस तरह के फायदे की चोट के बायोमैकेनिक्स अधिक गहराई में अध्ययन किया जा सकता है और चोट के मापदंडों के एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक मॉडल को प्राप्त करने के क्रम में एक और अधिक पूर्ण ढंग से परिभाषित किया जा सकता है कि कर रहे हैं, इसलिए के प्रभाव से और अधिक सटीक मूल्यांकन की इजाजत दी कार्यात्मक वसूली प्रक्रिया पर परीक्षण उपचार।

कई अध्ययनों से एससीआई मॉडल 11 में स्टेम कोशिकाओं की एक किस्म के प्रत्यारोपण प्रभाव का मूल्यांकन किया है। हमने हाल ही में माउस दाता 12-13 की मौत के बाद उप-निलय क्षेत्र (SVZ) में कई घंटे से वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को अलग-थलग पड़ गए हैं। यह प्रक्रिया एससीआई के इलाज के लिए एक पुनर्योजी चिकित्सा दृष्टिकोण में फायदेमंद होने लगते हैं, जो तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को कहा जाता है, पोस्टमार्टम तंत्रिका व्यापारियों (प्रधानमंत्री-NPCs), की आबादी प्रदान करता है। इस पत्र में हम प्रदर्शन करेंगे: मैं) महत्वपूर्ण ट्रेसर PKH26 के साथ सेल लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल, द्वितीय) सर्जनराजनैतिक प्रक्रिया दर्दनाक एससीआई पर प्रदर्शन, और लेबल की कोशिकाओं के तृतीय) अंतःशिरा (चतुर्थ) प्रशासन को। इसके अलावा, इस काम में हम प्रतिरोपित कोशिकाओं रीढ़ की हड्डी घाव साइटों की ओर पलायन और microtubule जुड़े प्रोटीन (एमएपी) 2 सकारात्मक कोशिकाओं में ज्यादातर को अलग दिखाना है कि। इसके अलावा, भेदभाव पिछले अंग समारोह के एक स्थिर वसूली को बढ़ावा देने के साथ है।

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Protocol

नोट: सभी प्रक्रियाओं मिलान विश्वविद्यालय की समीक्षा समिति ने मंजूरी दे दी है और यूरोपीय समुदाय निर्देशक दिनांक November 1986 (86/609 / ईईसी) के अनुपालन में प्रयोगशाला पशु के लिए इतालवी दिशानिर्देश मिले थे।

ट्रांसप्लांटेशन के लिए कोशिकाओं की 1. तैयारी

नोट: 5 वीं और इन प्रयोगों के लिए संस्कृति में 9 पारित होने के बीच का प्रयोग तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं; प्रत्यारोपण के लिए चिह्नित किया जा रहा से पहले प्रसार और भेदभाव की क्षमता के लिए संस्कृतियों का परीक्षण करें। 12 immunocytochemistry द्वारा भेदभाव की सीमा निर्धारित।

  1. 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / 150 μl (प्रत्यारोपण माउस प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं) के एक एकाग्रता के लिए Resuspend कोशिकाओं। कोशिकाओं की एक अतिरिक्त सिरिंज लोड हो रहा है प्रयोजनों के लिए आवश्यक है, क्योंकि माउस अनुसार कम से कम 1.2 x 10 6 कोशिकाओं को तैयार है।
  2. एक 10 मिलीलीटर शंक्वाकार शीशी में कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम सेल के माध्यम से 13 का उपयोग करते हुए तीन बार धोएं। प्रत्येक मेंधोने कदम, centrifugation द्वारा वेग कोशिकाओं (500 XG के लिए 5 मिनट, आर टी)।
  3. अंतिम स्पिन से पहले कोशिकाओं की गणना।
  4. कोशिकाओं (5 मिनट के लिए 500 XG) अपकेंद्रित्र, और फिर किसी भी कोशिकाओं को हटाने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, लेकिन सतह पर तैरनेवाला का कोई अधिक से अधिक 25 μl छोड़ रहा है, सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  5. कोमल pipetting के साथ सेल गोली और resuspend करने मंदक सी के 1 मिलीलीटर जोड़कर एक 2x सेल निलंबन तैयार करें।
  6. एक ट्यूब में मंदक सी के 1 एमएल PKH26 इथेनॉल डाई समाधान के 4 μl जोड़कर मंदक सी में - (6 एम 4 एक्स 10) और फैलाने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण तुरंत धुंधला से पहले, एक 2x डाई समाधान तैयार करते हैं।
  7. तेजी से 2x डाई समाधान के 1 एमएल 2x सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ने और तुरंत (एमएल 1.2 10 x 7 कोशिकाओं / और 2 एक्स 10 हो जाएगा अंतिम सेल घनत्व - 6 एम PKH26) pipetting द्वारा नमूना मिश्रण।
  8. 1-5 मिनट के लिए सेल / डाई निलंबन सेते हैं।
  9. (एक बराबर मात्रा जोड़कर दो धुंधला बंद करोमिलीलीटर) HBSS में 1% BSA समाधान की और 1 मिनट के लिए सेते हैं।
  10. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं (500 XG मिनट 10 के लिए) और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  11. HBSS और सेंट्रीफ्यूज (5 मिनट के लिए 500 XG) के 10 मिलीलीटर में Resuspend सेल गोली।
  12. अनबाउंड डाई को हटाने के लिए सुनिश्चित करने के लिए पूरा माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ सेल गोली दो से अधिक बार धोएं।
  13. सेल वसूली, सेल व्यवहार्यता और प्रतिदीप्ति तीव्रता का आकलन करने के लिए पूर्ण माध्यम के 10 एमएल में सेल गोली Resuspend। कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक हैं, तो धोने और 3.3 x 10 5 कोशिकाओं / 50 μl की एकाग्रता में एक बाँझ शारीरिक समाधान में उन्हें resuspend।

सर्जरी के लिए 2. तैयारी

  1. स्वच्छ और बाँझ सर्जरी उपकरण।
  2. एक सड़न रोकनेवाला एजेंट के साथ पोंछते द्वारा शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार करें। IH Impactor उपकरण स्थापित करें।
  3. संज्ञाहरण उपकरण तैयार: VetScav फ़िल्टर, सतत प्रवाह प्रेरण कक्ष, ऑक्सीजन जीन डिवाइस वजनी के साथ सक्रिय गैस मेहतरrator, चूहे के लिए कम प्रवाह ओ 2 मीटर। प्रेरण कक्ष और सर्जरी के दौरान इस्तेमाल मुखौटा साफ करें।
  4. 2.5% ऑक्सीजन में (वी / वी) isoflurane (/ मिनट एक एल) के साथ पशुओं anesthetize, और नशीली दवाओं के प्रभाव में लाने के लिए प्रवाह प्रेरण के बाद 5 मिनट इंतज़ार करो। मूंछ हिल रहे हैं, तो जाँच करें या लुटेरा pinching के जवाब में धीमी गति से पिछले अंग वापसी अगर वहाँ। सर्जरी के दौरान, 2.0% ऑक्सीजन में (वी / वी) isoflurane (/ मिनट एक एल) के लिए isoflurane एकाग्रता कम।

सर्जरी और प्रत्यारोपण के लिए चूहों का 3. तैयारी

  1. मानक स्थितियों में प्रयोगों (22 ± 2 डिग्री सेल्सियस, 65% आर्द्रता, और 8:00-8:00 के बीच कृत्रिम प्रकाश) से पहले कम से कम तीन दिनों के लिए पुरुष वयस्क CD1 चूहों (25-30 ग्राम) रखें।
    नोट: suturing के लिए शल्य चिकित्सा की तैयारी से पूरी प्रक्रिया के बारे में 40 मिनट का समय लगेगा।
    1. पशु की पहचान करने के लिए, पानी प्रतिरोधी रंग की स्याही के माध्यम से पूंछ निशान।
  2. एक electr का प्रयोग करेंआईसी क्लिपर काठ क्षेत्र के लिए, के बारे में टी 2 के स्तर पर, गर्दन से माउस की पृष्ठीय बाल काट लिए।
  3. एक आयोडाइड समाधान और इथेनॉल (बाँझ पानी में 70%) के साथ तैयार क्षेत्र जीवाणुरहित।
  4. एक 200 की उप त्वचीय (अनुसूचित जाति) इंजेक्शन μl gentamycin (बाँझ खारा समाधान में 1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ पशु समझो।
  5. Buprenorphine सुखाना रोकने के लिए और इंजेक्षन करने के लिए दोनों जानवर आंखों को नेत्र स्नेहक लागू करें (subcutaneously, 0.03 मिलीग्राम / किग्रा) दर्द को कम करने के लिए।

4. Laminectomy

  1. सर्जरी के दौरान हाइपोथर्मिया की समस्या से बचने के लिए एक गर्म स्लाइड पर माउस रखें। पृष्ठीय पक्ष के साथ पशु स्थिति।
  2. T7 से टी 12 के लिए ब्याज की क्षेत्र में एक स्केलपेल के साथ एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाओ।
  3. (आमतौर पर वक्ष पृष्ठीय प्रक्रियाओं वें 5 वीं और 6 के बीच की जगह में पाया) मानक संदंश का उपयोग करके त्वचा और सतही वसा पैड पकड़ो।
  4. T6 के रूप में पोत के तहत प्रक्रिया गणनातो T7 के लिए कदम।
  5. रीढ़ की वक्रता को बढ़ाने के लिए माउस के उदर पक्ष के तहत एक छोटा सा असर रखें। Graefe संदंश के साथ यह अवरुद्ध करके रीढ़ की हड्डी को स्थिर।
  6. लामिना संपर्कों स्केलपेल टिप के पृष्ठीय सतह तक स्केलपेल का उपयोग करके T7 और T10 वर्टिब्रल स्तर से द्विपक्षीय paravertebral मांसपेशियों काटें।
  7. T10 तक T7 से जंक्शन से दूर टिक स्केलपेल का प्रयोग करें। T8 और T9 काँटेदार protrusions के बीच की जगह में बंद करो। माइक्रो कैंची के साथ T8-T9 और T9-T10 के बीच ऊतकों काटें।
    1. T9 प्रक्रिया को दूर करने के Rongeur का प्रयोग करें। ध्यान से सूक्ष्म कैंची से पेशी परत दूर scraping द्वारा जंक्शन बेनकाब। हड्डी सामने आ रहा है जब तक जारी रखें।
  8. लामिना से मांसपेशियों को हटाने और कशेरुकाओं के बीच एक छोटे से अंतरिक्ष को खोलने के लिए संदंश का प्रयोग करें। धीरे, हड्डी के तहत माइक्रो कैंची डालने पर दोनों पक्षों के पटल में कटौती और संदंश के साथ इस हिस्से को हटा दें।
  9. च के साथ लामिना निकालेंorceps की हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए। पीछे किसी भी मुफ्त या दांतेदार हड्डी के टुकड़े को छोड़ने के लिए नहीं भूलें; Rongeur साथ उन्हें हटा दें।
  10. चीरा के पास हो सकता है कि periosteum साथ ही किसी भी हड्डी के टुकड़े या मांसपेशियों को दूर करने के लिए छोटी सी टिप संदंश का प्रयोग करें।
  11. T9 के पृष्ठीय प्रक्रिया के शीर्ष आधा निकालें और IH Impactor डिवाइस प्रोटोकॉल के लिए आगे बढ़ें।

5. IH Impactor डिवाइस प्रोटोकॉल (contusion)

  1. IH Impactor डिवाइस का स्थिरीकरण मंच के बीच में माउस रखें।
  2. दो संयुक्त पोजीशनिंग हथियारों से स्थिरीकरण मंच के साथ जुड़े हुए दो दांत संदंश के साथ पशु (वक्ष बांस के लिए बाएं हाथ, ग्रीवा बांस के लिए सही बांह) ब्लॉक।
  3. व्याख्यान चबूतरे वाला कशेरुका शरीर (T8) के पार्श्व में बढ़त काबू करने के लिए व्याख्यान चबूतरे वाला हाथ का प्रयोग करें।
  4. T10 कशेरुका शरीर काबू करने के लिए एक ही तरीके से दुम हाथ में हेरफेर।
  5. टिप डिवाइस में स्थिरीकरण मंच प्लेस और कम (व्यास 0.75मिमी) यह छूने के बिना संभव के रूप में की हड्डी के करीब।
  6. प्रभाव की शुरुआत से पहले टिप तीन पूरा बदल जाता है लिफ्ट।
  7. 100 मिमी / सेकंड में 60 kdyn के बल देने के लिए सेट impactor साथ कुचलन प्रदर्शन करते हैं।

6. Sutures और पोस्ट की देखभाल

  1. एक 4/0 absorbable सिवनी धागे के साथ चीरा सीवन। हटाया लामिना के स्थल पर उजागर रीढ़ की हड्डी कवर; एक छोटी सी सुई के माध्यम से कटौती के extremities में ऊतक सीवन। तुरंत ऊपर और रीढ़ की हड्डी लोगों तक पहुंचाने के स्थल के तहत दो टांके में डाल दिया।
  2. अंतर्निहित मांसपेशियों बंद बन्द रखो बिना दो या तीन पलटा क्लिप का उपयोग कर त्वचा को बंद करें।
  3. पीठ के निचले हिस्से में इंजेक्शन खारा समाधान subcutaneously के 2 मिलीलीटर के साथ माउस के बाद सर्जरी हाइड्रेट।
  4. शल्य चिकित्सा वसूली के दौरान हाइपोथर्मिया से बचने के लिए वापस एक पूर्व गर्म पिंजरे में माउस रखें। हीटिंग पैड पर प्लेस पिंजरों।
  5. जाँच करके तीव्र चरण के बाद चोट के दौरान चूहों मॉनिटरआकार मूत्राशय, सिवनी और पशु वजन दो बार एक दिन। धीरे (खूनी, बादल या किसी भी अवक्षेप युक्त हो सकता है मूत्र) मूत्र पथ के संक्रमण से बचने के लिए मूत्राशय (7 दिनों के लिए दिन में दो बार) निचोड़।
  6. और एंटीबायोटिक (दो दिनों के बाद सर्जरी सुप्रीम कोर्ट इंजेक्शन के लिए 2 मिलीलीटर) एक नमकीन घोल इंजेक्शन के साथ एक दिन में एक बार चूहों को समझो (gentamycin 0.2 मिलीलीटर, अनुसूचित जाति इंजेक्शन) पांच दिनों के लिए चोट के बाद।
  7. Buprenorphine साथ पोस्ट ऑपरेटिव analgesia के लिए चूहों को समझो (0.1 मिलीग्राम / किग्रा, दिन में दो बार) 3 दिनों के लिए चोट के बाद।

प्रकोष्ठों के 7. पूंछ नस इंजेक्शन

नोट: निम्न चरण में पूंछ नस में कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने के लिए प्रक्रिया का प्रदर्शन किया जाता है। कोशिकाओं को भी एक stereotaxic फ्रेम 15-16 का उपयोग करके एक intraspinal प्रत्यारोपण के साथ प्रशासित, या महाकुण्ड 17 में किया जा सकता है। यह अन्य प्रकार की कोशिकाओं में इस तरह के mesenchymal stromal कोशिकाओं के रूप में, इस विधि के साथ प्रत्यारोपित किया जा सकता है कि विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है(उदाहरण के लिए, अस्थि मज्जा mesenchymal स्टेम सेल, वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल, एमनियोटिक द्रव कोशिकाओं)। इसके अलावा, इस तरह के नैनोकणों के रूप में अन्य उपचार के विकल्प के रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्ट किया जा सकता है।

  1. उपयोग करने से पहले सुई साफ करने के लिए 70% इथेनॉल और पीबीएस का प्रयोग करें। सुई और केवल बाँझ दस्ताने के साथ सिरिंज संभाल लेना।
  2. एक 0.3 मिलीलीटर सिरिंज (29 जी सुई और 0.33 सीसी सिरिंज) में टेस्ट ट्यूब और लोड कोशिकाओं के 75 μl में कोशिकाओं Resuspend।
  3. कोई बुलबुले सेल निलंबन के भीतर मौजूद हैं कि सुनिश्चित करें। सेल अवसादन से बचने के लिए एक क्षैतिज स्थिति में सिरिंज रखें।
  4. पूंछ नसों को चौड़ा करने के लिए गर्मी दीपक के नीचे माउस रखें।
  5. एक संकीर्ण नीली रेखा के रूप में पार्श्व पूंछ नस कल्पना करने के लिए माउस restrainer में खींच धीरे माउस को पकड़ो और।
  6. एक शराब झाड़ू के साथ पूंछ साफ करें। नस कल्पना है, एक बार बाएं हाथ की बीच की उंगली और अंगूठे के बीच पूंछ नस हासिल किया है।
  7. क्षितिज से एक 15 डिग्री के कोण पर सतह के लिए सुई ले आओ और बेवल ऊपर है सुनिश्चित करें।
  8. 0.33 μl / सेकंड की दर से कोशिकाओं के 50 μl इंजेक्षन। इंजेक्शन के बाद, 10 सेकंड से सुई का त्याग देरी। धीरे धीरे सुई वापस लेना और सेल निलंबन के संभव तपका के लिए ध्यान देना।
  9. भार के बीच कदम 7.1 में के रूप में सिरिंज साफ करें।

8. व्यवहार परीक्षण और हिंद अंग समारोह

  1. खुले मैदान में माउस रखें।
  2. बस्सो माउस पैमाने (बीएमएस) 18 के अनुसार खुले मैदान परीक्षण के साथ कुचलन के बाद हरकत समारोह और पिछले अंग वसूली का मूल्यांकन।
    नोट: स्नायविक समारोह 4 सप्ताह 18 के लिए चोट के बाद 3 दिन से, समय-समय पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

9. छिड़काव

  1. प्रयोगात्मक अवधि के अंत में, सोडियम pentobarbital की intraperitoneal इंजेक्शन (65 मिग्रा / किग्रा) द्वारा जानवरों anesthetize। Evaluat को पैर की अंगुली चुटकी का प्रयोग करेंई संज्ञाहरण स्तर माउस हानिकारक उत्तेजनाओं को अनुत्तरदायी है के बाद ही आगे बढ़ना है और।
  2. एक सर्जरी विमान पर एक लापरवाह स्थिति में पशु नियंत्रित।
  3. बस रिब पिंजरे के नीचे आवरण और पेट की दीवार के माध्यम से कट। जिगर से डायाफ्राम अलग करें।
  4. फुफ्फुस गुहा का पर्दाफाश करने के लिए डायाफ्राम कटौती करने के लिए कैंची का प्रयोग करें।
  5. कॉलर हड्डियों तक रिब पिंजरे के पक्ष काटें।
  6. असिरूप उपास्थि दबाना और सिर पर hemostat के स्थान के लिए hemostats का प्रयोग करें।
  7. संदंश के साथ एक आड़ा विमान पर दिल के तीसरे तल पकड़ो। बाएं वेंट्रिकल में सुई डालें।
  8. दिल को दबाना एक hemostat का प्रयोग करें। इस सुई को सुरक्षित और रिसाव को रोकता है।
  9. सही अलिंद में कटौती करने के लिए कैंची का प्रयोग करें।
  10. पीबीएस जानवर के माध्यम से (18 मिलीग्राम / मिनट) पंप करने की अनुमति दें। (; बारे में 70 मिलीलीटर पीबीएस के लिए इसी 3-4 मिनट) बफर अर्क अवधि के दौरान इस दबाव बनाए रखें। दिल साफ है जब तक जारी रखें।
  11. पंप के माध्यम से लगानेवाला (आसुत जल में 4% paraformaldehyde, 4% पीएफए) की अनुमति देने के लिए पानी निकलने की टोंटी स्विच करें। 4% पीएफए ​​लगभग 8-10 मिनट (300 मिलीलीटर) के लिए पशु के माध्यम से पंप करने की अनुमति दें। धीरे धीरे / मिनट 30 मिलीलीटर की एक अधिकतम तक पहुँचने के लिए दबाव बढ़ा। एक कठोर जिगर एक सफल छिड़काव का सबसे अच्छा संकेत है।

10 ऊतक संग्रह और प्रसंस्करण, प्रोटोकॉल और Iimmunohistochemistry

  1. T5 से एल 1 के लिए रीढ़ की हड्डी डोरियों काटना। तब (4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन) 4% पीएफए ​​में 6 मिलीलीटर में ऊतक के बाद तय कर लो।
  2. क्रायो यह रक्षा और ठंड के दौरान क्रिस्टल के गठन को रोकने के क्रम में 4 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए 30% sucrose के साथ एक समाधान में एक ही ऊतक रखो।
  3. त्वरित सूखी बर्फ का उपयोग कर कॉर्ड फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान।
  4. 15 माइक्रोन मोटाई के साथ एक cryostat के माध्यम से धारा और गिलास स्लाइड पर वर्गों को इकट्ठा करने और immunocytochemistry के लिए जारी है।
  5. प्रत्येक के लिए पीबीएस के 200 μl के साथ वर्गों कुल्लाLIDE (3 बार, 5 मिनट प्रत्येक, आर टी)।
  6. 200 10% NGS के μl और आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 के साथ प्रत्येक स्लाइड permeabilize।
  7. प्रत्येक स्लाइड के लिए पीबीएस के 200 μl (5 मिनट प्रत्येक, आर टी 3 बार) के साथ वर्गों कुल्ला।
  8. (; पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100 5% NGS) 30 मिनट (आरटी) के लिए स्लाइड के लिए अवरुद्ध समाधान के 200 μl के साथ गैर विशिष्ट साइटों को ब्लॉक।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μl के साथ प्रत्येक स्लाइड सेते (5% NGS में एंटीबॉडी पतला, पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100)।
  10. प्रत्येक स्लाइड के लिए पीबीएस के 200 μl के साथ वर्गों धो (3 बार, 5 मिनट प्रत्येक; आर टी)।
  11. आरटी पर 2 घंटे के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
  12. प्रत्येक स्लाइड के लिए पीबीएस के 200 μl के साथ वर्गों धो (3 बार, 5 मिनट प्रत्येक; आर टी)।
  13. '4, 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (/ एमएल अंतिम एकाग्रता एक माइक्रोग्राम प्रति, आरटी पर 10 मिनट) के 200 μl के साथ दाग नाभिक।
  14. FluorSave अभिकर्मक का उपयोग करके माउंट और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण।
    नोट: मेंनियंत्रण निर्धारण, प्राथमिक एंटीबॉडी छोड़े गए हैं और एक ही उपवर्ग के असंबंधित आईजीजी के बराबर सांद्रता के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। Microtubule जुड़े प्रोटीन 2 प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया था।

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Representative Results

प्रतिरोपित कोशिकाओं की कुल संख्या 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं है और पूंछ नस में लगातार तीन इंजेक्शनों में विभाजित किया गया था। हम फॉस्फेट बफर समाधान के 50 μl (पीबीएस) में 3.3 x 10 5 कोशिकाओं दिलाई। पहला इंजेक्शन दूसरा 6 घंटा बाद, चोट के बाद 30 मिनट के भीतर प्रदर्शन किया और घाव के बाद पिछले 18 घंटा हो गया था। पीएम-NPCs के प्रशासन के लिए एससीआई के बाद 18 घंटे के लिए एक समय सीमा के चुनाव इस बार 14 में रक्त मस्तिष्क बाधा का इष्टतम पारगम्यता द्वारा निर्धारित किया गया था। स्टेम कोशिकाओं को इंजेक्शन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए यह सकारात्मक नियंत्रण laminectomies पशुओं के लिए उपयोगी होगा (एन = 14) और पीबीएस एक नकारात्मक नियंत्रण (एन = 14) के रूप में पशुओं को इंजेक्शन।

पीएम-NPCs, हिंद अंग समारोह की वसूली में सुधार घाव साइट की ओर पलायन और एमएपी-2 सकारात्मक कोशिकाओं में अंतर

T9 के कुचलन एक प्रगतिशील जी द्वारा पीछा पिछले अंग समारोह का क्षणिक नुकसानradual वसूली (चित्रा 1)। 2-3 सप्ताह के भीतर, पीबीएस इलाज घायल चूहों सुधार हुआ है और पिछले अंग समारोह बीएमएस के साथ (या वजन का समर्थन या, सामयिक अक्सर, या लगातार पृष्ठीय कदम बिना पंजा के तल रखने के लिए इसी, लेकिन तल का 18 घुसने नहीं) के तीन अंक पर पहुंच गया । इसके बजाय, एक ही अवलोकन अवधि के भीतर, प्रधानमंत्री NPCs के साथ इलाज किया घायल चूहों (समन्वय, या कुछ समन्वय के साथ कदम रख अक्सर या लगातार तल बिना अक्सर या लगातार तल कदम के लिए इसी) बीएमएस के 4.5 अंक तक पहुंच गया, एक उच्च वसूली देखी गई। व्यवहार में सुधार एससीआई के बाद 7 दिन और 14 दिन के बीच की अवधि में विशेष रूप से स्पष्ट हो गया था। परपीड़ा की तरह forelimb हाइपर संवेदनशीलता 19 के कोई संकेत नहीं 30 दिनों का अवलोकन अवधि के दौरान किसी भी प्रयोगात्मक समूह में किसी भी समय दर्ज किए गए।

के किनारों पर जमा हुए PKH26 (चित्रा 2) के साथ लेबल अधिकांश engrafted प्रधानमंत्री NPCs,घाव समूहों के गठन में उनके प्रशासन के शुरुआती दिनों से (चित्रा 3)। तब प्रतिरोपित कोशिकाओं घाव किनारों के साथ है और वे धीरे-धीरे न्यूरॉन्स की विषम सेलुलर रचना, यह सोचते हैं विभेदित जहां एक और अधिक विसरित फैशन में चले गए। घाव और प्रत्यारोपण के बाद 30 दिनों में, प्रधानमंत्री NPCs के सेल शरीर के आकार में वृद्धि हुई है और सबसे कोशिकाओं में वृक्ष के समान की तरह प्रक्रियाओं स्पष्ट थे और पूरी तरह से (चित्रा 4) -2 नक्शा करने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा immunostained। रूपात्मक जटिलता की उपलब्धि और प्रतिरोपित प्रधानमंत्री NPCs के द्वारा MAP2 को सकारात्मकता की संभावना अपने स्पष्ट रूप से भेदभाव आकृति विज्ञान और किसी एक लेबल सेल में दो नाभिक के अभाव में स्पष्ट है जो मेजबान रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स, जीवित रहने के साथ फ्यूजन के कारण नहीं है।

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रधानमंत्री NPCs के कार्यात्मक recov में सुधारघायल पशुओं में ery। खुले मैदान हरकत मोटर समारोह वसूली 18 के निर्धारण के लिए नियोजित परीक्षण किया गया था। पशु कुचलन एक दिन पहले परीक्षण किया है और बीएमएस पैमाने में नौ अंक अर्जित किए गए थे। Lesioned जानवरों में पहले दिन पोस्ट की चोट पर, बीएमएस स्कोर शून्य करने के लिए कम किया है। जानवरों के प्रधानमंत्री NPCs के साथ इलाज किया गया जब lesioned चूहों के पिछले अंग समारोह की वसूली के लिए एक उल्लेखनीय और लंबे समय तक चलने सुधार दिखाया। विश्लेषण डबल नेत्रहीन में प्रदर्शन किया गया था, और प्रत्येक समूह में 14 जानवरों की रचना की थी। मान औसत ± SEM के प्रतिनिधित्व करते हैं। हम Tukey के बाद परीक्षण के बाद एनोवा परीक्षण के माध्यम से सांख्यिकीय मतभेद निर्धारित की। *** पी <0.001; ** पीबीएस बनाम पी <0.01।

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रधानमंत्री NPCs के PKH26 लेबलिंग। PKH26 साथ लेबलिंग प्रक्रिया के बाद, PMNPCS विसू हैं लाइव छवि माइक्रोस्कोप के साथ फ्लोरिडा EVOS alized और सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ एक ही साधन (पैमाने बार = 50 माइक्रोन) के साथ लिया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
घाव साइट में प्रधानमंत्री NPCs के चित्रा 3. स्थानीयकरण। PKH26 लेबल प्रधानमंत्री NPCs (लाल) उनके चतुर्थ इंजेक्शन के बाद 30 दिनों में घाव साइट के किनारों भर में मौजूद हैं। छवि एक माउस के लिए प्रतिनिधि है, लेकिन इसी तरह की छवियों कम से कम 5 जानवर (पैमाने बार = 50 माइक्रोन) के लिए प्राप्त किया गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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प्रतिरोपित प्रधानमंत्री NPCs। अधिकांश PKH26 लेबल प्रधानमंत्री NPCs (लाल) में चित्रा 4. MAP2 अभिव्यक्ति वृक्ष के समान की तरह प्रक्रियाओं के साथ एक neuronal आकार की तरह हासिल कर लिया और एमएपी-2 सकारात्मक कोशिकाओं (हरा) भेदभाव कर दिया था। नाभिक नीले (DAPI) में दाग रहे हैं। छवि एक माउस के लिए प्रतिनिधि है, लेकिन इसी तरह की छवियों कम से कम 5 जानवर (पैमाने बार = 25 माइक्रोन) के लिए प्राप्त किया गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पत्र में हम (गंभीर) 70 Kdyne के बल पर एक अनंत क्षितिज Impactor का उपयोग करते हुए दर्दनाक रीढ़ की हड्डी में चोट की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन किया। एक बड़ा बल प्रतिमान (80 Kdyne) का उपयोग करना, हम दुर्भाग्य से उच्च चूहों मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है कि एक और अधिक गंभीर चोट पैदा कर सकता है। इस समस्या से बचने के क्रम में, हम आमतौर पर समारोह और कम मृत्यु के एक क्रमिक वसूली के साथ एक repeatable घाव करने के लिए जुड़ा हुआ है कि एक उदारवादी बल प्रतिमान (70 Kdyne) का चयन करें। यह impactor मंच पर पशु का सही निर्धारण करने के लिए विशेष ध्यान देने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है इस तरह के एक स्थिर चोट का उत्पादन करने के लिए; विशेष रूप से रीढ़ की हड्डी impactor नोक पर केंद्रित किया जाना चाहिए, और impactor के दो हथियार एक दूसरे के समानांतर होना चाहिए। इसके अलावा, ध्यान कशेरुकाओं कुचल दिया जा सकता है और रस्सी संदंश के सुझावों द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता है जब, Impactor संदंश के साथ पशु अवरुद्ध में लिया जाना चाहिए। एनिमा की स्थितिlaminectomy के बाद एल महत्वपूर्ण है, और इस प्रक्रिया के दौरान पशुओं के प्रबंध भी बहुत महत्वपूर्ण है। विशेष ध्यान देने की भी हमेशा एक ही स्थल पर और एक ही विस्तार के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए जो laminectomy प्रक्रिया को दिया जाना चाहिए। इन प्रक्रियाओं laminectomy के दौरान प्रदर्शन कर रहे हैं, पर नजर रखने के लिए एक और पद्धति मुद्दा हड्डियों में कटौती और लामिना को हटाने के माध्यम से की हड्डी को मुक्त करने, Rongeur सूक्ष्म कैंची का उपयोग कर, या संदंश जब कॉर्ड हानिकारक के जोखिम में कमी की है, को खत्म करने के लिए पार्श्व हड्डी protrusions और टुकड़े शेष है, और periosteum दूर करने के लिए। ऊपर की तरफ इशारा करते हुए सुझावों के साथ सूक्ष्म कैंची और Rongeur का उपयोग उक्त समस्याओं का सामना करने के जोखिम कम हो जाएगा।

इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण सीमा जानवरों पद चोट अवधि में आंतरिक और बाह्य गंभीर मूत्र संक्रमण का विकास हो सकता है कि उच्च संभावना है। बाहरी संक्रमण मो lesioned चूहों की अक्षमता की वजह से हैपिछले अंग वजन समर्थन के साथ किया है। इसके विपरीत, आंतरिक मूत्र संक्रमण स्वतंत्र रूप से पेशाब करने घायल चूहों की अक्षमता की वजह से हो सकता है। यह संकेत एंटीबायोटिक के साथ जानवरों इंजेक्षन करने के लिए बिल्कुल जरूरी है कि इन समस्याओं से बचने के लिए और पहले सप्ताह के जानवरों की देखभाल की प्रक्रिया के दौरान एक दिन में दो बार मूत्राशय के आकार की जाँच करने के क्रम में। जलयोजन स्थिति और वजन lesioning के बाद पहले तीन हफ्तों के दौरान ध्यान से जाँच की जानी चाहिए।

हम बस्सो और उनके सहयोगियों (बीएमएस) 18 द्वारा विकसित एक विशिष्ट व्यवहार परीक्षा के माध्यम से मूल्यांकन किया गया है कि पिछले अंग समारोह की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घाटे को प्राप्त करने में सक्षम थे वर्णित प्रक्रियाओं को लागू करना। इसके तत्काल बाद चोट के बाद समारोह के पिछले अंग हानि पहले 2-3 सप्ताह के दौरान सबसे अधिक महत्वपूर्ण है कि एक क्रमिक वसूली द्वारा पीछा किया जाता है, जो पूरा हो गया है। lesioned चूहों वयस्क प्रधानमंत्री NPCs (चित्रा 1 के साथ इलाज किया गया जब व्यवहार वसूली के लिए एक उच्च स्तर पर पहुंच गया (चित्रा 3) के किनारों पर confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से PKH26 सकारात्मक प्रधानमंत्री NPCs का पता चला। हम महत्वपूर्ण grafted प्रधानमंत्री NPCs की कुल संख्या के रूप में पहले हमारे शोध समूह 20-21 द्वारा रिपोर्ट grafted ESCs और वयस्क एनएससी से अधिक है कि अनुमान है। Lesioning और प्रत्यारोपण के बाद चार सप्ताह में, सबसे पीएम-NPCs के बड़े शरीर है और पूरी तरह से (चित्रा 4) -2 नक्शा करने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा immunostained रहे हैं कि वृक्ष के समान की तरह प्रक्रियाओं बढ़ाया अधिकारी।

दर्दनाक रीढ़ की हड्डी में चोट के इस मॉडल के प्रमुख लाभ चोट के मानकीकरण है। समारोह के पिछले अंग वसूली की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के लिए समय-संबंधी की अवस्था भी हासिल की है। इस तरह के reproducibility के पुनर्योजी दवा पढ़ाई के लिए कोशिकाओं के प्रत्यारोपण सहित जांच की उपचार के लिए सबूत के सिद्धांत के अध्ययन को परिभाषित करने के लिए यह संभव बनाता हैमामलों की एक कम संख्या के साथ है। इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी में चोट के pathophysiology के कई पहलुओं को अधिक से अधिक विस्तार से विश्लेषण किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित की घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26GL-1KT  Sigma 091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device  Precision Systems and Instrumentation, LLC Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml Euroclone ECM0011B 1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml Merial B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer 2Biological Instruments HB101-sm-402
Scalpel, size 10 Lance Paragon 26920
Small Graefe Forceps 2Biological Instruments 11023-14
Rongeur Medicon Instruments 07 60 07
Micro scissors 2Biological Instruments 15000-00
Absorbable sutures (4/0) Safil Quick C0046203
Hemostat 2Biological Instruments 13014-14
Reflex 7 wound clip applicator 2Biological Instruments 12031-07
7 mm Reflex wound clips 2Biological Instruments 12032-07
NGS Euroclone ECS0200D
Triton X 100 Merck Millipore 1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2 Millipore AB5622
Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008
FluorSave Reagent  Calbiochem 345789
Neural stem cells medium DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) 
DMEM-F12 Euroclone ASM5002
l-glutamine Euroclone ECB3000D
glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
putrescine Sigma-Aldrich P5780-25G
progesterone Sigma-Aldrich P6149-1MG
Sodium-selenite Sigma-Aldrich S9133-1MG
transferrin Sigma-Aldrich T 5391
Insulin Sigma-Aldrich I1882
Heparin sodium-salt Sigma-Aldrich H0200000
bFGF Life Technology PHG0024
h-EGF Life Technology PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G Terumo MYJECTOR 
buprenorphine Schering Plough SpA TEMGESIC
eye gel Bausch & Lomb LIPOSIC

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References

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Carelli, S., Giallongo, T., Gerace, C., De Angelis, A., Basso, M. D., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (94), e52141, doi:10.3791/52141 (2014).

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