Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Omurilik Yaralanması Deneysel Kontuzif Modelinde Sinir Kök Hücre Nakli

Published: December 17, 2014 doi: 10.3791/52141
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Pharmacology, Department of Health Sciences, University of Milan, 2Department of Neuroscience, College of Medicine, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

Omurilik yaralanması ciddi morbidite ve mortalitesi yüksek bir neden travmatik bir durumdur. Bu çalışmada detaylı olarak nöral kök hücrelerin bir nakli ardından farelerde omurilik yaralanması bir kontüzyon modelini tarif.

Abstract

Omurilik yaralanması nörolojik işlev bozukluklarının bir kompleks ile karakterize bir klinik yıkıcı durumdur. Spinal kord yaralanması hayvan modelleri yaralanma biyolojik yanıtları araştırmak ve potansiyel tedavilerin test etmek hem de kullanılabilir. Ameliyatla açığa omuriliğe verilen kontüzyon veya Sıkıştırma yaralanması patoloji en yaygın olarak kullanılan modeldir. Bu raporda deneysel kontüzyon özel yaralanma parametrelerinin tanımı ile bir tekrarlanabilir yaralanma hayvan modelinin oluşturulmasını sağlar Sonsuz Horizon (İH) Darbeli cihazı kullanılarak yapılır. Kök hücre nakli genellikle bu zayıflatıcı durumu kür için bir potansiyel olarak yararlı bir strateji olarak kabul edilir. Çeşitli çalışmalar kök hücre nakli çeşitli etkileri değerlendirilmiştir. Burada CD1 farelerinden hücre kuyruk damarı enjeksiyonu takiben, omurilik yaralanması için adapte edilmiş bir yöntemi göstermektedir. I) hücre etiketleme wi: Kısacası, biz prosedürleri sağlamakhayati izleyicinin inci, ii) farelerin ameliyat öncesi bakım, bir Kontuzif omurilik yaralanması iii) yürütme, ve ölüm sonrası nöral öncüleri iv) intravenöz. Bu çürük modeli rejeneratif tıp yaklaşımı etkinliğini ve kök hücre nakli güvenliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Introduction

Bir omurilik yaralanması (SKY), spor ve şiddet 1, motorlu taşıtlar kaza gibi yüksek enerjili travma nedeniyle en sık yaralanma olduğunu düşer. Şiddetli SCI, yaralanma kuvvet nörolojik fonksiyon ani kaybına neden nöral dokuyu tahrip eder veya zarar. Travmatik SKY yaş 10 ve 40 yaş arası genç erişkinlerde sık görülür. Büyük ölçüde hastanın ruhsal ve fiziksel durumu etkiler ve topluma 2 büyük ekonomik etkisi neden olur. Akut fazda tedavi yaklaşımı genellikle muhtemelen daha fazla zarar 3-4 azaltmak için kortikosteroid, cerrahi stabilizasyon ve dekompresyon yüksek doz sınırlıdır, ancak SKY sonrası lokomotor kurtarma bu yöntemlerin rolleri hala tartışmalıdır. Akut doku kaybı, travmatik yaralanma ve çok sayıda hücre tipinde 5-6 dejenerasyonu neden demiyelinasyon ve ölüm ikincil mekanizmaların harekete ek olarak. fonksiyonun geri derecesi edebilirsinizOn yaralanma yerinde 7 de bağışladı beyaz cevher ölçüde ilişkili.

SCI hayvan modelleri yaralanma dokunun biyolojik yanıtları araştırmak ve potansiyel tedavileri test etmek için de olabilir. Ayrıca, bir insan patolojisinde yararlı bir hayvan modeli sadece bu durum bazı yönlerini üretmek için olan, aynı zamanda doğrudan klinik gözlem ve deney daha fazla avantajlar sağlar gerekir. Spinal kord yaralanması en yaygın kullanılan modeller cerrahi maruz omurilik 8 teslim kontüzyon veya sıkıştırma yaralanma içerir. kontrollü kilo bırak kontüzyon yaralanma gelişimi SKY araştırma tarihinin önemli bir kilometre taşını temsil etmektedir. Ohio State University, omurilik araştırma merkezi bir bilgisayar 9 tarafından kontrol etkisi parametreleri ile omurilik belirli bir sıkıştırma uyarılması için kullanılabilecek bir cihazın teknolojik zorluk izlemiştir. Bu aslında kullanım wi için tasarlanmıştırinci sıçanlar; Daha sonra farelerde 10 doğru uygulamak için modifiye edildi. Bu yaklaşım içinde avantajları yaralanma biyomekanik daha derinlemesine incelenebilir ve yaralanma parametreleri yeniden üretilebilen deneysel bir model elde etmek amacıyla, daha ayrıntılı bir şekilde tarif edilebilir ki, bu nedenle etkilerinin daha hassas olarak değerlendirilmesine imkan veren fonksiyonel iyileşme süreci üzerinde test tedaviler.

Birçok çalışma SKY modellerinde 11 kök hücrelerin çeşitli nakli etkilerini değerlendirdik. Biz son zamanlarda fare donör 12-13 ölümünden sonra Alt-Ventriküler Bölgesi (SVZ) birkaç saat yetişkin nöral kök hücreler izole var. Bu prosedür SCI kür için bir rejeneratif tıp yaklaşımı avantajlı görünmektedir nöral kök hücreler olarak adlandırılan ölüm sonrası nöral öncüleri (PM-NPC), nüfusu sağlar. Bu yazıda ortaya koyacak: i) hayati izleyici PKH26 hücre etiketleme için protokol, ii) edicinik prosedür travmatik omurilik yaralanması gerçekleştirmek ve etiketli hücrelerin iii) intravenöz (iv) idaresi. Ayrıca, bu çalışmada biz nakledilen hücrelerin omurilik lezyon sitelerine göç ve mikrotübül ilişkili protein (MAP) 2 pozitif hücrelerin içine çoğunlukla ayırt olduğunu göstermektedir. Ayrıca, farklılaşma arka bacak fonksiyonunun sabit bir kurtarma teşvik eşlik eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Tüm işlemler Milan Üniversitesi Gözden Geçirme Komitesi tarafından onaylanan ve Avrupa Toplulukları Yönergesi tarihli November 1986 (86/609 / EEC) ile uyumlu Laboratuvar Hayvanları İtalyan Kuralları karşılandı.

Transplantasyon için hücrelerin hazırlanması 1.

NOT: 5. ve bu deneyler için kültür 9. geçit arasında kullanın nöral kök hücreler; Transplantasyon için etiketli önce çoğalması ve farklılaşması yeteneği kültürleri test edin. 12 immünsitokimya ile farklılaşma derecesini belirleyin.

  1. 1 x 10 6 hücre / 150 ul (nakli fare başına 1 x 10 6 hücre) bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse hücreleri. Hücrelerin bir aşırı şırınga yükleme amaçları için gerekli olduğu için, fare başına en az 1,2 x 10 6 hücre hazırlayın.
  2. 10 ml'lik bir konik şişe içinde hücreler, nöral kök hücre ortamı 13 ile 3 kez yıkayın. Her birindeYıkama adımı, santrifüj ile çökelti hücreleri (500 x g 5 dakika, RT).
  3. Son sıkma önce hücreleri saymak.
  4. Hücrelerinin (5 dakika için 500 x g) santrifüj ve daha sonra herhangi bir hücrelerin çıkarılması için dikkatli olmak ancak yüzer en fazla 25 ul bırakarak süpernatan aspire.
  5. Hafif pipetle hücre peleti tekrar süspansiyon seyreltici C 1 ml ilave etmek suretiyle bir 2 x hücre süspansiyonu hazırlanır.
  6. Bir tüp içinde Seyreltici C 1 ml PKH26 etanol boya çözeltisi 4 ul ekleyerek Seyreltici C - (6 M, 4 x 10) ve dağıtmak için iyice karıştırın hemen boyama önce, 2x boya çözeltisi hazırlanır.
  7. Hızla 2x Boya çözeltisi, 1 ml 2x hücre süspansiyonu 1 ml ilave edilir ve hemen (mi, 1.2 x 10 7 hücre / ve 2 x 10 olacak nihai hücre yoğunluğu - 6M PKH26) pipetleme örnek karıştırın.
  8. 1-5 dakika boyunca hücre / boya süspansiyonu inkübe edin.
  9. (Eşit hacmi eklenerek 2 boyama durdurunmi) HBSS içinde% 1 BSA çözeltisi ile 1 dakika boyunca inkübe edin.
  10. Santrifüj hücreleri (500 xg az 10 için) ve dikkatle süpernatant kaldırmak.
  11. HBSS ve santrifüj (5 dakika için 500 x g), 10 ml içinde süspanse hücre topağı.
  12. Serbest boyanın temizlenmesi için tam ortam, 10 ml hücre pelletini 2 kez daha yıkanır.
  13. Hücre kurtarma, hücre canlılığı ve floresan yoğunluğu değerlendirmesi için tam ortam, 10 ml hücre pelletini. Hücre transplantasyonu için gerekli olan ise, yıkama ve 3.3 x 10 5 hücre / 50 ul bir konsantrasyonda bir steril fizyolojik çözelti içinde tekrar süspansiyon haline getirin.

Cerrahi için 2. Hazırlık

  1. Temiz ve sterilize cerrahi cihaz.
  2. Aseptik madde ile silerek cerrahi alanını hazırlayın. IH Darbeli aygıtını kurun.
  3. Anestezi ekipmanı hazırlayın: VetScav Filtre, sürekli akış İndüksiyon Odası, Oksijen Gen Cihazı Tartı ile Aktif Gaz Çöpçüesyasi, Fareler Düşük Akış O 2 Metre. Indüksiyon odasına ve ameliyat sırasında kullanılan maske temizleyin.
  4. % 2.5 oksijen (h / h) izofluran (1 l / dk) hayvanlara anestezi ve ilaç etkili olması için akış indüksiyondan sonra 5 dakika bekleyin. Bıyıkları seğirmesi olup olmadığını kontrol edin veya Kapkaççı kısma yanıt yavaş arka bacak çekme varsa. Ameliyat sırasında,% 2.0 oksijen (h / h) izofluran (1 l / dk) izofluran konsantrasyonu azaltır.

Cerrahi ve Transplantasyon için Fareler 3. Hazırlık

  1. Standart koşullarda deneyler (22 ± 2 ° C,% 65 nem ve 8:00-8:00 arasında yapay ışık) önce en az 3 gün boyunca erkek yetişkin CD1 fareler (25-30 gr) tutun.
    NOT: sütür cerrahi hazırlık tüm prosedür yaklaşık 40 dakika sürer.
    1. Hayvan belirlemek için, su geçirmez, renkli mürekkep ile kuyruk işaretleyin.
  2. Bir Electr kullanınic kesme bel bölgesine, yaklaşık T2 düzeyinde, boyun fare dorsal saç kesmek için.
  3. Iyodür çözeltisi ve etanol (steril su içinde% 70) ile hazırlanmış alan sterilize edin.
  4. Bir 200 alt deri (sc) enjeksiyon ul gentamisin (steril tuzlu su çözeltisi içinde, 1 mg / ml) ile bir hayvan tedavi edin.
  5. Buprenorfin kurumasını önlemek ve enjekte etmek için, her iki hayvan gözlere oftalmik yağlayıcı (deri altından, 0,03 mg / kg), ağrının hafifletilmesi için.

4. Laminektomi

  1. Ameliyat sırasında hipotermi sorunu önlemek için sıcak bir slayt üzerinde fare yerleştirin. Dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin hayvan.
  2. T7'nin T12 ilgi bölge üzerinde bir neşter, dikey bir kesi yapmak.
  3. (Genellikle göğüs sırt süreçleri inci 5 inci ve 6 arasındaki boşlukta bulunan) standart forseps kullanarak cilt ve yüzeyel yağ yastığı tutun.
  4. T6 olarak teknenin altında işlem Sayısısonra T7 taşımak.
  5. Omurganın eğrilik artırmak için fare ventral tarafında biraz altında yatağı yerleştirin. Graefe forseps ile bloke ederek omurilik hareketsiz.
  6. Lamina temas neşter ucu dorsal yüzeyine kadar neşter kullanılarak T7 ve T10 vertebra seviyesinden bilateral paravertebral kaslar kesin.
  7. T10 kadar T7'nin kavşak kapalı kene neşter kullanın. T8 ve T9 dikenli çıkıntılar arasındaki boşlukta durdurun. Mikro makas ile T8-T9 T9-T10 arasındaki dokuları kesin.
    1. T9 sürecini kaldırmak için Rongeur kullanın. Dikkatle mikro makas ile kas tabakası kazınarak ile kavşak Açığa. Kemik maruz kadar devam edin.
  8. Lamina kasları kaldırmak ve omurlar arasındaki küçük bir boşluk açmak için forseps kullanın. Yavaşça, kemik altında mikro makas eklemek her iki tarafta lamina kesmek ve forseps ile bu kısmını kaldırın.
  9. F lamina kaldırorceps kablosunu ortaya çıkarmak. Arkasında herhangi bir ücretsiz veya pürüzlü kemik parçaları bırakmamaya emin olun; Rongeur ile bunları kaldırmak.
  10. Kesi yakın olabilecek periost yanı sıra herhangi bir kemik parçaları veya kasları kaldırmak için küçük bir ipucu forseps kullanın.
  11. T9 dorsal sürecinin üst yarısını çıkarın ve IH Darbeli cihaz protokolüne devam edin.

5. IH Darbeli Cihaz Protokolü (Kontüzyon)

  1. IH Darbeli cihazın istikrar platformu ortasında fare yerleştirin.
  2. İki ortak konumlandırma kollarından stabilizasyon platformu ile bağlanmış iki diş forseps ile hayvan (torakal vertebra için sol kol, servikal vertebra için sağ kolu) engelleyin.
  3. Rostralinde vertebra gövdesinin (T8) yanal kenarını kavramak rostralinde kol kullanın.
  4. T10 vertebra vücudu kavramak için aynı şekilde kaudal kolunu işleyin.
  5. Ucu cihazın istikrar platformu yerleştirin ve alt (çap 0.75mm) dokunmadan mümkün olduğunca kord kadar yakın.
  6. Etkisini başlatmadan önce uca üç tam döner kaldırın.
  7. 100 mm / sn 60 kdyn bir kuvvet verecek şekilde ayarlandı impactor ile ezilme gerçekleştirin.

6. Dikişler ve Post-bakım

  1. Bir 4/0 emilebilir dikiş ipliğinin ile kesi sütür. Kaldırıldı lamina yerinde maruz omurilik Kapak; küçük bir iğne vasıtasıyla kesme uçlarında doku dikiş. Hemen yukarıda ve spinal kord maruz sitenin altında iki dikiş koyun.
  2. Altta yatan kasları kapalı kısma olmadan iki veya üç Refleks klipleri kullanarak cilt kapatın.
  3. Alt sırt enjekte tuzlu su çözeltisi, deri altından 2 ml fare ameliyat sonrasında hidratı.
  4. Cerrahi kurtarma sırasında hipotermi önlemek için geri önceden ısıtılmış kafeste fare yerleştirin. Isıtma pedleri yerleştirin kafesleri.
  5. Kontrol ederek akut faz sonrası yaralanma sırasında fareler Monitörboyut mesane, dikiş ve hayvan ağırlığı günde iki kez. Yavaşça (kanlı, bulutlu ya da herhangi içeren çökeltilerin olabilir idrar) idrar yolu enfeksiyonları önlemek için en mesane (7 gün boyunca günde iki kez) sıkın.
  6. Ve antibiyotik (iki gün ameliyat sonrası sc enjeksiyonu için 2 ml) içinde bir tuzlu su çözeltisi enjeksiyon ile günde bir kez fareler tedavi (gentamisin 0.2 mi; deri altından enjeksiyon), beş gün boyunca yaralanma sonrası.
  7. Buprenorfin ile ameliyat sonrası analjezi için fareler tedavi (0.1 mg / kg, günde iki kez), 3 gün boyunca yaralanma sonrası.

Hücreler 7. kuyruk damarından

Not: Bir sonraki adımda kuyruk venine hücreleri enjekte edilmesi için prosedür gösterilmektedir. Hücreler ayrıca, bir stereotaksik çerçeve 15-16 kullanarak, intraspinal nakli ile birlikte uygulanabilir, veya cisterna magna 17 içine edilebilir. Bu diğer hücre tipleri, mezenkimal stromal hücreleri gibi, bu yöntemle nakledilen olabilir dikkate alınması önemlidir(Örneğin, kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, yağ kaynaklı kök hücreler, amniyotik sıvı hücreler). Ayrıca, bu tür nanoparçacıklar gibi diğer tedavi yöntemleri, omurilik yaralanması sonrası kuyruk damarından enjekte edilebilir.

  1. Kullanmadan önce iğne temizlemek için% 70 etanol ve PBS kullanın. Iğne ve sadece steril eldiven ile şırınga tutun.
  2. 0.3 ml şırınga (29 G iğne ve 0.33 cc şırınga) içine deney tüpü ve yük hücreleri 75 ul hücrelerin tekrar.
  3. Kabarcıklar hücre süspansiyonu içinde mevcut olduğundan emin olun. Hücre sedimantasyon önlemek için yatay bir pozisyonda şırınga tutun.
  4. Kuyruk damarları genişletmek için ısı lambası altında fare yerleştirin.
  5. Dar mavi hat olarak yanal kuyruk damarı görselleştirmek için fare süzgeç içine yavaşça çekin fareyi tut ve.
  6. Alkollü bir bezle temizleyin kuyruk. Ven görüntülenmiştir sonra, sol elin orta parmağı ve başparmak arasında kuyruk ven kapmak.
  7. Ufukta bir 15 ° açıyla yüzeye iğneyi getirin ve konik kadar olduğundan emin olun.
  8. 0,33 ul / sn bir hızda hücrelere 50 ul enjekte edilir. Enjeksiyon sonrası, 10 saniye ile iğne geri çekilmesini geciktirmek. Yavaş yavaş iğne geri çekin ve hücre süspansiyonu olası efflux dikkat.
  9. Yükler arasındaki adım 7.1 olarak şırınga temizleyin.

8. Davranış Testleri ve Hind Ekstremite Fonksiyon

  1. Açık alanda fare yerleştirin.
  2. Basso fare ölçeği (BMS) 18 göre açık alan testi ile kontüzyon sonrası lokomotor fonksiyonunu ve arka bacak kurtarma değerlendirin.
    Not: nörolojik fonksiyon 4 hafta 18 yaralanma sonrası gün 3, periyodik olarak değerlendirmek gerekir.

9. Perfüzyon

  1. Deneysel periyodun sonunda, sodyum pentobarbital intraperitonal enjeksiyonu (65 mg / kg) ile hayvanlar anestetize. Değerlendirme, için ayak Kıstırmaları kullanıne anestezi düzeyi fare zararlı uyaranlara tepkisiz sadece sonra devam ve.
  2. Bir ameliyat uçakta bir yatar pozisyonda hayvan kısıtlamaktadır.
  3. Sadece göğüs kafesinin altında integument ve karın duvarı kesti. Karaciğerden diyaframı ayırın.
  4. Plevra boşluğu ortaya çıkarmak için diyaframı kesmek için makas kullanın.
  5. Yaka kemikler kadar göğüs kafesinin kenarlarını kesin.
  6. Kılıç şeklinde kıkırdak kelepçe ve başının üzerinde hemostat yerleştirmek için hemostat kullanın.
  7. Forseps ile bir çapraz uçakta kalp alt üçte tutun. Sol ventrikül içine iğne takın.
  8. Kalp kelepçe bir hemostat kullanın. Bu iğneyi sabitleyen ve sızıntıyı önler.
  9. Sağ atrium kesmek için makas kullanın.
  10. PBS hayvan ile (18 ml / dk) pompa izin verin. (Yaklaşık 70 ml PBS karşılık gelen 3-4 dakika) tampon infüzyon süresince bu basıncı koruyun. Kalp temiz olana kadar devam edin.
  11. Pompa boyunca tespit edici (distile su içinde% 4 paraformaldehid,% 4 PFA) izin vermek için musluğunu geçin. % 4 PFA yaklaşık 8-10 dakika boyunca (300 mi) hayvan pompalanması izin verin. Yavaş yavaş / dakika, 30 ml 'lik bir maksimum ulaşmak için basınç artar. Bir sertleştirilmiş karaciğer başarılı bir perfüzyon iyi göstergesidir.

10. Doku Toplama ve İşleme, Histoloji ve Iimmunohistochemistry

  1. T5 gelen L1 spinal kablolarını parçalara ayır. Sonra (4 ° C'de O / N)% 4 PFA 6 ml doku sonrası düzeltmek.
  2. Kriyo koruma ve donma sırasında kristallerin oluşumunu önlemek için, 4 ° C'de 72 saat boyunca% 30 sukroz ile bir çözelti içinde, aynı doku koyun.
  3. Hızlı kuru buz kullanarak kablosunu dondurma ve -80 ° C'de saklayın.
  4. 15 um kalınlığa sahip bir kriyostat ile bölüm ve cam slaytlar üzerine bölümleri toplamak ve bağışıklık devam eder.
  5. Her saniye için 200 ul PBS ile bölümleri durulayınhalojenür ile (3 kez, her biri 5 dakika, OS).
  6. 200,% 10 NGS ul ve oda sıcaklığında 1 saat için PBS içinde% 0.2 Triton X-100 ile her bir slayt geçirgenliği.
  7. Her bir sürgü için 200 ul PBS (, 5 dakika her biri, OS 3 kez) bölümleri durulayın.
  8. (PBS içinde% 0.1 Triton X-100,% 5 NGS), 30 dakika (RT) slaytın bloklama çözeltisi 200 ul spesifik olmayan sitesi bloke eder.
  9. 4 ° C 'de O / N birincil antikor, 200 ul her bir slayt inkübe (% 5 NGS antikor seyreltik, PBS içinde% 0.1 Triton X-100).
  10. Her bir sürgü için 200 ul PBS ile yıkayın bölümleri ile (3 kez, her biri 5 dakika, RT) yapıldı.
  11. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile, uygun sekonder antikor ile inkübe edin.
  12. Her bir sürgü için 200 ul PBS ile yıkayın bölümleri ile (3 kez, her biri 5 dakika, RT) yapıldı.
  13. 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (ug / ml nihai konsantrasyon 1 ug, oda sıcaklığında 10 dakika), 200 ul Leke çekirdekleri.
  14. FluorSave Reaktif kullanarak monte ve konfokal mikroskobu ile analiz.
    NOT: InKontrol belirlemeleri, birincil antikorlar çıkarılır ve aynı alt sınıfın olmayan IgG konsantrasyonuna denk konsantrasyonlar ile değiştirilmesi gerekir. Mikrotübüle bağlı protein 2 birincil antikor kullanıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

nakledilen hücrelerin toplam sayısı 1 x 10 6 hücre olup, kuyruk damarından birbirini takip eden üç enjeksiyon bölündü. Bu fosfat tampon çözeltisi içinde 50 ul (PBS) içinde 3.3 x 10 5 hücre tatbik. İlk enjeksiyon ikinci 6 saat sonra, yaralanma sonrası 30 dakika içinde yapılan ve lezyon sonrası son 18 saat oldu. AM-NPC uygulanması için omurilik yaralanması sonrasında 18 saatlik bir süre seçimi şu anda 14 ile kan-beyin bariyerinin geçirgenliğinin en iyi belirlenmiştir. Kök hücreler enjekte etkisini değerlendirmek için pozitif kontrol laminektomi hayvanlar için yararlı olacaktır (n = 14) ve PBS bir negatif kontrol (n = 14) olarak hayvanları enjekte.

PM-NPC, Hind Ekstremite Fonksiyon Kurtarma geliştirin lezyon yerinde göç ve MAP-2 pozitif hücrelerin ayırt

T9 kontüzyonu ilerici g ardından arka bacak fonksiyonu geçici kaybına nedenradual kurtarma (Şekil 1). 2-3 hafta içinde, PBS ile tedavi yaralı fareler geliştirilmiş ve arka bacak fonksiyonu BMS (veya ağırlık destek veya ara sıra sık sık, ya da tutarlı dorsal atlama olmadan pençe plantar yerleştirmek için gelen, ancak plantar 18 adım değil) 3 puana ulaştı . Bunun yerine, aynı gözlemsel süre içinde, PM-NPC ile tedavi yaralı fareler (koordinasyon, ya da bazı koordinasyon ile adım sık ya da tutarlı plantar olmadan sık sık ya da tutarlı plantar atlama tekabül) BMS 4,5 puan ulaşan, daha yüksek bir iyileşme gösterdi. davranışsal gelişme SKY gün sonra 7 ve 14 gün arasındaki dönemde özellikle belirgindir. Allodini gibi ön ayakları hiper duyarlılığın 19 belirtisi yok 30 gün gözlemsel dönemi boyunca herhangi bir deney grubunda herhangi bir zamanda kaydedildi.

Kenarlarında biriken PKH26 (Şekil 2) ile etiketli En engrafted PM-NPC,lezyon kümeleri oluşturan kendi yönetiminin ilk günlerinden itibaren (Şekil 3). Sonra nakledilen hücrelerin lezyon kenarları boyunca ve yavaş yavaş nöronların asimetrik hücresel yapısını varsayarak, farklılaşmış bir daha dağınık bir şekilde göç. Lezyon ve transplantasyon sonrası 30 gün, PM-NPC'ler hücre vücut büyüklüğü artmış ve hücrelerin çoğunda dendritik-benzeri süreçler açık ve tamamen (Şekil 4)-2 MAP özel antikorlar tarafından immunohistokimyasal. morfolojik karmaşıklık başarı ve nakledilen PM-NPC'lerin map2 için pozitifliği olasılıkla onların açıkça farklılaşmış morfolojisi ve herhangi bir tek etiketli hücrede iki çekirdeklerin yokluğunda açıktır ev sahibi omurilik nöronlar, hayatta füzyon bağlı değildir.

Şekil 1,
Şekil 1. PM-NPC fonksiyonel Recov geliştirmekYaralanan hayvanlarda ery. açık alan lokomosyon motor fonksiyon kurtarma 18 belirlenmesi için kullanılan bir test oldu. Hayvanlar kontüzyon gün önce test edilmiş ve BMS ölçeğinde 9 sayı edildi. Lezyonlu hayvanlarda ilk gün sonrası yaralanma üzerinde, BMS skoru sıfıra düşmüştür. Hayvanlar PM-NPC ile tedavi edildikleri zaman lezyonlu farelerin arka bacak fonksiyonunun geri kazanılması; dikkat çekici ve uzun süreli bir iyileşme göstermiştir. Analiz çift kör yapıldı ve her grup 14 hayvan oluşmuştur. Değerler ortalama ± SEM temsil eder. Biz Tukey post-testi ile takip ANOVA testiyle istatistiksel farklılık tespit. *** P <0.001; ** PBS vs p <0.01.

Şekil 2,
Şekil 2. PM-NPC PKH26 etiketleme. PKH26 ile etiketleme prosedürü sonra, PMNPCS visu vardır Canlı görüntü mikroskop ile fl Evos alized ve fotomikrograf aynı enstrüman (ölçek çubuğu = 50 mikron) ile alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Lezyon yerinde PM-NPC Şekil 3. Yerelleştirme. PKH26-etiketli PM-NPC (kırmızı) kendi iv enjeksiyonundan sonra 30 gün lezyon yerinde kenarları boyunca mevcuttur. Görüntü 1 fare temsilcisi olduğunu, ancak benzer görüntüler en az 5 hayvan (ölçek çubuğu = 50 mikron) için elde edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

yük / 52.141 / 52141fig4highres.jpg "/>
Nakledilen PM-NPC. En PKH26-etiketli PM-NPC (kırmızı) Şekil 4. MAP2 ifade dendritik-benzeri işlemler ile bir nöronal-benzeri şekil edinilen ve MAP-2 pozitif hücreler (yeşil) ayırt etmişti. Çekirdekler mavi (DAPI) olarak lekeli. Görüntü 1 fare temsilcisi olduğunu, ancak benzer görüntüler en az 5 hayvan (ölçek çubuğu = 25 mikron) için elde edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda (şiddetli) 70 Kdyne bir kuvvet bir Sonsuz Impactor ile travmatik omurilik yaralanması tekrarlanabilir bir model elde etmek için bir yöntem tarif. Daha büyük bir kuvvet paradigma (80 Kdyne) kullanarak, maalesef yüksek fareler mortalite ile ilişkili bir daha ciddi yaralanmalara neden olabilir. Bu sorunu önlemek için, biz bunlara fonksiyonu ve alt mortalite kademeli toparlanma ile tekrarlanabilir lezyon ilişkili bir orta kuvvet paradigma (70 Kdyne) seçin. Bu darbe platformda hayvanın doğru tespit özellikle dikkat etmek çok önemlidir böyle istikrarlı bir yaralanma üretmek için; özellikle omurilik darbe ucunda ortalanmalıdır, ve çarpan iki kolu birbirine paralel olması gerekir. Ayrıca, dikkat vertebra ezilmiş olabilir ve kord forseps ipuçları zarar olabilir zaman, darbe forseps ile hayvan engelleme alınmalıdır. anima konumlandırmalaminektomi sonrası l kritik ve bu işlem sırasında hayvan işleme de çok önemlidir. Özel ilgi de her zaman aynı yerde, aynı uzatma gerçekleştirilmelidir laminektomi prosedüre verilmelidir. Bu işlemler sırasında laminektomi yapıldığında, izlemek için başka bir metodolojik konu kemikleri kesmek ve lamina kaldırılması yoluyla kablosunu ücretsiz, Rongeur mikro-makas kullanılarak, ya da forseps zaman kabloya zarar riskinin azalması, ortadan kaldırmak için Lateral kemik çıkıntıları ve fragmanlarını kalan ve periost kaldırmak için. yukarı bakacak ipuçları ile mikro-makas ve Rongeur kullanımı yukarıda bahsedilen sorunları karşılaşma riskini azaltacaktır.

Bu yöntemin önemli bir sınırlama hayvanlar sonrası yaralanma dönemde iç ve dış şiddetli üriner enfeksiyonlar gelişebilir yüksek olasılık olduğunu. Dış enfeksiyon mo için lezyonlu farelerin yetersizlik nedeniylearka bacak ağırlık desteği ile A.Ş.. Buna karşılık, iç idrar yolu enfeksiyonu, bağımsız bir idrar yaralı farelerin yetersizlik neden olabilir. Bu belirtilen antibiyotik hayvanları enjekte etmek kesinlikle gerekli olan bu sorunları önlemek için ilk hafta hayvan bakım işlemleri sırasında bir günde iki kez mesane boyutunu kontrol etmek için. hidrasyon durumu ve kilo Lezyonlamadan sonraki ilk üç hafta boyunca dikkatlice kontrol edilmelidir.

Biz Basso ve arkadaşları (BMS) 18 tarafından geliştirilen özel bir davranış testi ile değerlendirildi arka bacak fonksiyonu tekrarlanabilir açıklarının elde başardık açıklanan prosedürleri uygulamak. Hemen yaralanma sonrası fonksiyon arka bacak kaybı ilk 2-3 hafta boyunca en önemli kademeli toparlanma takip edildiği, tamamlandı. lezyonlu farelerin, yetişkin PM-NPC (Şekil 1 ile tedavi edildiğinde davranış iyileşme daha yüksek bir seviyeye ulaşmıştır (Şekil 3) kenarlarında konfokal mikroskobu ile PKH26 pozitif PM-NPC tespit edildi. Biz hayati aşılı PM-NPC toplam sayısı olarak önceden araştırma grubunun 20-21 tarafından bildirilen aşılı EKH ve yetişkin NSC'lerde daha büyük olduğu tahmin. Lezyon ve transplantasyon sonrası dört haftada, çoğu PM-NPC büyük vücutlara sahip ve tamamen (Şekil 4)-2 MAP özel antikorlar tarafından immunosteyn dendritik-benzeri süreçleri genişletilmiş sahiptirler.

Travmatik spinal kord yaralanması, bu modelin en büyük avantajı yaralanma standardizasyon. Fonksiyonun arka bacak iyileşme bir tekrarlanabilir zamana bağlı eğrisi elde edilir. Böyle tekrarlanabilirlik rejeneratif tıp STUDIE için hücrelerin nakli dahil incelenmiştir tedaviler için proof-of-prensibi çalışmalar tanımlamak mümkün kılardurumda azaltılmış bir sayısı ile s. Buna ek olarak, omurilik yaralanması patofizyolojisinde çeşitli yönleri daha detaylı olarak analiz edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi beyan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26GL-1KT  Sigma 091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device  Precision Systems and Instrumentation, LLC Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml Euroclone ECM0011B 1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml Merial B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer 2Biological Instruments HB101-sm-402
Scalpel, size 10 Lance Paragon 26920
Small Graefe Forceps 2Biological Instruments 11023-14
Rongeur Medicon Instruments 07 60 07
Micro scissors 2Biological Instruments 15000-00
Absorbable sutures (4/0) Safil Quick C0046203
Hemostat 2Biological Instruments 13014-14
Reflex 7 wound clip applicator 2Biological Instruments 12031-07
7 mm Reflex wound clips 2Biological Instruments 12032-07
NGS Euroclone ECS0200D
Triton X 100 Merck Millipore 1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2 Millipore AB5622
Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008
FluorSave Reagent  Calbiochem 345789
Neural stem cells medium DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) 
DMEM-F12 Euroclone ASM5002
l-glutamine Euroclone ECB3000D
glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
putrescine Sigma-Aldrich P5780-25G
progesterone Sigma-Aldrich P6149-1MG
Sodium-selenite Sigma-Aldrich S9133-1MG
transferrin Sigma-Aldrich T 5391
Insulin Sigma-Aldrich I1882
Heparin sodium-salt Sigma-Aldrich H0200000
bFGF Life Technology PHG0024
h-EGF Life Technology PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G Terumo MYJECTOR 
buprenorphine Schering Plough SpA TEMGESIC
eye gel Bausch & Lomb LIPOSIC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
  2. Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
  3. Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
  4. Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
  5. Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
  6. Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
  7. Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
  8. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  9. Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
  10. Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
  11. Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
  12. Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
  13. Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
  14. Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
  15. Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
  16. Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
  17. Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
  18. Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  19. Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
  20. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
  21. Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).

Tags

Tıp Sayı 94 Omurilik yaralanması sinir hücreleri öncüleri kök hücreler nakli kuyruk ven hücre enjeksiyonu hayvan davranışı inflamasyon
Omurilik Yaralanması Deneysel Kontuzif Modelinde Sinir Kök Hücre Nakli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carelli, S., Giallongo, T., Gerace,… More

Carelli, S., Giallongo, T., Gerace, C., De Angelis, A., Basso, M. D., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (94), e52141, doi:10.3791/52141 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter