Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Neural трансплантации стволовых клеток в экспериментальной Contusive модели с повреждением спинного мозга

Published: December 17, 2014 doi: 10.3791/52141
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Pharmacology, Department of Health Sciences, University of Milan, 2Department of Neuroscience, College of Medicine, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

Травма спинного мозга является травматический состояние, которое вызывает сильную заболеваемости и высокой смертности. В этой работе мы подробно контузии модель травмы спинного мозга у мышей с последующим трансплантации нервных стволовых клеток.

Abstract

Травма спинного мозга является разрушительным клиническое состояние, характеризуется комплексом неврологических дисфункций. Животные модели травмы спинного мозга может быть использована как для изучения биологических ответов на травмы и тестирования потенциальных методов лечения. Ушиб или сжатия травм доставлены в хирургическое подвергаются спинного мозга являются наиболее широко используется модели патологии. В этом докладе экспериментальный ушиб осуществляется с помощью бесконечного горизонта (IH) ИМПАКТОРА устройство, которое позволяет создание воспроизводимой модели на животных травмы в результате определения конкретных параметров травмы. Трансплантация стволовых клеток обычно считается потенциально полезной стратегией для лечения этой изнурительной состоянии. Многочисленные исследования оценивали эффекты трансплантации различных стволовых клеток. Здесь показано, адаптированный способ травмы спинного мозга с последующим хвостовую вену инъекцией клеток у мышей CD1. Короче говоря, мы предоставляем процедуры: I) мечения клеток Wiго жизненного индикатора, II) предоперационная уход мышей, III) исполнение в contusive травмы спинного мозга, и IV) внутривенное введение посмертного нейронных предшественников. Эта модель контузии может быть использована, чтобы оценить эффективность и безопасность трансплантации стволовых клеток в регенеративной медицине подход.

Introduction

Травмы спинного мозга (SCI) является наиболее распространенным повреждения, вызванные высокой энергии травмы, как автотранспортных средств аварий, падений, спортивных и насилие 1. При тяжелой SCI, травмы сила разрушает или повреждает нервную ткань, вызывая внезапную потерю неврологической функции. Травматический SCI часто встречается в молодых взрослых в возрасте от 10 до 40 лет. Это сильно влияет на психическое и физическое состояние пациента и наносит огромный экономический эффект для общества 2. Подход к лечению в острой фазе часто ограничивается высокой дозы кортикостероидов, хирургическая стабилизация и декомпрессии, возможно, ослабить дальнейшее повреждение 3-4, но роль этих методов по восстановлению опорно-двигательного аппарата после ТСМ-прежнему спорным. В дополнение к острой потере тканей, травматического повреждения и активации вторичных механизмов дегенерации причиной демиелинизации и гибели нескольких типов клеток 5-6. Степень восстановления функции можно,десять коррелирует в пределах пощадил белого вещества в месте повреждения 7.

Животные модели ТСМ могут быть использованы как для исследования биологических реакций ткани на травму и тестирования потенциальных методов лечения. Кроме того, полезную модель животного в патологии человека имеет не только воспроизводить некоторые аспекты этого состояния, но также должны предложить преимущества по сравнению с непосредственным клиническим наблюдением и экспериментом. Наиболее широко используемые модели травмы спинного мозга связаны контузии или сжатия травм доставлен в хирургическое подвергаются спинного мозга 8. Развитие контролируемой травмы веса падение ушиба представляют собой важную веху в истории исследований SCI. Университет штата Огайо спинного мозга исследовательский центр проводит технологическую проблему устройства, которые могут быть использованы, чтобы вызвать определенную компрессию спинного мозга с параметрами воздействия контролируемых компьютером 9. Это был первоначально разработан для использования Wiго крыс; позже он был изменен, чтобы применить к мышей 10. Преимущества такого подхода является то, что биомеханики травмы могут быть изучены более подробно и параметры травмы могут быть определены в более полном образом, чтобы получить воспроизводимый экспериментальную модель, поэтому обеспечивает более точную оценку воздействия проверенные методы лечения на процесс функционального восстановления.

