Abstract
Ziekten van de integriteit van het ruggenmerg motorneuronen behoren tot de meest slopende neurologische aandoeningen. In de afgelopen decennia is de ontwikkeling van verschillende dierlijke modellen van deze neuromusculaire stoornissen gegeven wetenschappers met verschillende therapeutische's ter vertragen of omkeren van de progressie van deze aandoeningen. Door gebruik te maken van de retrograde machinerie van neuronen, één van deze benaderingen is om skeletspieren om shuttle therapeutische genen te richten op overeenkomstige ruggenmerg motorneuronen. Maar zodra veelbelovend is het succes van dergelijke gentherapie benadering belemmerd door het sub-optimale aantal getransduceerde motorneuronen zij tot dusver getoond verkregen. Motorzijde platen (EP) zijn zeer gespecialiseerde gebieden op de skeletmusculatuur die in direct contact synaptische het ruggenmerg α motorische neuronen. In dit verband is het belangrijk op te merken dat, tot nu toe, de inspanningen om retrogradelyoverdracht van genen in motorische neuronen plaats tegen de locatie van het gebied MEP in de beoogde spieren. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol 1) om de exacte locatie van de EP-leden op het oppervlak van de skeletspieren te onthullen en 2) om deze informatie gebruiken om te begeleiden de intramusculaire levering en daaropvolgende optimale retrograde transport van retrograde tracers in motorische neuronen. We hopen de resultaten van deze tracing experimenten in verdere studies te gebruiken in het onderzoek naar retrograde transport van therapeutische genen aan het ruggenmerg motorische neuronen door de doelgerichtheid van Europarlementsleden.
Introduction
Het verlies van de controle van vrijwillige bewegingen als gevolg van neurologische aandoeningen zoals motorneuron ziekte en spinal- en Duchenne musculaire atrofie is een invaliderende aandoening die hoge en langdurige gevolgen voor het dagelijks leven van aangetaste individuen heeft. In de afgelopen tien jaar heeft onderzoek gericht om te stoppen of op zijn minst vertraging van de schadelijke effecten van deze neuromusculaire ziekten een prioriteit voor veel artsen en wetenschappers over de hele wereld. In dit verband heeft de recente generatie diermodellen deze neuromusculaire aandoeningen nabootsen die nodig was om fundamenteel inzicht in de fysiologische mechanismen verantwoordelijk voor de ontwikkeling en progressie van deze voorwaarden zijn 1-13. Behandeling van deze neuromusculaire aandoening heeft directe toegang tot het ruggenmerg en kan door ruggenmerg injecties 14,15. Recente ontwikkelingen in gentherapie zijn ook gericht op de dwarsgestreepte spieren van de bovenste enonderste ledematen shuttle therapeutische genen tot de overeenkomstige α motorische neuronen die zich in de ventrale hoorn van het ruggenmerg 1,9-13. Echter, deze keer veelbelovende strategie niet aan de uitkomst van deze neurologische aandoeningen te verbeteren. Hoewel het worden besloten dat deze slechte resultaten kan zijn, althans gedeeltelijk, te wijten aan de lage doeltreffendheid van deze beschermende genen, kan men de lage werkzaamheid van deze genafgifte te passen niet uit.
End motor platen (EP) zijn gespecialiseerde gebieden van het skelet myofibrillen die worden ingesprongen door de axon terminals van grote perifere motorische vezels afkomstig uit α motorische neuronen. Samen vormen de perifere zenuw vezel uiteinden en EP vormen de neuromusculaire junctie, dat wil zeggen de plaats waar synaptische impulsen worden veroorzaakt door de anterograde afgifte van de neurotransmitter, acetylcholine. Belangrijk is dat de relatie tussen perifere zenuwvezels en de leden van het EP is bi-direcnele, hoewel de verschillende motoren zijn verantwoordelijk voor het transport van moleculen en organellen richting en weg van het neuron somata 16-18. In het licht van deze anatomische overwegingen, Europarlementsleden lijken om de doelstellingen van de keuze voor de levering en daaropvolgende retrograde transport van genetisch materiaal naar de overeenkomstige motorische neuronen. In dit verband is het niet verrassend dat het succes van motor neuron transductie sterk afhankelijk van de afstand tussen de intramusculaire injectie van virale vectoren en spier EP 19-20. Verrassenderwijs echter, de exacte locatie van het MEP zones op de myofibrillen van het laboratorium rat en muis, de twee species gekozen model neuromusculaire ziekten beschikbaar waren tot voor kort.
We hebben uitgebreide kaart van de omgeving MEP enkele voorpoot spieren in de rat en de muis 21-22 geproduceerd. Recenter hebben we aangetoond details van de organisatie van het MEP rEgion voor meerdere spieren van de muis achterbeen 23 en we zijn momenteel het analyseren van de kenmerken van de leden van het EP op het achterbeen rat. In onze handen, intramusculaire injecties van retrograde tracers gericht op het gehele MEP zones in deze spieren leidde tot meer gelabelde motorneuronen die van meer ruggenmergsegmenten dan eerder gerapporteerd. Hier presenteren we het protocol dat is ontwikkeld in de afgelopen jaren om de locatie van de EP op het buitenoppervlak en over de hoogte van het achterbeen onthullen en voorpoot spieren in zowel de muis en de rat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven experimentele procedures voldaan aan de Animal Care en de ethische commissie van UNSW Australië en werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Health en Medical Research Council van Australië regels voor dierproeven. Alle procedures in dit protocol dienen te worden uitgevoerd in overeenstemming met de eis van de relevante Animal Care en de ethische commissie.
1. Acetylcholinesterase Histochemische kleuring
- Bereid de Acetylcholinesterase reactiemengsel
- Voeg 290 mg Acetylthiocholine jodide tot 200 ml 0,1 M fosfaatbuffer (PB). Meng met een magnetische roerder bij 900 rpm.
- Voeg 600 mg glycine onder voortdurend roeren.
- Voeg langzaam 420 mg kopersulfaat aan het reactiemengsel onder voortdurend roeren totdat het product volledig is opgelost.
- Verwijder de huid van het dier karkas (verkregen door het delen weefsel) door insnijdingenin de huid van een geperfuseerde rat of muis, grijpen de huid van de nek en voorbij de voeten trekken. Controleer of de fascia die elke spier ofwel verwijderd of aanzienlijk geperforeerd om voldoende blootstelling van de spiervezels aan de reactieoplossing waarborgen.
- Dompel het lichaam of ledematen plaats in het reactiemengsel en incubeer O / N bij 4 ° C.
- Was het karkas gedurende 2 min in gedestilleerd water. Opmerking: In dit stadium, de spieren vertonen een blauwkleuring en de motor eindplaten (EP) kan worden gezien als witte stippen.
- Expose het karkas van een 10% ammonium sulfide oplossing voor 3-5 sec.
Opmerking: de spiervezels zal snel bruin en de leden zullen waarneembare zo zwart gespikkelde stippen zijn. Wanneer de reactie te snel, en de spiervezels te donker onderscheid tussen de leden en de spiervezels gekleurd proberen met behulp lagere concentraties ammonium- sulfide-oplossing (bijvoorbeeld 5%). De reactietijd van het krijgenoptimaal contrast tussen de leden en de spiervezels verschilt van monster naar de andere. Daarom is het moeilijk de exacte belichtingstijd aan het reagens te bepalen. De reactie moet nauwlettend worden gevolgd en gestopt wanneer het contrast voldoende wordt geacht. - Was het karkas twee keer, met agitatie in gedestilleerd water en dep het karkas droog.
- Foto zowel de laterale als mediale aspecten van het ledemaat, zodat de EP van alle spieren van belang worden opgevangen.
2. intramusculaire injecties bij de Motor End Plates
- Trek glas micropipetten met een micropipet trekker (het gebruik van gesorteerde micropipetten met zuigers wordt aanbevolen). Met behulp van een stereomicroscoop, breken de uiteinden van de micropipetten met een pincet zodat de binnendiameter van het lumen van de micropipet ongeveer 0,5 mm.
- Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten die worden gebruikt vers zijn geautoclaveerd en thin het operatiegebied steriel.
- Vul het micropipetten met fluor-Gold (5% in gedestilleerd water).
- Braken anestheseren in het dier in een inductie kamer met isofluorane (4% in O 2). Controleer voor oprichtreflex en zorgen voor de afwezigheid voordat u deze uit de inductie kamer. Bevestig een neuskegel over de snuit van de rat en lever isofluorane (2% in O 2) voor het onderhoud van anesthesie. Knijp de tenen van het dier en zachtjes aanraken ogen van het dier om ervoor te zorgen dat zowel het pedaal terugtrekking en het hoornvlies reflexen zijn afwezig. Opmerking: Een mengsel van ketamine en xylazil kunnen ook worden gebruikt (80 en 10 mg / kg respectievelijk, intraperitoneaal afgeleverd). Ketamine is een Schedule 8 ("Controlled") drugs en de nodige protocollen in verband met de aankoop, het gebruik, de opslag en de verwijdering van het geneesmiddel moeten worden nageleefd.
- Breng oogzalf om uitdroging van het oog tijdens de procedure te voorkomen.
- Scheer de targeted ledematen en het gebruik gaas om het geschoren gebied afvegen met drie afwisselende scrubs van chloorhexidine en 70% alcohol. Breng het dier naar het operatiegebied.
- Leg het dier op een schone onderlegger en plaats deze op de juiste wijze om een goede toegang tot de gerichte spier (s) te waarborgen.
- Gebruik een pincet met tooth grepen aan de huid over de geselecteerde spier til van de onderliggende spieren en een insnijding in de huid met chirurgische schaar. Zorg ervoor dat de insnijding groot genoeg om de spier (s) plaats volledig bloot. Zorg ervoor dat er een minimale verstoring van de fascia.
- Gebruik de MEP foto om mentaal omzetting van de locatie en de vorm van de regio MEP op de spier (s).
Opmerking: Een fijne vilt marker zou kunnen helpen om de regio MEP van de foto te reproduceren op de spier (s) van belang. - Voer meerdere injecties over de volle lengte van het gebied MEP (voor Fluor-goud, 3-4 injecties van 1-2 pi elk should voldoende). Veeg de spier (s) om eventuele lekkage te verwijderen.
- Breng de twee uiteinden van de ingesneden huid dicht bij elkaar met stompe tang en sluit de wond met chirurgische clips. Infiltreren 0,1 ml bupivacaïne (0,5% in water) (of andere lokale anesthetica) langs het gehele scala van de wond.
- Zet de verdoving machine uit en bewaken het dier totdat het volledig is hersteld van de anesthesie.
- Wacht 14 dagen tussen toediening van intramusculaire injecties en perfusie van de dieren.
3. infusies
- Dien een lethale dosis pentobarbiton natriumoplossing (bijv Lethabarb; 150 mg / kg) aan de dieren door intraperitoneale injectie.
- Nauwlettend toezien op het dier tot een diep niveau van anesthesie is bereikt, zoals bevestigd door de afwezigheid van het pedaal terugtrekking en het hoornvlies reflexen.
- Plaats het dier op zijn rug op een dissectie bord geplaatst over een perfusion wastafel.
- Gebruik een pincet met tooth grepen aan de huid die de onderkant van het borstbeen heffen. Maak een kleine incisie in de huid met een paar sterke chirurgische schaar direct onder het borstbeen en gebruik dan de tang om de greep van de zwaardvormig kraakbeen van het borstbeen. Houd de xiphoid kraakbeen, vergroot de insnijding aan beide zijden van de borstholte, van het borstbeen naar de oksels.
- Snijd het membraan naar het hart bloot te leggen.
- Injecteer 0.ml heparine direct in de apex van het hart om bloedstolling te voorkomen.
- Snijd de apex om het inbrengen van een canule toe in de linker ventrikel, en vervolgens snel klem de canule op zijn plaats met behulp van een hemostaticum.
- Een incisie in het rechter atrium met een paar fijne schaar en onmiddellijk beginnen de peristaltische pomp. Perfuseren met 0,1 M PB totdat de vloeistof die uit het atrium bijna vrij van bloed en de kleur van de lever wordt lichtbruin. Vervolgens perfuseren met een oplostie van paraformaldehyde (4% in 0,1 M PB) totdat het gehele lichaam van het dier verstart.
4. Cervical Spinal Cord Dissection en voorbereiding voor histologie
- Leg het dier karkas op zijn buik.
- Snijd de huid op middenlijn van het lichaam met een scalpel en reflecteren van de basis van de schedel op het niveau van de iliacale bot.
- Knip en weerspiegelen de paravertebrale spieren aan de dorsale zijde van de wervelkolom bloot.
- Identificeer de benige processus spinosus van Atlas, de tweede cervicale segment (dwz, C2), en verwijder het met een paar van chirurgische rongeurs of tang om de overeenkomstige onderliggende dorsale wortel te vinden.
- Identificeer de juiste C2 wortel door te kleuren met een permanente markeerstift.
- Verwijder de volgende ruggenwervels een voor een en markeer de juiste dorsale wortels met wisselende kleuren (bijvoorbeeld, C2, C4, C6, C8 en te kleuren groen en C3, C5, C7, T1 kan worden colORed in het blauw).
- Gebruik een chirurgische naald (bijvoorbeeld 30 G gauge naald) om voorzichtig doorboren de dura die het ondereinde van de ruggenmerg. Met de schuine kant van de naald omhoog, til de dura weg van het snoer, terwijl het verplaatsen van de naald rostraal een langssleuf maken.
- Weerspiegelen de dura.
- Snijd het ruggenmerg transversaal in één- of twee-segment blokken met een nieuw scalpel.
- Laat het ruggemerg segmenten in situ en voor elk blok, voorzichtig een kleine referentiemarkering aan de linkerkant van elk blok met de scalpel halverwege tussen twee aangrenzende wortels. Zorg ervoor dat de referentiemarkering diep genoeg door het weefsel zichtbaar vanuit het ventrale aspect van de blokken. Maak de referentiemarkering een hoek van ongeveer 45 °, wijzend ofwel anterieur of posterieur ten opzichte Anatomie, om te helpen bij de oriëntatie van het weefselsegment volgende dissectie.
- Verzamel de individuele blokken op kleine, duidelijk gemarkeerd flessen met een oplossing van paraformaldehyde (4% in 0,1 M PB) en verlaat bij KT O / N.
- Breng de blokken op schone, duidelijk gemarkeerd flessen met een oplossing van sucrose (30% in 0,1 M PB) en bewaar bij 4 ° C gedurende ten minste twee dagen.
- Plaats de segmenten in cryo-mallen en bedekt ze met het weefsel bevriezen medium. Voor longitudinale histologische preparaat, oriënteren de blokken met de dorsale zijde naar boven en met de referentiemarkering op het blok in de cryo-matrijzen oriënteren.
- Bevries de cryo-schimmels bij -20 ° C en gesneden met een cryostaat in 50 urn dikke secties. Opmerking: De secties kunnen direct worden aangebracht op adhesie objectglaasjes en laat drogen O / N. Alternatief kunnen de delen drijven in 48-well platen gevuld met 0,1 M PB en vervolgens gemonteerd met de referentiemarkering op de weefselcoupes op de glijbaan oriënteren.
5. lumbale spinale Cord Dissection en voorbereiding voor histologie
- Leg het dier karkas op zijn rug.
- Voer een middellijn incisie langs de buik van het dier en verwijder de ingewanden. Ontleden de spieren van de buikwand naar het ventrale aspect van de wervelkolom bloot.
- Zoek de korte staart meest rib en de aangrenzende T13 wervel waar de T13 ventrale wortel verlaat het bot.
- Achtereenvolgens verwijder één voor één de twee of drie wervels rostraal T13 (dwz, T12, T11 en, indien nodig, T10) met fijne chirurgische rongeurs aan de T13 ventrale wortel volgen totdat de punt van binnenkomst in het ventrale aspect van de ventrale snoer en markeren met een permanente markeerstift.
- Vanaf dit punt, herhaal dezelfde procedure om de locatie van de ventrale wortel toegangspunten voor L1, L2, L3, L4, L5, L6 en S1 identificeren, kleuren ze met wisselende kleuren.
- Volg dezelfde procedure zoals beschreven in hoofdstuk 4,5-4,10 voor lumbar ruggenmerg dissectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Acetylcholinesterase histochemische kleuring onthult de locatie van de motor eindplaten over de breedte van de spieren. Figuur 1 illustreert de resultaten van dergelijke kleuring uitgevoerd op gehele rat voorpoot. Voorgesteld wordt om de concentratie van de ammonium sulfide oplossing optimaliseren (bijv., 5-7% in plaats van 10%) en de tijd het monster ondergedompeld in de oplossing, indien de niet-specifieke achtergrondkleuring op de spiervezels te overmatig. Figuur 2 illustreert een kolom gelabeld motorische neuronen in het ruggenmerg na een injectie van retrograde neuronale tracer over de lengte van de motor eindplaat gebied van een muis triceps brachii. De retrograde gemerkte neuronen vormen typisch een longitudinale kolom die zich uitstrekt over meerdere segmenten van het ruggenmerg. Figuur 3 illustreert de verschillende aantallen gemerkte ruggenmerg motorische neuronen die werd verkregen door middel selecterende Fluor-Gold targeting van de motor einde plaat regio triceps brachii. Maximale opname werd waargenomen na plaatsing in zijn gehele regio MEP, in plaats van gericht op specifieke compartimenten van de regio MEP.
Figuur 1: Uitzicht op de Lateral voorpoot van de Rat na Acetylcholinesterase Histochemische kleuring voor de Motor End Plates voor (A) en na (B) Blootstelling aan de Ammonium sulfide Solution. In (A), de motor eindplaten zijn duidelijk zichtbaar als witte gespikkelde stippen die een continue lijn die de gehele breedte van de spier kruist terwijl de spiervezels neemt een groen-blauwe tint vormen. In (B), wordt dezelfde voorpoot ingediend na onderdompeling in het ammonium- sulfide oplossing. Na de ontwikkeling van de ammonium sulfide oplossing, de motor eindplaten turn zwart over de bruine spiervezels. De pijlen in beide delen van de cijfers verwijzen naar de locatie van de motor eindplaten voor (1) Acromiotrapezius, (2) Spinodeltoideus en (3) triceps brachii.
Figuur 2:. Microfoto van 50 pm langsdoorsnede door de ventrale Hoorn van de Spinal Cord bij Cervical Levels Revealing Fluor-Gold-label Motor Neuronen WM vertegenwoordigt de witte stof en GM vertegenwoordigt de grijze stof van het ruggenmerg. De gestippelde lijn geeft de grens tussen de grijze en witte stof in het ruggenmerg sectie waargenomen in de figuur. De microfoto werd genomen met een 10x doelstelling van de DAPI filter, terwijl de inzet werd genomen met de 20X doel onder dezelfde filter. In beide panelen, kunnen fluor-Gold labeling worden waargenomen in de motor neuron cytoplasma en proximale axon / dendritic processen. Figuur zoals oorspronkelijk gepubliceerd in Tosolini et al. (2013) Gericht op de volledige lengte van de Motor End Plate Regio in de muis voorpoot Verhoogt de opname van fluor-Gold in Overeenkomstige Spinal Cord Motor Neuronen Front. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058
Figuur 3:. Selective fluor-Gold richten van de Motor eindplaat regio in de triceps brachii en de resulterende etikettering in de Spinal Cord motorneuronen (A) is een schematische weergave van de plaatsing van de motor eindplaten op triceps brachii vezels. De drie verschillende delen van het gebied MEP die afzonderlijk waren gericht worden voorgesteld door de groene, rode en blauwe stippen. De groene en rode stippen geven de voorste en achterste helften van de hele MEP regio respectievelijk, terwijl de blauwe stippen VERTEGEnt de locatie van de bolus injectie van FG in de buik van de spier. De dubbele pijl oriënteert de spier in een anterior-posterior as. (B) is een samengestelde grafiek etikettering verkregen na selectieve targeting van de verschillende delen van het MEP gebied van de triceps brachii illustreren, zoals in (A). Elke stip in (B) een enkele gelabelde motor neuron. De zwarte kolom is representatief voor de typische kenmerken waargenomen na injectie van FG in de gehele spanwijdte van de MEP regio van de spier. De rode motor neuron kolom wordt verkregen na FG injecties in de achterste helft van de spier, terwijl de groene motor neuron kolom wordt verkregen na FG injecties in de voorste helft van de spier. Injecties beperkt tot de "buik" van de spier leverde motorneuronen in slechts een klein aantal ruggenmergsegmenten, zoals aangetoond door de blauwe kolom. Figuur als oorspronkelijk publicerened in Tosolini et al. (2013) Gericht op de volledige lengte van de Motor End Plate Regio in de muis voorpoot Verhoogt de opname van fluor-Gold in Overeenkomstige Spinal Cord Motor Neuronen Front. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intramusculaire targeting en daaropvolgende retrograde overbrengen van therapeutische transgenen in het overeenkomstige α motoneuronen voor de experimentele behandeling van neuromusculaire aandoening geen nieuwe strategie. Zo heeft deze levering methode gebruikt om neuromusculaire degeneratie vertraging in verschillende stadia van de progressie van ALS SOD1 muizen en ratten 1,9-12 en in muizen met SMA 13. Ofschoon veelbelovend, is de effectiviteit van deze gentherapie scenario beperkt. In dit verband stellen wij voor dat de opname van de transgenen van ruggenmerg motorneuronen kan worden verbeterd door het selectief richten van de motor eindplaten op de spiervezels. Het is belangrijk op te merken dat, in de bovengenoemde studies, de intramusculaire injectie van virale vectoren werden uitgevoerd zonder verwijzing naar de locatie van het gebied MEP in de beoogde spieren.
Tijdens onze analyse van de verdeling van de motor eindplaten(EP) van het achterbeen en de voorpoot, hebben een aantal principes naar voren. Eerst werd het MEP uitstrekt over de gehele breedte van een spier. Bovendien worden de EP consistent orthogonaal uitgelijnd met betrekking tot de richting van de myofibrillen. Met name wordt het gebied MEP niet altijd zich in het dikste gedeelte van de spier, een gebied vaak aangeduid als buik- en dat vaak het doelwit van bolus intramusculaire injecties. Opgemerkt zij dat de huidige analyses werden uitgevoerd op C57Bl6 muis 22-23 en Long Evans ratten 21 en gevonden werd dat de verdeling van de EP behouden binnen deze twee stammen van dieren. Echter, ook indien het MEP verdeling is geconserveerd tussen verschillende stammen van dieren van dezelfde soort nog worden gedocumenteerd.
Oorspronkelijk, hebben we de locatie van de regio MEP voor meerdere spieren van de voorpoot en achterbeen gedocumenteerd om begeleiden kleine, multiple intramusculaire injecties van de retrograde neuronale tracer fluor-Gold. De MEP kaarten kunnen worden gebruikt om shuttle transgenen in motorneuronen. In een dergelijk geval, is het echter belangrijk dat de hoeveelheden injecties volgens het type virus (bijv., Adenovirus, lentivirus, etc.) het serotype en de titer te passen. Houden van de fascia intact is een goede manier om het virus opgesloten binnen de grenzen van de spier (s) van belang. Een andere manier om parasitaire transfectie van motorneuronen voorkomen innerveren naaste spieren aan het oppervlak van de spier veeg na de injecties. Deze voorzorgsmaatregelen kunnen irrelevant in sommige experimentele ontwerpen zijn waar het bereiken van een hoog niveau van transductie kan relevanter dan dat het binnen de pool van motorische neuronen leveren van de beoogde spieren zijn. Toch zijn ze goede praktijken voor de hand liggende veiligheidsredenen. Indien meer dan één geïsoleerde spieren moeten worden geïnjecteerd, kan het verstandig zijn, indien mogelijk, te kiezeneen groep van spieren die dicht bij elkaar om de grootte van de incisie minimaliseren. Ratten en muizen zijn zeer losse huid (bijv., Niet verbonden aan de spieren), dus is het relatief eenvoudig om verschillende spieren richten zonder grote huidincisies voeren.
Effectieve gentherapie voor ALS en andere neuromusculaire aandoeningen met behulp van de retrograde machinerie van neuronen blijft een uitdaging, idealiter, zou een dergelijke therapie gunstig genen dragen over de gehele bevolking van het ruggenmerg motorische neuronen. Het is echter niet noodzakelijk alle motorneuronen targeten duurzame niveaus van transductie oplevert als het therapeutisch gen van belang codeert een secretorische eiwit zoals een neurotrofinen. Immers, niet-getransduceerde motorneuronen in de nabijheid van die die zijn getransduceerd is aangetoond dat exogene moleculen neurotrofinen internaliseren via een paracriene mechanisme 24. Deze 'bystander effect' sterk verbetert de efficiëntie intramusculaire richten naar shuttle secretorische eiwit coderende genen in overeenkomstige motorische neuronen. Anderzijds, aangezien het verlies van respiratoire controle de uiteindelijke doodsoorzaak in ALS zou intramusculaire injecties van therapeutische virale constructen worden uitgevoerd tussen de ribben 1 of intrapleuraal 25 de motorneuronen die betrokken zijn bij de ademhaling beschermen. Door het beschrijven van een methode om gemakkelijk benadrukken de locatie en de organisatie van de Europese afgevaardigden op skeletspieren, zal het huidige protocol blijken te zijn een waardevol instrument om nieuwe gentherapie strategieën te onderzoeken voor neuromusculaire disfuncties zijn. Dit protocol verschaft tevens een minimaal invasieve manier om de integriteit van de neuromusculaire junctie in deze lagere motorneuronziekten behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een National Health & Medisch Centrum voor Onderzoek (NHMRC) project subsidie aan RM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10 µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neuroscience. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
