Abstract
脊髄運動ニューロンの完全性に影響を及ぼす疾患は、最も衰弱性の神経学的状態の間です。過去数十年にわたり、これらの神経筋障害のいくつかの動物モデルの開発は、これらの条件の進行を遅延または逆転を狙っ異なる治療シナリオを科学コミュニティを提供しています。ニューロンの逆行性機構を利用することにより、これらのアプローチの一つは、脊髄運動ニューロンに対応するシャトル治療遺伝子のために、骨格筋を標的とするようになっています。一度有望が、このような遺伝子送達アプローチの成功は、これまでに得示した形質導入運動ニューロンのサブ最適数によって妨げられてきました。運動終板（のMEP）は、運動ニューロンα脊髄へ直接シナプス接触している骨格筋で高度に専門領域です。この点において、それは、これまで、努力は逆行することに注意することが重要です運動ニューロンへの転送遺伝子は、対象となる筋肉のMEP領域の位置を参照することなく行われました。ここでは、単純なプロトコル1）骨格筋の表面上のMEPの正確な位置を明らかにし、2）運動ニューロンへの筋肉内送達および逆行性トレーサーのその後の最適な逆行性輸送を案内するために、この情報を使用することが記載されています。我々は、欧州議会議員のターゲティングを介して脊髄運動ニューロンへの治療遺伝子の逆行性輸送を調査へのさらなる研究において、これらのトレース実験からの結果を利用したいと考えています。
Introduction
このような運動ニューロン疾患などの神経学的状態から生じる随意運動の制御の喪失とspinal-ならびにデュシェンヌ型筋萎縮症は、罹患者の毎日の生活に高く、長期的な影響を与える衰弱状態です。過去10年間、停止または少なくともこれらの神経筋疾患の有害な影響を遅らせることを目指して研究努力は、世界中の多くの臨床医と科学者のための優先事項となっています。この点で、これらの神経筋疾患を模倣する動物モデルの最近の発生は、これらの条件1-13の発生および進行の根底にある生理学的メカニズムに基本的な洞察を得ることに尽力されています。これらの神経筋疾患の治療は、脊髄への直接アクセスを必要とし、脊髄注射14,15によって達成することができます。遺伝子治療の最近の進歩は、上部の横紋筋肉を標的としていると脊髄1,9-13の前角内に配置され、対応するα運動ニューロンへのシャトル治療遺伝子に下肢。しかし、このかつて有望な戦略は、これらの神経学的状態の結果を改善するために失敗しました。それは、これらの予後不良があり得ることを結論する公正であるが、少なくとも部分的に、これらの保護の遺伝子の低い有効性に起因する、1は、これらの遺伝子送達方法の低い有効性を除外することはできません。
モーターエンドプレート（議員）は、α運動ニューロンから発信大きな末梢運動線維の軸索末端でインデントされた骨格筋線維の専門領域です。一緒に、末梢神経線維終末とのMEPは、神経筋接合部、 すなわち 、シナプスインパルスは、神経伝達物質の順行性遊離、アセチルコリンによってトリガーされる部位を形成します。重要なことは、末梢神経線維とのMEPとの関係は、二DIRECです的な、別のモータが離れてニューロン細胞体16-18から向かってだけでなく、分子や細胞小器官の輸送に関与しているが。これらの解剖学的考慮事項に照らして、MEPが対応する運動ニューロンへの送達および遺伝物質のその後の逆行性輸送のための選択の標的であることが表示されます。この文脈では、運動ニューロンの形質導入の成功は非常にウイルスベクターおよび筋肉の19-20のMEPの筋肉内注射との間の距離に依存することは驚くべきことではありません。しかし、驚くべきことに、実験用ラットとマウスの筋線維のMEPゾーンの正確な位置は、選択の2種が神経筋疾患をモデル化するために、最近まで利用できませんでした。
我々は、ラットおよびマウス21-22でいくつかの前肢の筋肉のためのMEP領域の総合的なマップを生成しています。最近では、我々はMEP rの組織の詳細を示していますマウス後肢23のいくつかの筋肉のためのegion、我々は現在、ラットの後肢上のMEPの特徴を分析しています。私たちの手では、これらの筋肉全体MEPゾーンに向かう逆行性トレーサーの筋肉内注射は、以前に報告されたよりも多くの脊髄セグメントをスパニングしている以上の標識運動ニューロンを生じさせました。ここでは、外部表面上のMEPの位置だけでなく、マウスおよびラットの両方における後肢と前肢の筋肉の深さ全体を明らかにするために、ここ数年にわたって開発されたプロトコルを提示します。
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Protocol
ここで説明する全ての実験手順は、UNSWオーストラリアの動物実験倫理委員会を遵守し、国民健康と動物実験のための医学研究評議会、オーストラリアの規制に準拠して実施しました。このプロトコルのすべての手順は、関連する動物実験倫理委員会の要求に応じて行われるべきです。
1.アセチルコリンエステラーゼ組織化学染色
- アセチルコリンエステラーゼの反応液を調製
- 0.1Mリン酸緩衝液（PB）200mlにアセチルチオコリンヨージド290mgの追加。 900 rpmで磁気攪拌機で混合します。
- 連続的に攪拌しながら、グリシン600mgのを追加します。
- 生成物が完全に溶解するまでゆっくりと連続的に攪拌しながら反応混合物に硫酸銅の420ミリグラムを加えます。
- 動物の死体の皮膚を削除切開を行うことで、（組織の共有を介して得られます）灌流ラットまたはマウスの皮膚へ、首の領域から肌を把握し、その足を過ぎてそれを引っ張ります。各筋肉を覆う筋膜が除去されたか、大幅に反応液に筋線維の十分な曝露を確実にするために穿孔のいずれかであることを確認してください。
- 反応混合物に関心の全体または手足を浸し、4℃でO / Nインキュベート。
- 蒸留水で2分間の死体を洗ってください。注：この段階では、筋肉は、青色の着色を示し、運動終板（のMEP）が白い点として見ることができます。
- 3-5秒間10％の硫化アンモニウム溶液に死体を公開します。
注：筋線維は、急速に褐色に変わり、MEPが黒い斑点ドットとして観察可能になります。反応があまりにも急速に発生し、筋線維が議員と筋線維を区別するために暗すぎる染色されている場合は硫化アンモニウム溶液（ 例えば 5％）のより低い濃度を使用してみてください。反応時間は、取得します議員と筋線維の間の最適なコントラストは、一つのサンプルから他に変化します。したがって、試薬に正確な露光時間を規定することは困難です。コントラストが十分なものとみなされたときの反応は、厳密に監視して停止する必要があります。 - 蒸留水に攪拌しながら、カーカスを2回洗浄し、穏やかにカーカスドライバッチリ。
- 関心のあるすべての筋肉のためのMEPが捕捉されることを保証する写真四肢の両側と内側側面、。
2.筋肉内注射モーターエンドプレートで
- マイクロピペットプラーとガラスマイクロピペットを引き出します（プランジャとの傾斜マイクロピペットの使用を推奨します）。解剖顕微鏡の助けを借りて、マイクロピペットの内腔の内径は約0.5mmであるように、ピンセットでマイクロピペットの先端を破ります。
- 使用されているすべての手術器具は、新たにオートクレーブ処理されていることを確認し、目手術領域で無菌です。
- フルオロゴールド（蒸留水中5％）でマイクロピペットを埋めます。
- イソフルオラン（O 2中4％）で誘導チャンバ内に動物において麻酔をかけるを誘導します。立ち直り反射を確認し、導入室から取り出す前に、その不在を確認してください。ラットの鼻の上にノーズコーンを固定し、麻酔の維持のためにイソフルオラン（O 2中2％）を提供します。動物の足指をつまむ、ゆっくりペダルの撤退と角膜反射の両方が存在しないことを保証するために、動物の眼に触れます。注：ケタミンおよびxylazilの混合物も使用することができる（80および10mg / kgでそれぞれ、腹腔内送達）。ケタミンは、スケジュール8（「制御」）は、薬物とに接着する必要があります薬の購入、使用、保管、廃棄に関連する必要なプロトコルです。
- 手順の過程で目の乾燥を防ぐために、眼の潤滑剤を適用します。
- Tを剃りますargeted手足三クロルヘキシジンの交互スクラブと70％のアルコールで剃毛面積を拭くためにガーゼを使用。手術領域に動物を転送します。
- きれいなアンダーパッドに動物を置き、目標と筋肉（複数可）への良好なアクセスを確保するために適切に配置します。
- 離れて下にある筋肉組織からの標的筋肉上の皮膚を持ち上げ、手術用ハサミで皮膚を切開を行うために、歯のグリップをピンセットを使用してください。切開部が完全に興味のある筋肉（複数可）を露出するのに十分な大きさであることを確認してください。筋膜の中断を最小限に抑えがあることを確認します。
- 精神的に筋肉（複数可）にMEP領域の位置と形状を転置するMEPの写真を使用してください。
注：ファインフェルトマーカーは、目的の筋肉（複数可）に写真からMEP地域を再生するために支援することができます。 - 各s 1-2μLの3〜4回の注射、フルオロ金（MEP領域の全長に沿って複数回の注射を行いますhould）十分です。静かに任意の漏出を除去するために、筋肉（複数可）を拭きます。
- 鈍鉗子で互いに近接切開皮膚の両端を持って、外科手術用クリップで傷口を閉じます。傷の全スパンに沿って0.1ミリリットルブピバカイン（水中0.5％）（または他の局所麻酔薬）を潜入。
- それは完全に麻酔から回復されるまで、麻酔器の電源をオフにして、動物を監視します。
- 筋肉内注射の投与や動物の灌流の間に14日間待ってください。
3.潅流
- 腹腔内注射によって動物に、ペントバルビトンナトリウム溶液の致死量（150 mgの/ kgの例えば Lethabarb）を管理します。
- ペダルの撤退と角膜反射の欠如によって確認されるように、麻酔の深いレベルは、到達するまで密接に動物を監視します。
- perfusio上に配置された解剖ボード上の背中に動物を置きnは沈みます。
- 胸骨の基部を覆っている皮膚を持ち上げるために、歯のグリップをピンセットを使用してください。すぐに胸骨下の強い手術用ハサミで小さな皮膚切開を行い、その後、グリップに胸骨の剣状突起軟骨をピンセットを使用しています。剣状軟骨を保持しながら、胸骨から脇の下に、胸腔の両側に切開を拡大します。
- 心臓を露出させるために、振動板をカットします。
- 血液の凝固を防ぐために、直接心臓の頂点にヘパリンの0.mlを注入します。
- 左心室へのカニューレの挿入を可能にするために頂部を切断し、その後速やかに止血を用いて適所にカニューレをクランプ。
- 細かいハサミで右心房の切開を行い、すぐに蠕動ポンプを起動します。心房から流出する液体が血液のほぼ自由であり、肝臓の色は淡褐色になるまで、0.1M PBで灌流。そして、ソルと灌流動物の体全体まで、パラホルムアルデヒド（0.1 M PB中4％）の化は、剛性になります。
4.頸髄解剖と組織学のための準備
- その腹部に動物の死体を置きます。
- メスで身体の正中線の皮膚をカットし、腸骨のレベルに頭蓋底からそれを反映しています。
- カットスルーと脊柱の背側面を露出させるために傍脊柱筋を反映しています。
- アトラス、第二頚椎のセグメント（ すなわち 、C2）の骨棘突起を特定し、対応する基礎となる後根を見つけるために、外科用鉗子やピンセットでそれを削除します。
- 永久フェルトマーカーでそれを着色し、右C2のルートを特定します。
- 1によって次の椎骨1つを削除して、色を交互に右後根をマーク（ すなわち 、C2、C4、C6、及びC8は、緑とC3に着色することができる、C5、C7、T1はCOLすることができます青で）論理和。
- 静かに脊髄の下端を覆う硬膜を貫通する小手術針（ 例えば 、30 Gゲージ針）を使用します。縦スリットを作るために吻方針を移動させながら上向きに針のベベルで、コードから離れて硬膜を持ち上げます。
- 硬膜を反映しています。
- 新しいメスの刃で1つまたは2つのセグメントブロックに脊髄横断をカットします。
- 慎重に隣接する二つの根の間のメスの刃途中で各ブロックの左側に小さな基準マークを作る、ブロックごとに、その場での脊髄セグメントのままにしておきます。基準マークは、ブロックの腹側面から見えるようにするように組織を通る十分な深さであることを確認してください。解剖後の組織セグメントの向きを支援するために、動物の解剖学的構造に関していずれか前方または後方に向い、約45°の角度で基準マークを作成します。
- パラホルムアルデヒド（0.1 M PB中4％）の溶液を含む小さな、明確に表示ボトルに、個々のブロックを収集し、RT O / Nで残します。
- ショ糖（0.1 M PB中30％）の溶液を含むクリーン、明確に表示ボトルにブロックを転送し、少なくとも2日間4℃で維持。
- クライオ金型内のセグメントを配置し、組織凍結培地でそれらをカバーしました。縦組織学的調製のために、上向きに背側面でブロックを配向させ、低温金型内のブロックを配向させるために基準マークを使用しています。
- -20℃の低温金型を凍結し、50ミクロンの厚さの切片に低温保持装置で切断しました。注：セクションに直接接着顕微鏡スライド上にマウントし、O / Nを乾燥させるために残すことができます。代替的に、切片を0.1 M PBで満たさ48ウェルプレートに浮遊することができ、その後、スライド上の組織切片を配向する基準マークを使用してマウント。
5.腰椎共同RD解剖と組織学のための準備
- それは背中に動物の死体を置きます。
- 動物の腹部に沿って正中切開を行い、内臓を取り除きます。脊柱の腹側面を露出させるために後部腹壁の筋肉を解剖。
- T13前根が骨を出る短い尾最リブとその隣接するT13の椎骨の位置を確認します。
- 連続して腹側コードの腹側面のエントリのその時点までのT13腹ルートを追跡するために、微細手術用骨鉗子でT13（ すなわち 、T12、T11と、必要に応じて、T10）に一つずつ二、三の椎骨吻側を削除し、永久フェルトマーカーでマークします。
- この時点から、色を交互にして着色、L1、L2、L3、L4、L5、L6およびS1用前根のエントリポイントの位置を特定するために同じ手順を繰り返します。
- LUMについては、セクション4.5から4.10に記載したのと同じ手順に従ってください脊髄切開をバー。
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Representative Results
アセチルコリンエステラーゼ組織化学的染色は、筋肉の幅にわたってモータのエンドプレートの位置を明らかにした。 図1は、全体のラットの前肢で行わかかる染色の結果を示します。これは、硫化アンモニウム溶液の濃度を最適化するために提案されている（ 例えば 、5〜7％の代わりに10％）だけでなく、試料を溶液中に浸漬する時間としては、筋肉繊維上の非特異的バックグラウンド染色はすぎる場合過度。 図2は、マウスの上腕三頭筋の運動終板領域の長さに沿って逆行性神経トレーサーの注入後頸髄で標識された運動ニューロンの列を示しています。逆行性標識された運動ニューロンは、典型的には、脊髄の複数のセグメントを横切って延びる縦の列を形成する。 図3は、SELを介して得られた標識された脊髄運動ニューロンの異なる数を示しています三頭筋上腕に運動終板領域の標的ectiveフルオロゴールド。 MEP領域の特定の区画を標的とするとは対照的に、最大の取り込みは、MEP領域のスパン全体への送達後に観察されました。
図1：アンモニウム硫化物溶液に、（A）と後（B）露光前のモーターエンドプレートのためのアセチルコリンエステラーゼ組織化学的染色後のラットの横前肢の表示。 （A）は、モータのエンドプレートは、筋肉繊維が緑-青の色相を採用しながら、筋肉の幅全体を横切る連続線を形成するドット白色斑点として明らかです。 （B）は、同一の前肢は、硫化アンモニウム溶液に浸漬した後に提示されます。硫化アンモニウム溶液中で現像した後、モータのエンドプレートTU茶色の筋線維を介してRN黒。図の両方の部分の矢印（1）Acromiotrapezius、（2）Spinodeltoideus及び（3）上腕三頭用のモータのエンドプレートの位置を指します。
図2：フルオロ金標識運動ニューロン WMを暴け子宮頸レベルでの脊髄前角を介して50μmの縦断面の顕微鏡写真は、白質を表し、GMは、脊髄の灰白質を表しています。破線は、図中に観察された脊髄のセクション内の灰白質と白質との間の境界を示しています。挿入図は、同じフィルタの下20X対物レンズで撮影されたのに対し、顕微鏡写真をDAPIフィルターの下で10倍の対物レンズで撮影しました。両方のパネルにおいて、フルオロ金標識は、近位軸索/ dendritiならびに運動ニューロンの細胞質で観察することができますCプロセス。もともとTosolini らに公開され図。 （2013）マウス前肢でモーターエンドプレート領域の全身をターゲットには、対応する脊髄運動ニューロンフロントにフルオロゴールドの取り込みを増加させます。 Neurol。 4時58分。 DOI：10.3389 / fneur.2013.00058
図3：上腕三頭および脊髄運動ニューロンを生じる標識でモーターエンドプレート領域の標的（A）選択フルオロ金は上腕三頭繊維上の運動終板の位置の概略図です。個別に標的とされたMEP領域の三つの異なるセクションは、緑、赤、青のドットで表現されます。ブルードットはrepreseながら緑と赤のドットが、それぞれ全体のMEP領域の前方および後方の半分を表します筋肉の腹にFGのボーラス注射の場所をNT。双頭矢印は前後軸で筋肉を配向します。 （B）（A）に示すように、上腕三頭筋と上腕のMEP領域の異なる部分を選択的に標的化後に得られた標識化を示す複合図です。 （B）の各点は、単一の標識された運動ニューロンを表します。黒カラムは、筋肉のMEP領域の全スパンにFGの次の注入を観察される典型的な標識の代表です。グリーン運動ニューロン列が筋肉の前方半分にFG注射の後得られる一方で赤色運動ニューロン列は、筋肉の後半に次のFG注射を得られます。青色列によって示されるように、筋肉の「腹」に制限注射は、脊髄セグメントの少数で運動ニューロンを生じました。もともと公開するように図Tosolini らで編。 （2013）マウス前肢でモーターエンドプレート領域の全身をターゲットには、対応する脊髄運動ニューロンフロントにフルオロゴールドの取り込みを増加させます。 Neurol。 4時58分。 DOI：10.3389 / fneur.2013.00058
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Discussion
神経筋条件の実験的治療のための筋肉内ターゲティングおよび対応するα運動ニューロンへの治療導入遺伝子のその後の逆行性伝達は、新戦略ではありません。例えば、この送達方法は、SOD1マウスおよびラット1,9-12ならびにSMA 13とマウスにおいてALS進行の異なる段階での神経筋変性を遅延させるために使用されてきました。有望一方、これらの遺伝子治療のシナリオの有効性は限られていました。この点において、我々は、脊髄運動ニューロンによるトランスジーンの取り込みが筋繊維にモータエンドプレートの選択的標的化することによって改善することができることを提案します。これは、上記の研究で、ウイルスベクターの筋肉内注射は、標的筋肉のMEP領域の位置を参照することなく行われたことを注意することが重要です。
運動終板の分布の我々の分析を通して後肢と前肢の（欧州議会議員）、いくつかの原則が浮上しています。まず、MEP領域は、筋肉の幅全体にまたがります。また、欧州議会議員は、一貫して筋線維の方向に関して直角に整列しています。特に、MEP領域は常に筋肉の最も厚い部分、しばしば「腹」と呼ばれる領域内に配置されていない、それは、多くの場合、筋肉内ボーラス注射の対象です。これは、現在の分析はのC57Bl6マウス22-23ロングエバンスラット21で行った、それは欧州議会議員の分布は動物のこれらの二つの株のそれぞれの中に保存されていることが判明したことは注目に値します。しかし、MEP分布は同じ種内の動物の異なる株の間で保存されているかどうかを文書化されていません。
もともと、私たちは小さな、MULを案内するために、前肢と後肢のいくつかの筋肉のためのMEP領域の位置を報告しています逆行性神経トレーサーフルオロゴールドの複数指の筋肉注射。これらのMEPマップは運動ニューロンへのシャトル導入遺伝子に使用することができます。そのような例では、しかしながら、使用されるウイルスのタイプ（ 例えば 、アデノウイルス、レンチウイルス、 など ）の血清型、ならびにその力価に応じて注射のボリュームを調整することが重要です。筋膜が無傷で維持することは、目的の筋肉（複数可）の範囲内に閉じ込められたウイルスを維持するための良い方法です。運動ニューロンの偽トランスフェクションを回避する別の方法は、隣接筋肉が優しく注射後の筋肉の表面を拭くためにある神経支配します。これらの予防措置は伝達の高レベルを達成することが目標と筋肉を供給運動ニューロンのプール内でそれを含むより多くの関連する可能性があり、いくつかの実験的なデザインに無関係である可能性があります。それにもかかわらず、彼らは明白な安全上の理由からお勧めしています。二つ以上の単離された筋肉を注入する必要がある場合は、それが可能な場合、選択するために、賢明かもしれません皮膚切開の大きさを最小にするために互いに近接している筋肉の群。ラットおよびマウスは、非常に緩い皮膚（ すなわち 、筋肉に付着していない）を有しているので、巨大な皮膚切開を行うことなく、いくつかの筋肉を標的とすることは比較的容易です。
理想的には、このような治療は、脊髄運動ニューロンの全体人口全体に有益な遺伝子を導入することになる、としてニューロンの逆行性の機械を使用して、ALSおよび他の神経筋条件のための効果的な遺伝子治療が課題です。しかし、それは、関心対象の治療遺伝子は、ニューロトロフィンのような分泌タンパク質をコードする場合、形質導入された持続可能なレベルを達成するために、すべての運動ニューロンを標的とする必要はありません。確かに、形質導入されたものの近傍で非形質導入運動ニューロンはパラクリン機構24を介してニューロトロフィンの外因性分子を内部ことが示されています。この「バイスタンダー効果」は大幅EFFIを強化します運動ニューロンに対応するにシャトル分泌タンパク質をコードする遺伝子を標的とする筋肉のcacy。一方、呼吸制御の損失は、ALSにおける死の最終的な原因であるという事実を考えると、治療的ウイルス構築物の筋肉内注射は、肋間筋1で実行することができ、またはintrapleurally 25呼吸に関与する運動ニューロンを保護します。簡単に骨格筋でのMEPの位置と組織を強調表示する方法を説明することによって、本プロトコルは、神経筋機能障害のための新規の遺伝子治療戦略を探るための貴重なツールであることを証明します。このプロトコルはまた、これらの下位運動ニューロン疾患における神経筋接合部の完全性を維持するための低侵襲的な方法を提供します。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、RMへの国民の健康と医療研究センター（NHMRC）プロジェクトの助成金によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10 µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
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