Многие исследования оценили трансплантации эффекты различных стволовых клеток в моделях ТСМ 11. Мы недавно выделенный взрослых нервные стволовые клетки из подменю вентрикулярной зоне (SVZ) через несколько часов после смерти донора мыши 12-13. Эта процедура обеспечивает население нервных стволовых клеток, называется вскрытий нейронных предшественников (PM-НПС), которые, кажется, чтобы быть выгодным в регенеративной подхода лекарственный препарат для лечения ТСМ. В этой статье мы покажем: я) протокол для маркировки клеток с жизненной примеси PKH26, II) Surgческих процедура для выполнения на черепно-SCI, и III) для внутривенного введения (IV) введение меченых клеток. Кроме того, в этой работе показано, что трансплантированные клетки мигрируют в спинного мозга поврежденных участках и дифференцировать в основном в ассоциированный с микротрубочками белка (MAP) 2-позитивных клеток. Кроме того, дифференциация сопровождается продвижения устойчивого восстановления функции задних конечностей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Все процедуры были одобрены комитетом по рассмотрению университета Милане и встретился с итальянским рекомендаций для лабораторных животных в соответствии с Европейской директивой Сообщества от ноября 1986 (86/609 / EEC).

1. Подготовка клеток для трансплантации

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте нервные стволовые клетки между 5-м и 9-м проходе в культуре в течение этих экспериментов; проверить культуры для пролиферации и дифференцировки способности перед помечены для трансплантации. Определить степень дифференциации иммуноцитохимически 12.

  1. Ресуспендируют клеток в концентрации 1 х 10 6 клеток / 150 мкл (трансплантации 1 × 10 6 клеток на мышь). Подготовка по меньшей мере, 1,2 × 10 6 клеток на мышь, так как избыток клеток требуется для целей шприцы нагрузки.
  2. Вымойте клетки 3 раза с использованием среды нервные стволовые клетки 13 в 10 мл коническую пробирку. В каждомстадию промывки, осадок клеток путем центрифугирования (500 мкг в течение 5 мин, RT).
  3. Граф клеток до окончательного отжима.
  4. Центрифуга клетки (500 мкг в течение 5 мин), а затем аспирата супернатант, стараясь не удалить все клетки, но оставляя не более 25 мкл супернатанта.
  5. Подготовка 2x клеточной суспензии путем добавления 1 мл разбавител C к осадку клеток и ресуспендируют с осторожно пипеткой.
  6. Непосредственно перед окрашиванием, подготовить 2x раствора красителя (4 х 10 - 6 М) в разбавителе С добавлением 4 мкл раствора этанола красителя PKH26 1 мл разбавител С в трубке и хорошо перемешать, чтобы разойтись.
  7. Быстро добавить 1 мл 2 раза клеточной суспензии к 1 мл раствора красителя 2x и сразу же смешать образец с помощью пипетки (конечную плотность клеток будет 1,2 х 10 7 клеток / мл и 2 х 10 - 6 М PKH26).
  8. Выдержите клеточной суспензии / краски в течение 1-5 мин.
  9. Остановите окрашивание путем добавления равного объема (2мл) 1% раствора BSA в HBSS и инкубировали в течение 1 мин.
  10. Центрифуга клетки (500 х г в течение 10 мин) и тщательно удалить супернатант.
  11. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл HBSS и центрифуге (500 мкг в течение 5 мин).
  12. Промыть осадок клеток еще 2 раза с 10 мл полной среды, чтобы обеспечить удаление несвязанного красителя.
  13. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл полной среды для оценки восстановления клеток, выживаемость клеток и интенсивности флуоресценции. Если клетки необходимы для трансплантации, мыть и ресуспендируют их в стерильном физиологическом растворе в концентрации 3,3 × 10 5 клеток / 50 мкл.

2. Подготовка к операции

  1. Очистки и стерилизации хирургия Оборудование.
  2. Подготовьте область хирургии, вытирая с асептическим агентом. Настройка устройства IH ударника.
  3. Подготовка анестезиологического оборудования: активный газ Scavenger с VetScav Фильтр устройством для взвешивания, непрерывный поток индукции камеры, кислорода Generator, низкого расхода O 2 Meter для мышей. Очистите индукции камеры и маска, используемая во время операции.
  4. Обезболить животных с 2,5% (V / V) изофлураном в кислороде (1 л / мин), и ждать 5 минут после подачи индукции для наркотиков вступили в силу. Проверьте, если усы дергались, или если есть медленно задних конечностей денег в ответ на ущемление подушечку. Во время операции, снизить изофлуран концентрации до 2,0% (объем / объем) изофлуран в кислороде (1 л / мин).

3. Подготовка мышей для хирургии и трансплантологии

  1. Держите взрослый мужчина CD1 мышей (25-30 г) в течение по крайней мере 3 дней до экспериментов в стандартных условиях (22 ± 2 ° С, 65% влажности, а искусственный свет между 08:00 до 8:00 вечера).
    ПРИМЕЧАНИЕ: вся процедура от хирургического подготовки к наложения швов займет около 40 мин.
    1. Чтобы определить животное, отметьте хвост с помощью водонепроницаемого цветными чернилами.
  2. Используйте электроIC клипер сократить спинной волосы мыши от шеи, около на уровне Т2, в поясничной области.
  3. Стерилизовать подготовленный участок с иодидом раствора и этанола (70% в стерильной воде).
  4. Лечения животного с суб кожной (SC) инъекции 200 мкл гентамицина (1 мг / мл в стерильном солевом растворе).
  5. Применение глазной смазку обоих глаз животных, чтобы предотвратить высыхание и вводят бупренорфин (подкожно, 0,03 мг / кг), чтобы облегчить боль.

4. Ламинэктомия

  1. Наведите на слайд теплее избежать проблемы гипотермии во время операции. Расположите животное с спинной стороной вверх.
  2. Сделайте вертикальный разрез скальпелем над интересующей нас области, из Т7 Т12.
  3. Держите кожу и поверхностные жировой ткани с помощью стандартных щипцов (обычно находится в пространстве между 5-й и 6-й грудной процессов спинной).
  4. Граф процесс под сосудом, как T6затем перейти к Т7.
  5. Поместите немного подшипник под брюшной стороне мыши, чтобы увеличить искривление позвоночника. Остановите спинной мозг, блокируя его с помощью пинцета Грефе.
  6. Разрежьте паравертебральных мышц на двусторонней основе с T7 и T10 позвонка уровне, не используя скальпель, пока дорсальной поверхности пластинки контактов наконечников скальпель.
  7. Используйте скальпель, чтобы поставить галочку в стык с Т7 до Т10. Остановка в пространстве между Т8 и Т9 колючих выступов. Вырезать ткани между T8-T9 и T9-T10 с микро ножницами.
    1. Используйте костными кусачками, чтобы удалить процесс T9. Expose стык, тщательно очищая от мышечного слоя с микро ножницами. Продолжайте, пока кости не подвергается.
  8. Используйте пинцет, чтобы удалить мышцы от пластинки и открыть небольшое пространство между позвонками. Аккуратно вставьте микро ножницы под кости, разрезать пластинку с обеих сторон и снимите эту деталь щипцами.
  9. Снимите пластинку с Forceps подвергать кабель. Будьте уверены, чтобы не оставить любые свободные или зазубренные костные фрагменты позади; удалить их с костными кусачками.
  10. Используйте маленькие щипцы Совет, чтобы удалить надкостницы, а также любые фрагменты кости или мышцы, что может быть рядом с разрезом.
  11. Снимите верхнюю половину процесса спинной T9 и перейти к протоколу устройства IH ударника.

5. IH Impactor протокол устройства (контузии)

  1. Место мыши в середине стабилизации платформы устройства IH ударника.
  2. Блок животное с двумя зубами щипцов, связанных с платформой стабилизация двух совместных позиционирования оружия (левую руку для грудного позвонка, правая рука для шейного позвонка).
  3. Используйте ростральную руку, чтобы схватить боковой край Ростральные тела позвонка (T8).
  4. Манипулирование хвостовой руку таким же образом понять T10 тела позвонка.
  5. Поместите платформу стабилизации в устройстве и снизить наконечник (диаметр 0,75мм) как можно ближе к шнуру, как можно, не касаясь его.
  6. Поднимите кончик три полных оборота до начала воздействия.
  7. Выполнение контузию с ударного набора для доставки силу 60 kdyn при 100 мм / сек.

6. Швы и пост-уход

  1. Шовный разрез с 4/0 рассасывающийся шовный нити. Накройте подвергается спинного мозга на месте удаленной пластинки; шов ткань на концах разреза с помощью тонкой иглы. Поместите два шва непосредственно над и под воздействием месте спинного мозга.
  2. Закройте кожу с помощью двух или трех Reflex клипы без щипать от основные мышцы.
  3. Гидратации мыши после операции с 2 мл физиологического раствора подкожно в нижней части спины.
  4. Наведите назад в предварительно нагретой клетке, чтобы избежать переохлаждения во время хирургического восстановления. Место клетки на грелки.
  5. Монитор мышей во время острой фазы после травмы, проверяяразмер пузыря, шовный материал и вес животных два раза в день. Слегка сожмите пузырь (дважды в день в течение 7 дней), чтобы избежать инфекции (мочу может быть облачно, кровавый или содержащие какие-либо осадки) мочевыводящих путей в.
  6. Лечить мышей один раз в день с инъекции соляного раствора (2 мл в течение двух дней после операции подкожной инъекции) и антибиотика (гентамицина 0,2 мл; подкожных инъекций) в течение пяти дней после травмы.
  7. Treat мышей для послеоперационной анальгезии с бупренорфина (0,1 мг / кг; два раза в день) в течение 3 дней после травмы.

7. хвостовую вену инъекции клеток

Примечание: В следующем шаге процедура инъекции клеток в хвостовую вену показано. Клетки могут также вводиться с интраспинальное трансплантата с использованием стереотаксической рамы 15-16, или в цистерна 17. Важно учесть, что другие типы клеток могут быть пересажены с помощью этого метода, такие как мезенхимальных стромальных клеток(например, костного мозга мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани, стволовые клетки, клетки амниотической жидкости). Кроме того, другие варианты лечения, такие как наночастицы могут быть введены через хвостовую вену после травмы спинного мозга.

  1. Использование 70% этанола и PBS для очистки иглу перед использованием. Ручка иглу и шприц только с стерильные перчатки.
  2. Ресуспендируют клеток в пробирке и нагрузки 75 мкл клеток в 0,3 мл шприца (29 г иглы и шприца 0,33 см).
  3. Убедитесь, что нет пузырей присутствуют в клеточной суспензии. Держите шприц в горизонтальном положении, чтобы избежать клеток осадка.
  4. Наведите под инфракрасной лампой для расширения вены хвоста.
  5. Возьмите мышь и осторожно потяните его в фиксатор мыши, чтобы визуализировать боковой хвостовой вены в виде узкого синей линии.
  6. Очистите хвост с тампоном, смоченным спиртом. После того, как вена визуализируется, схватить за хвост вену между средним и указательным пальцами левой руки.
  7. Принесите иглу к поверхности на 15 ° угол от горизонта и убедитесь, коническая вверх.
  8. Вводят 50 мкл клеток в размере 0,33 мкл / сек. После инъекции, задержать отвод иглы на 10 сек. Уберите иглу медленно и обратить внимание на возможное оттока клеточной суспензии.
  9. Очистите шприц, как в шаге 7,1 между нагрузками.

8. Поведенческие тесты и задних конечностей Функция

  1. Наведите в открытом поле.
  2. Оценка функции опорно-двигательного и задние восстановление конечностей после контузии с тесте открытого поля по шкале мыши бассо (BMS) 18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При неврологическом функция должна оцениваться периодически, от 3 ​​день после травмы в течение 4 недель 18.

9. перфузии

  1. В конце экспериментального периода, обезболивания животных путем внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (65 мг / кг). Используйте ног щепотки на evaluatе уровень анестезии и перейти только после мышь не отвечает на вредных раздражителей.
  2. Задержите животное в положении лежа на спине на операции плоскости.
  3. Разрезать покровов и брюшной стенки прямо под грудной клеткой. Отделите мембрану из печени.
  4. Используйте ножницы, чтобы вырезать диафрагму выставить в плевральную полость.
  5. не Отрежьте стороны грудной клетки до ключицами.
  6. Используйте кровоостанавливающих, чтобы зажать мечевидного хряща и поместите кровоостанавливающего над головой.
  7. Удерживая нижнюю треть сердце на поперечной плоскости при помощи щипцов. Вставьте иглу в левый желудочек.
  8. Используйте кровоостанавливающего, чтобы зажать сердце. Это обеспечивает иглы и предотвращает утечку.
  9. Используйте ножницы, чтобы вырезать в правое предсердие.
  10. Дайте PBS, чтобы насос (18 мл / мин) через животного. Поддержание это давление в течение всего периода инфузии буфера (3-4 мин; что соответствует примерно 70 мл PBS). Продолжайте, пока сердце не станет чистым.
  11. Переключатель кран, чтобы позволить фиксатора (4% параформальдегида в дистиллированной воде, 4% PFA) через насос. Разрешить 4% PFA прокачивать животного в течение примерно 8-10 мин (300 мл). Постепенно увеличивайте давление, чтобы достичь максимума 30 мл / мин. Закаленные печени лучшим свидетельством успешной перфузии.

10. Ткань Сбор и обработка, гистологии и Iimmunohistochemistry

  1. Проанализируйте спинного мозга T5 в L1. Тогда после фиксации ткани в 6 мл 4% PFA (O / N на 4 ° C).
  2. Поместить той же ткани в растворе с 30% сахарозы в течение 72 ч при 4 ° С для того, чтобы защитить его крио и предотвратить образование кристаллов при замораживании.
  3. Краткое замораживать шнур с использованием сухого льда и хранить его при температуре -80 ° С.
  4. Раздел помощью криостата с 15 толщиной мкм и собирать разделы на стеклах и продолжаться в течение иммуноцитохимии.
  5. Промыть секции с 200 мкл PBS для каждого хLiDE (3 раза; 5 мин каждый, RT).
  6. Проницаемыми каждый слайд с 200 мкл 10% NGS и 0,2% Triton X-100 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
  7. Промыть участки с 200 мкл PBS для каждого слайда (3 раза; 5 мин каждый, RT).
  8. Блок неспецифические сайты с 200 мкл блокирующего раствора для слайд (5% NGS 0,1% Triton X-100 в PBS) в течение 30 мин (RT).
  9. Инкубируют каждый слайд с 200 мкл первичных антител O / N при 4 ° С (разбавленной антитела в 5% NGS; 0,1% Тритон Х-100 в ЗФР).
  10. Промыть секции с 200 мкл PBS для каждого слайда (3 раза; 5 мин каждый; РТ).
  11. Инкубируйте с соответствующими вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.
  12. Промыть секции с 200 мкл PBS для каждого слайда (3 раза; 5 мин каждый; РТ).
  13. Пятно ядра с 200 мкл 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 мкг / мл конечной концентрации 10 мин при комнатной температуре).
  14. Установите с помощью FluorSave Реагент и анализировать с помощью конфокальной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вконтроль определения, первичные антитела должны быть опущены и заменены эквивалентными концентраций несвязанного IgG одного и того же подкласса. Был использован, ассоциированный с микротрубочками белка 2 первичное антитело.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Общее количество трансплантированных клеток 1 × 10 6 клеток и был разделен на три последовательных инъекций в хвостовую вену. Мы вводили 3,3 × 10 5 клеток в 50 мкл фосфатного буферного раствора (PBS). Первую инъекцию проводили в течение 30 мин после травмы, второй 6 ч позже, и наконец 18 ч после повреждения. Выбор срока в 18 часа после ТСМ по управлению PM-НПС определяли по оптимальной проницаемости гематоэнцефалического барьера в это время 14. Для оценки эффекта инъекции стволовых клеток было бы полезно иметь положительный контроль laminectomies животных (N = 14) и PBS вводили животным в качестве отрицательного контроля (N = 14).

PM-НПС улучшить восстановление задних конечностей функции, мигрируют в месте повреждения и дифференцироваться в МАР-2-позитивных клеток

Т9 контузии причиной временной потере функции задних конечностей с последующим прогрессивным гradual восстановления (Рисунок 1). В течение 2-3 недель, PBS-обработанные мышей с повреждением улучшилось, и функция задних конечностей достиг 3 очка BMS (соответствующая подошвенной размещения лапы с поддержкой или без поддержки веса или иногда, часто, или последовательной спинной пошаговом режиме, но не подошвенный активизации 18) , Вместо этого, в том же период наблюдений, ранены мышей, получавших с ПМ-NPC, показали более высокий подъем, достигнув 4,5 баллов БМС (в соответствии с частыми или последовательного подошвенной степпинга без согласования или частой или постоянной подошвенной шагового с некоторой координации). Улучшение поведения было особенно заметно в период между 7 и 14 дни после ТСМ. Никаких признаков аллодинию, как передних конечностей повышенной чувствительностью 19 не были зарегистрированы в любое время и в любой экспериментальной группы в течение периода наблюдений на 30 дней.

Большинство привиты PM-НПС, помечены PKH26 (рис 2), накопленных в по краямПоражение формирования кластеров (рис 3) с первых дней своего управления. Тогда трансплантированные клетки мигрировали вдоль краев поражения и в более рассеянным образом, где они дифференцированного, постепенно при условии асимметричного клеточного конформацию нейронов. В 30 дней после поражения и трансплантации, тело клетки PM-NPC, увеличился в размерах и в большинстве клеток дендритные, как процессы были очевидны и полностью иммуноокрашиванию по специфических антител к MAP-2 (рис 4). Достижение морфологического сложности и позитивность в MAP2 по пересаженной PM-NPC, скорее всего, не из-за слияния с сохранившимися хостов нейронов спинного мозга, что проявляется в их четко отличаться морфологии и отсутствием двух ядер в какой-либо одной меченую клетку.

Рисунок 1
Рисунок 1. PM-НПС улучшить функциональное RECOVERy в пострадавших животных. открытое поле передвижение было тесте использовали для определения восстановления двигательной функции 18. Животные были протестированы день до контузии и набрал 9 очков в шкале BMS. В первый день после травмы в поврежденных животных, оценка BMS снизилась до нуля. Восстановление задней функции конечностей поврежденного мышах показали, замечательную и длительное улучшение, когда животные были обработаны с ПМ-NPC. Анализ проводили в двойном слепом, и каждая группа состояла из 14 животных. Значения представляют среднее ± SEM. Мы определили статистически значимых различий с помощью теста ANOVA с последующим пост-тест Тьюки. *** P <0,001; ** P <0,01 по сравнению с PBS.

Фиг.2
Рисунок 2. PKH26 маркировка PM-NPC. После процедуры маркировки с PKH26, PMNPCS являются VISU ванный с живой микроскопом изображения Evos FL и микрофотография была взята с того же инструмента (масштаб бар = 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Локализация PM-НПС в месте повреждения. PKH26 меченных PM-NPC (красный) присутствуют во всех краях месте повреждения на 30 дней после их внутривенной инъекции. Изображение 1 мыши, но подобные изображения были получены в течение по крайней мере 5 животных (масштаб бар = 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

нагрузка / 52141 / 52141fig4highres.jpg "/>
Рисунок 4. MAP2 выражение в пересаженной PM-NPC. Большинство PKH26-меченого PM-NPC (красный) приобрела нейронов-образную форму с дендритных-подобным процессам и дифференцировались MAP-2-позитивных клеток (зеленый). Ядра окрашиваются в синий (DAPI). Изображение 1 мыши, но подобные изображения были получены в течение по крайней мере 5 животных (масштаб бар = 25 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы описали метод получения воспроизводимых модель травматического повреждения спинного мозга с использованием бесконечного горизонта Impactor в силу 70 Кдыне (тяжелой). Использование большего силы парадигму (80 Kdyně), мы можем вызвать более серьезные травмы, которые, к сожалению, связано с более высокими мышей смертности. Для того чтобы избежать этой проблемы, мы обычно выбирают умеренной силы парадигму (70 Kdyně), который связан с повторяемой поражения с постепенным восстановлением функции и снижению смертности. Для получения такого устойчивого травмы, очень важно уделять особое внимание на правильное фиксации животного на ударного платформы; в частности, спинной мозг должен быть по центру на конце ударного, и две руки ударного должны быть параллельны друг другу. Кроме того, внимание должно быть принято в блокировании животного ударника щипцов, когда позвонков может быть подавлено, и силовой кабель может быть поврежден кончиков щипцов. Позиционирование анимыл после ламинэктомии имеет решающее значение, и обработка животных во время этой процедуры также очень важно. Особое внимание должно быть уделено процедуре ламинэктомии, которые всегда должны быть выполнены в том же месте и тем же расширением. Когда эти процедуры выполняются во время ламинектомии, другой методологический вопрос для мониторинга является снижение риска повреждения кабеля при использовании микро-ножницы, костные кусачки или щипцы, чтобы сократить кости и освободить кабель путем удаления пластинки, чтобы исключить Оставшиеся боковые выступы костей и фрагментов, а для удаления надкостницы. Использование микро-ножницы и костными кусачками с кончиками, направленными вверх уменьшит риск возникновения вышеуказанных проблем.

Важным ограничением этого метода является высокая вероятность того, что животные могут развивать внутренние и внешние жесткие мочевых инфекций в период после травм. Внешний инфекция из-за неспособности поврежденных мышей Мове с задних конечностей веса поддержки. В отличие от этого, внутренний мочевой инфекции могут быть вызваны неспособностью мышей с повреждением к мочеиспусканию самостоятельно. Для того, чтобы избежать этих проблем это абсолютно необходимо, чтобы вводить животных с указанным антибиотика и проверить размер мочевого пузыря два раза в день во время процедур по уходу за животными в течение первой недели. Состояние гидратации и вес должен быть тщательно проверены в течение первых трех недель после lesioning.

Применение описанных процедур, которые мы смогли получить воспроизводимые дефицит функции задних конечностей, которые были вычислены через специфические поведенческие тест, разработанный Бассо и коллег (BMS) 18. Сразу после травмы задних конечностей потери функции завершена, за которым следует постепенное восстановление, что является наиболее важным в течение первых 2-3 недель. Восстановление поведенческих достигли более высокого уровня, когда повреждениями мышей лечили взрослых PM-NPC (рис 1 (рис 3). По нашим оценкам, общее количество жизненно привитого PM-NPC, больше, чем привитые ЭСК и взрослых НСК, как сообщалось ранее нашей исследовательской группы 20-21. В четырех недель после lesioning и трансплантации, большинство PM-НПС имеют большие тела и обладающих продлен дендритные, как процессы, которые полностью иммуноокрашиванию по специфических антител к MAP-2 (рис 4).

Основным преимуществом данной модели травматического повреждения спинного мозга является стандартизация травмы. Воспроизводимая относящиеся ко времени кривая восстановления задних конечностей функции достигается также. Такая повторяемость позволяет определить доказательства правильности принципа исследований для исследованных процедур, включая трансплантацию клеток для регенеративной медицины изучению проблемс с уменьшенным количеством случаев. Кроме того, некоторые аспекты патофизиологии травмы спинного мозга могут быть проанализированы более подробно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют никакого конкурирующие между собой финансовые интересы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26GL-1KT  Sigma 091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device  Precision Systems and Instrumentation, LLC Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml Euroclone ECM0011B 1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml Merial B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer 2Biological Instruments HB101-sm-402
Scalpel, size 10 Lance Paragon 26920
Small Graefe Forceps 2Biological Instruments 11023-14
Rongeur Medicon Instruments 07 60 07
Micro scissors 2Biological Instruments 15000-00
Absorbable sutures (4/0) Safil Quick C0046203
Hemostat 2Biological Instruments 13014-14
Reflex 7 wound clip applicator 2Biological Instruments 12031-07
7 mm Reflex wound clips 2Biological Instruments 12032-07
NGS Euroclone ECS0200D
Triton X 100 Merck Millipore 1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2 Millipore AB5622
Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008
FluorSave Reagent  Calbiochem 345789
Neural stem cells medium DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) 
DMEM-F12 Euroclone ASM5002
l-glutamine Euroclone ECB3000D
glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
putrescine Sigma-Aldrich P5780-25G
progesterone Sigma-Aldrich P6149-1MG
Sodium-selenite Sigma-Aldrich S9133-1MG
transferrin Sigma-Aldrich T 5391
Insulin Sigma-Aldrich I1882
Heparin sodium-salt Sigma-Aldrich H0200000
bFGF Life Technology PHG0024
h-EGF Life Technology PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G Terumo MYJECTOR 
buprenorphine Schering Plough SpA TEMGESIC
eye gel Bausch & Lomb LIPOSIC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
  2. Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
  3. Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
  4. Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
  5. Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
  6. Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
  7. Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
  8. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  9. Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
  10. Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
  11. Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
  12. Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
  13. Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
  14. Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
  15. Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
  16. Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
  17. Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
  18. Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  19. Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
  20. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
  21. Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).

Tags

Медицина выпуск 94 повреждение спинного мозга нервной клетки предшественники трансплантации стволовых клеток инъекции в хвостовую вену клеток поведение животных воспаление
Neural трансплантации стволовых клеток в экспериментальной Contusive модели с повреждением спинного мозга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carelli, S., Giallongo, T., Gerace,… More

Carelli, S., Giallongo, T., Gerace, C., De Angelis, A., Basso, M. D., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (94), e52141, doi:10.3791/52141 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter