Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الحقن في العضل وإلى جانب لوحات السيارات نهاية: نهج المناظير لمكوك الراسمات مباشرة إلى الخلايا العصبية للسيارات

Published: July 13, 2015 doi: 10.3791/52846
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Translational Neuroscience Facility, School of Medical Sciences, University of New South Wales
* These authors contributed equally

Abstract

الأمراض التي تؤثر على سلامة الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي هي من بين الحالات العصبية الأكثر إضعافا. على مدى العقود الماضية، وقد وفرت تطوير عدة نماذج حيوانية من هذه الاضطرابات العصبية والعضلية المجتمع العلمي مع سيناريوهات العلاجية المختلفة التي تهدف إلى تأخير أو عكس تطور هذه الشروط. من خلال الاستفادة من آلية الوراء من الخلايا العصبية، واحدة من هذه الطرق كان لاستهداف عضلات الهيكل العظمي لمكوك الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي المقابلة. على الرغم من مرة واحدة واعدة، وقد أعاق نجاح نهج تسليم هذا الجين من قبل عدد دون المستوى الأمثل من الخلايا العصبية الحركية transduced فقد أظهرت حتى الآن أن تحقق. لوحات السيارات نهاية (البرلمان الأوروبي) هي مناطق متخصصة للغاية على الجهاز العضلي والهيكل العظمي التي هي على اتصال مباشر متشابك إلى الحبل الشوكي α الخلايا العصبية الحركية. في هذا الصدد، من المهم أن نلاحظ أنه حتى الآن، والجهود المبذولة لretrogradelyوقدمت الجينات نقل إلى الخلايا العصبية الحركية من دون الإشارة إلى موقع المنطقة MEP في العضلات المستهدفة. هنا، نحن تصف بروتوكول بسيطة 1) للكشف عن الموقع الدقيق للأعضاء البرلمان الأوروبي على سطح عضلات الهيكل العظمي و2) لاستخدام هذه المعلومات لتوجيه تسليم العضلي واللاحق النقل إلى الوراء الأمثل لاستشفاف الوراء في الخلايا العصبية الحركية. نأمل الاستفادة من نتائج هذه التجارب تتبع في إجراء المزيد من الدراسات إلى التحقيق النقل إلى الوراء من الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري الحبل من خلال استهداف أعضاء البرلمان الأوروبي.

Introduction

فقدان السيطرة على حركة الطوعية التي تنتج من الحالات العصبية مثل مرض العصبون الحركي وspinal- وكذلك دوشين ضمور العضلات هو شرط المنهكة التي لديها تأثير دائم عالية وطويلة على الحياة كل يوم من الأفراد المتضررين. على مدى العقد الماضي، الجهود البحثية التي تهدف إلى وقف أو على الأقل تأخير الآثار الضارة لهذه الأمراض العصبية والعضلية وكانت أولوية بالنسبة لكثير من الأطباء والعلماء في جميع أنحاء العالم. وفي هذا الصدد، فإن الجيل الأخير من النماذج الحيوانية التي تحاكي هذه الأمراض العصبية والعضلية دورا أساسيا في الحصول على رؤى أساسية في آليات الفسيولوجية الكامنة وراء تطور وتقدم هذه الشروط 13/01. علاج هذه الأمراض العصبية والعضلية تتطلب الوصول المباشر إلى الحبل الشوكي ويمكن أن يتحقق عن طريق الحقن في النخاع الشوكي 14،15. واستهدفت التطورات الحديثة في مجال العلاج الجيني أيضا العضلات المخططة العليا والأطراف السفلية لمكوك الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة α التي تقع داخل القرن البطني للنخاع الشوكي 1،9-13. ومع ذلك، فقد فشلت هذه الاستراتيجية مرة واحدة واعدة لتحسين نتائج هذه الظروف العصبية. في حين أنه من الإنصاف أن نستنتج أن هذه النتائج السيئة يمكن أن يكون، جزئيا على الأقل، أن يعزى إلى انخفاض فعالية هذه الجينات الواقية، لا يمكن استبعاد فعالية منخفضة من هذه الأساليب توصيل الجينات.

لوحات السيارات نهاية (البرلمان الأوروبي) هي مناطق المتخصصة التابعة للmyofibres الهيكل العظمي التي يتم تحريكها من قبل المحطات محور عصبي من الألياف الحركية المحيطية الكبيرة القادمة من α الخلايا العصبية الحركية. معا، والنهايات الطرفية الألياف العصبية وأعضاء البرلمان الأوروبي تشكل الوصل العصبي العضلي، أي الموقع حيث يتم تشغيلها النبضات متشابك من قبل الافراج تقدمي من الناقل العصبي، الأستيل كولين. الأهم، والعلاقة بين الألياف العصبية الطرفية وأعضاء البرلمان الأوروبي هي ثنائية المباشرهtional، على الرغم من أن محركات مختلفة هي المسؤولة عن نقل الجزيئات وعضيات نحو وكذلك بعيدا عن العصبية somata 16-18. في ضوء هذه الاعتبارات التشريحية، ويبدو أن أعضاء البرلمان الأوروبي أن تكون الأهداف المفضلة للتسليم ونقل إلى الوراء لاحق من المادة الوراثية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة. في هذا السياق، فإنه ليس من المستغرب أن نجاح العصبون الحركي تنبيغ يعتمد إلى حد كبير على المسافة بين الحقن العضلي من ناقلات فيروسية وأعضاء البرلمان الأوروبي في العضلة 19-20. والمثير للدهشة، ومع ذلك، فإن الموقع الدقيق للمناطق MEP على myofibres من الفئران المخبرية والماوس، وهما نوعا من خيار لنموذج الأمراض العصبية والعضلية، لم تكن متاحة حتى وقت قريب.

أنتجنا خرائط شاملة للمنطقة MEP لعدة عضلات forelimb في الفئران والفأر 21-22. وفي الآونة الأخيرة، لقد أظهرنا تفاصيل تنظيم ص MEPegion لعدة عضلات hindlimb الماوس 23 ونحن في صدد تحليل ملامح البرلمان الأوروبي على hindlimb الفئران. في أيدينا، أعطى الحقن في العضل من استشفاف الوراء الموجهة إلى مناطق MEP بأكملها في هذه العضلات يؤدي إلى الخلايا العصبية الحركية أكثر المسمى التي تغطي قطاعات الحبل الشوكي أكثر مما ذكر سابقا. هنا نقدم البروتوكول الذي تم تطويره على مدى السنوات القليلة الماضية للكشف عن مكان وجود أعضاء البرلمان الأوروبي على السطح الخارجي، وكذلك في جميع أنحاء عمق hindlimb وforelimb العضلات في كل من الفأر والجرذ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الإجراءات التجريبية وصفها هنا امتثلت لجنة الرعاية وأخلاقيات الحيوان في نيو ساوث ويلز أستراليا وتم إجراء وفقا الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا لوائح التجارب على الحيوانات. يجب أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات في هذا البروتوكول وفقا لمتطلبات لجنة رعاية الحيوان والأخلاق ذات الصلة.

1. أستيل الكيمو تلطيخ

  1. إعداد خليط التفاعل أستيل
    1. إضافة 290 ملغ من Acetylthiocholine يوديد إلى 200 مل من 0.1 M الفوسفات عازلة (PB). الاختلاط مع محرك مغناطيسي في 900 دورة في الدقيقة.
    2. إضافة 600 ملغ من الجلايسين مع التحريك المستمر.
    3. إضافة ببطء 420 ملغ من كبريتات النحاس لخليط التفاعل مع التحريك المستمر حتى يذوب المنتج تماما.
  2. إزالة الجلد على الذبيحة (تم الحصول عليها من خلال تقاسم الأنسجة) عن طريق شقوقفي الجلد من الفئران perfused لأو الماوس، واستيعاب الجلد من منطقة الرقبة وتجعله الماضي قدميها. تأكد من أن لفافة تغطي كل العضلات إما إزالتها أو مثقبة بشكل كبير في ضمان التعرض وافرة من الألياف العضلية إلى محلول التفاعل.
  3. تزج كامل الجسم أو أحد أعضائه من الاهتمام الى خليط التفاعل واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
  4. غسل الذبيحة لمدة 2 دقيقة في الماء المقطر. ملاحظة: في هذه المرحلة، والعضلات يحمل يمكن أن ينظر إلى تلوين الأزرق واللوحات نهاية المحرك (البرلمان الأوروبي)، وبقع بيضاء.
  5. فضح الذبيحة إلى 10٪ محلول كبريتات الأمونيوم لمدة 3-5 ثانية.
    ملاحظة: إن الألياف العضلية تتحول بسرعة البني وسوف البرلمان الأوروبي يمكن ملاحظتها كنقاط الأرقط الأسود. إذا حدث رد فعل بسرعة كبيرة جدا، وملطخة ألياف العضلات مظلمة جدا التمييز بين أعضاء البرلمان الأوروبي وألياف العضلات حاول استخدام تركيزات أقل من الأمونيوم حل كبريتيد (على سبيل المثال، 5٪). في وقت رد الفعل للحصول علىعلى النقيض الأمثل بين أعضاء البرلمان الأوروبي وألياف العضلات يختلف من عينة واحدة إلى أخرى. وبالتالي فإنه من الصعب تحديد وقت التعرض المحدد للكاشف. وينبغي رصد رد الفعل بشكل وثيق، وتوقفت عند يعتبر على النقيض كافية.
  6. غسل الذبيحة مرتين، مع الإثارة في الماء المقطر، ويربت بلطف الذبيحة الجافة.
  7. صورة كل من النواحي الجانبية وسطي من أطرافهم، وضمان أن أعضاء البرلمان الأوروبي لجميع عضلات الفائدة يتم التقاطها.

2. العضلي الحقن في لوحات السيارات نهاية

  1. سحب بال micropipettes الزجاج مع مجتذب micropipette (استخدام بال micropipettes متدرج مع الغطاسون يوصى). بمساعدة المجهر تشريح، وكسر نصائح من بال micropipettes مع زوج من ملقط مثل أن القطر الداخلي من التجويف من micropipette ما يقرب من 0.5 مم.
  2. التأكد من أن جميع الأدوات الجراحية المستخدمة يتم تعقيمها طازجة والعشرينفي منطقة العمليات الجراحية غير المعقمة.
  3. شغل بال micropipettes مع الفلوري الذهب (5٪ في الماء المقطر).
  4. حمل خدر في الحيوان في غرفة الاستقراء مع Isofluorane (4٪ في O 2). تحقق من وجود المنعكس التقويمي وضمان عدم وجوده قبل إزالته من غرفة تحريض. تأمين مخروط الأنف على الخطم من الفئران وتسليم Isofluorane (2٪ في O 2) لصيانة التخدير. قرصة أصابع الحيوان وتلمس بلطف العين الحيوان لضمان أن كلا من انسحاب دواسة وردود الفعل القرنية غائبة. ملاحظة: يمكن أيضا مزيج من الكيتامين وxylazil أن تستخدم (80 و 10 ملغ / كغ على التوالي، تسليم البريتونى). الكيتامين هو الجدول 8 ("التحكم") المخدرات والبروتوكولات اللازمة المرتبطة بشراء واستخدام وتخزين والتخلص من المخدرات سيتعين الالتزام بها.
  5. تطبيق مواد التشحيم العين لمنع جفاف العينين أثناء الإجراء.
  6. حلق رأطرافهم argeted واستخدام الشاش لمسح منطقة حلق مع ثلاثة الدعك بالتناوب من بالكلورهيكسيدين و 70٪ كحول. نقل الحيوان إلى منطقة العمليات الجراحية.
  7. وضع الحيوان على underpad نظيفة ووضعها بشكل مناسب لضمان سهولة الوصول إلى العضلات المستهدفة (ق).
  8. استخدام زوج من ملقط مع قبضة الأسنان لرفع الجلد فوق العضلة المستهدفة بعيدا عن العضلات الكامنة وإجراء شق في الجلد مع مقص جراحي. تأكد من أن شق كبير بما فيه الكفاية لفضح تماما العضلات (ق) من الفائدة. ضمان وجود الحد الأدنى من تعطيل لفافة.
  9. استخدام الصور MEP لتبديل عقليا موقع وشكل المنطقة MEP على العضلات (ق).
    ملاحظة: A شعر علامة غرامة يمكن أن تساعد على إعادة إنتاج المنطقة MEP من صورة على العضلات (ق) من الفائدة.
  10. أداء الحقن متعددة على طول كامل المنطقة MEP (لالفلوري الذهب، 3-4 حقن 1-2 ميكرولتر كل لياليhould معها يكون كافيا). يمسح برفق العضلات (ق) لإزالة أي تسرب.
  11. جلب طرفي الجلد قطعي قريبة من بعضها البعض مع ملقط كليلة وإغلاق الجرح مع لقطات الجراحية. تسلل 0.1 مل بوبيفاكايين (0.5٪ في الماء) (أو التخدير الموضعي الأخرى) على طول فترة كاملة من الجرح.
  12. تحويل آلة التخدير قبالة ومراقبة الحيوانات حتى أنه قد تعافت تماما من التخدير.
  13. الانتظار لمدة 14 يوما بين إدارة الحقن داخل العضلات ونضح من الحيوانات.

3. Perfusions

  1. إدارة جرعة قاتلة من حل الصوديوم بنتوباربيتون (على سبيل المثال Lethabarb، 150 ملغ / كلغ) للحيوان عن طريق الحقن داخل الصفاق.
    1. عن كثب مراقبة الحيوانات حتى يتم التوصل إلى مستوى عميق من التخدير، وهو ما أكدته غياب انسحاب دواسة وردود الفعل القرنية.
  2. وضع الحيوان على ظهرها على لوحة تشريح وضعها فوق perfusioن الحوض.
  3. استخدام زوج من ملقط مع قبضة الأسنان لرفع الجلد الذي يغطي قاعدة القص. جعل شق الجلد صغير مع زوج من مقص جراحي قوية مباشرة أسفل عظم القص ثم استخدام ملقط لقبضة الغضروف الخنجري من القص. في حين الضغط على الغضروف الخنجري، وتوسيع شق على جانبي تجويف الصدر، من القص إلى الآباط.
  4. قطع الحجاب الحاجز لفضح القلب.
    1. حقن 0.ml الهيبارين مباشرة في قمة القلب لمنع تخثر الدم.
    2. قطع قمة للسماح للادراج قنية إلى البطين الأيسر، ومن ثم المشبك بسرعة قنية في مكان مع المعونة من haemostat.
    3. إجراء شق في الأذين الأيمن مع زوج من مقص غرامة والبدء فورا مضخة تحوي. يروي مع 0.1 M PB حتى السائل المتدفق من الأذين نقدمه مجانا تقريبا من الدم ولون الكبد يصبح البني الفاتح. ثم، يروي مع المحاليلنشوئها من امتصاص العرق (4٪ في 0.1 M PB) حتى الجسم كله من الحيوان يصبح جامدة.

4. الحبل الشوكي العنقي تشريح والتحضير للعلم الأنسجة

  1. وضع الذبيحة على البطن.
  2. قطع الجلد في خط الوسط في الجسم مع مشرط وتعكس ذلك من قاعدة الجمجمة إلى مستوى العظم الحرقفي.
  3. قطع طريق وتعكس عضلات مجاورة للفقرة للكشف عن الجانب الظهري للعمود الفقري.
  4. تعريف العملية الشائكة العظمية أطلس، والجزء الثاني عنق الرحم (أي، C2)، وإزالته مع زوج من رينجرز الجراحية أو ملقط لتحديد الجذر الظهري المقابلة الكامنة.
    1. تحديد جذر C2 الصحيح من خلال تلوين مع علامة شعر دائمة.
    2. إزالة الفقرات التالية واحدا تلو الآخر، وعلامة على الجذور الظهرية اليمنى بالتناوب مع الألوان (أي، C2، C4، C6، وC8 يمكن أن تكون ملونة باللون الأخضر وC3، C5، C7، T1 يمكن أن يكون العقيدored باللون الأزرق).
  5. استخدام إبرة جراحية صغيرة (على سبيل المثال، 30 G إبرة قياس) لبلطف بيرس خلال الجافية يغطي الطرف الأدنى من الحبل الشوكي. مع شطبة من الإبرة مواجهة، رفع الجافية بعيدا عن الحبل بينما تتحرك الإبرة rostrally لإجراء شق طولي.
    1. تعكس الجافية.
  6. قطع عرضيا الحبل الشوكي إلى كتل واحد أو اثنين من القطاعات بشفرة مشرط جديدة.
    1. ترك شرائح النخاع الشوكي في الموقع، ولكل كتلة، وجعل بعناية علامة إيمانية صغيرة على الجانب الأيسر من كل كتلة مع منتصف الطريق شفرة المشرط بين اثنين من جذور المجاورة. تأكد من أن علامة إيمانية عميقة بما فيه الكفاية من خلال النسيج لتكون مرئية من الناحية البطنية من الكتل. جعل علامة إيمانية في زاوية ما يقرب من 45 درجة مئوية، لافتا سواء الأمامية أو الخلف فيما يتعلق تشريح الحيوان، للمساعدة في توجيه قطاع النسيج بعد تشريح.
  7. جمع القطع الفردية في وزجاجات صغيرة علامات واضحة تحتوي على محلول بارافورمالدهيد (4٪ في 0.1 M PB) وترك في RT O / N.
  8. نقل كتل في زجاجات نظيفة، وصفت بوضوح يحتوي على محلول السكروز (30٪ في 0.1 M PB) والحفاظ على 4 درجات مئوية لمدة يومين على الأقل.
  9. وضع شرائح في البرد قوالب وغطوها تجميد الأنسجة المتوسطة. لإعداد النسيجي الطولي، توجيه الكتل مع الجانب الظهري مواجهة واستخدام علامة إيمانية لتوجيه كتلة في البرد قوالب.
  10. تجميد البرد قوالب عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، وقطع مع ناظم البرد في 50 أقسام ميكرومتر سميكة. ملاحظة: المقاطع يمكن تركيبه مباشرة على شرائح المجهر التصاق وتترك لتجف O / N. بدلا من ذلك، المقاطع يمكن طرح في لوحات 48-جيدا مليئة 0.1 M PB والتي شنت في وقت لاحق باستخدام علامة إيمانية لتوجيه أقسام الأنسجة على الشرائح.

5. قطني العمود الفقري المشاركطريق تشريح والتحضير للعلم الأنسجة

  1. وضع الذبيحة على انها الظهر.
  2. إجراء شق خط الوسط على طول البطن من الحيوان وإزالة الأحشاء. تشريح خارج عضلات جدار البطن الخلفي لفضح الجانب البطني من العمود الفقري.
  3. تحديد موقع القصير الذيلية الأكثر الصدري والمجاورة T13 فقرة لها حيث يخرج الجذر البطني T13 العظام.
    1. على التوالي إزالة واحدا تلو الآخر منقاري اثنين أو ثلاثة فقرات لT13 (أي، T12، T11، وإذا لزم الأمر، T10) مع رينجرز الجراحية الدقيقة لمتابعة الجذر البطني T13 حتى نقطة دخوله في الجانب البطني من الحبل البطني و وضع علامة عليه مع علامة شعر دائمة.
    2. من هذه النقطة، كرر نفس الإجراء لتحديد مكان وجود نقاط الدخول جذر بطني لL1، L2، L3، L4، L5، L6 وS1، والتلوين لهم بالتناوب مع الألوان.
  4. اتبع الإجراء نفسه كما هو موضح في القسم 4،5 حتي 4،10 للومشريط تشريح الحبل الشوكي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أستيل تلطيخ النسيجية يكشف موقع لوحات نهاية المحرك عبر عرض عضلات الشكل 1 يوضح نتائج هذا تلطيخ أجريت على الفئران forelimb كله. ويقترح لتحسين تركيز المحلول كبريتيد الأمونيوم (على سبيل المثال، 5-7٪ بدلا من 10٪)، وكذلك في وقت مغمورة العينة في حل إذا كان تلوين الخلفية غير محددة على ألياف العضلات هو أيضا مبالغا فيه. ويوضح الشكل 2 عمود من الخلايا العصبية الحركية وصفت في الحبل الشوكي العنقي بعد حقنة من الوراء التتبع الخلايا العصبية على طول المنطقة محرك نهاية اللوحة لثلاثية الرؤوس العضدية الماوس. الخلايا العصبية الحركية وصفت retrogradely تشكل عادة العمود الطولي الذي يمتد عبر شرائح متعددة من الحبل الشوكي. الشكل (3) يوضح أعداد مختلفة من الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري وصفت الحبل التي تم الحصول عليها من خلال قانون حالة الطوارئective الفلوري الذهب استهداف المنطقة محرك نهاية اللوحة في ثلاثية الرؤوس العضدية. وقد لوحظ امتصاص أقصى بعد الولادة في فترة كاملة من المنطقة MEP، بدلا من استهداف مقصورات المحددة للمنطقة MEP.

الشكل 1
الشكل 1: عرض من جانبي Forelimb من الفئران بعد أستيل الكيمو تلطيخ لوحات سيارات تنتهي قبل (A) وبعد (B) التعرض لكبريتيد الأمونيوم الحل. في (A)، لوحات محرك نهاية واضحة كنقاط الأرقط البيضاء التي تشكل خط المستمر الذي يعبر كامل عرض العضلات في حين تعتمد الألياف العضلية هوى الأخضر والأزرق. في (B)، وقدم نفسه forelimb بعد الغمر في محلول كبريتات الأمونيوم. بعد تطويرها في حل كبريتيد الأمونيوم، لوحات نهاية المحرك توأسود آكانيوز عبر الألياف العضلية البني. السهام في كل أجزاء من الأرقام تشير إلى موقع لوحات السيارات نهاية ل(1) Acromiotrapezius، (2) Spinodeltoideus و (3) ثلاثية الرؤوس العضد.

الرقم 2
يمثل Photomicrographs من 50 ميكرون المقطع الطولي خلال القرن بطني من الحبل الشوكي في مستويات عنق الرحم الكشف الفلوري الذهب المسمى موتور الخلايا العصبية WM المادة البيضاء وGM يمثل المادة الرمادية للنخاع الشوكي: الرقم 2. خط متقطع يدل على الحدود بين المادة الرمادية والمادة البيضاء داخل قسم الحبل الشوكي لاحظ في الشكل. اتخذ صورة مجهرية مع الهدف 10X تحت التصفية دابي في حين اتخذ أقحم مع الهدف 20X تحت نفس المرشح. في كل من لوحات، ووضع العلامات الفلورية الذهب ويمكن ملاحظة في العصبون الحركي السيتوبلازم وكذلك محور عصبي الداني / dendritiعمليات ج. الشكل كما نشرت أصلا في Tosolini وآخرون. (2013) استهداف طول كامل من المناطق لوحة سيارات في نهاية ماوس Forelimb يزيد من امتصاص الفلوري الذهب في المقابلة الحبل الشوكي موتور الخلايا العصبية الجبهة. Neurol. 04:58. دوى: 10.3389 / fneur.2013.00058

الشكل (3)
الرقم 3: الانتقائية الفلوري الذهب استهداف صفيحة منطقة موتور النهاية في العضد ثلاثية الرؤوس ووضع البطاقات التعريفية الناتجة في الحبل الشوكي الخلايا العصبية للسيارات (A) هو تمثيل تخطيطي للموقع من لوحات نهاية المحرك على ألياف العضلة ثلاثية الرؤوس العضدية. يتم تمثيل مختلف الأقسام الثلاثة من المنطقة MEP التي تم استهدافها بشكل فردي عن طريق النقاط الأخضر والأحمر والأزرق. تمثل النقاط الخضراء والحمراء الأمامي والخلفي نصفي المنطقة MEP بالكامل على التوالي، في حين أن النقاط الزرقاء represeالإقليم الشمالي في مكان الحقن البلعة من FG في بطن العضلات. السهم برأسين يرشد العضلات في المحور الأمامي الخلفي. (B) هو مخطط مركب يدل على العلامات التي تم الحصول عليها بعد الاستهداف الانتقائي لأجزاء مختلفة من المنطقة MEP للالعضدية ثلاثية الرؤوس، كما هو مبين في الفقرة (أ). كل نقطة في (ب) تمثل واحدة وصفت الخلايا العصبية الحركية. العمود الأسود ولاحظ ممثل لوضع العلامات النموذجية حقن التالية FG في غضون كامل المنطقة MEP من العضلات. يتم الحصول على أحمر عمود الخلايا العصبية الحركية التالية حقن FG في النصف الخلفي من العضلات، في حين يتم الحصول على الأخضر عمود الخلايا العصبية الحركية التالية حقن FG إلى النصف الأمامي للعضلة. الحقن يقتصر على "البطن" للعضلة أسفرت الخلايا العصبية الحركية إلا في عدد قليل من شرائح النخاع الشوكي، كما يتبين من العمود الأزرق. الشكل كما نشر في الأصلإد في Tosolini وآخرون. (2013) استهداف طول كامل من المناطق لوحة سيارات في نهاية ماوس Forelimb يزيد من امتصاص الفلوري الذهب في المقابلة الحبل الشوكي موتور الخلايا العصبية الجبهة. Neurol. 04:58. دوى: 10.3389 / fneur.2013.00058

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

استهداف العضلي ونقل إلى الوراء لاحق من الجينات المحورة العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة α لعلاج تجريبي للحالة العصبية والعضلية ليست استراتيجية جديدة. على سبيل المثال، تم استخدام هذا الأسلوب تسليم تأخير الضمور العضلي العصبي في مراحل مختلفة من تطور المرض في الفئران والجرذان SOD1 1،9-12 وكذلك في الفئران مع SMA 13. في حين واعدة، وفعالية هذه السيناريوهات العلاج الجيني كان محدودا. في هذا الصدد، فإننا نقترح أن الإقبال على الجينات المحورة من قبل الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري الحبل يمكن تحسينها من خلال استهداف انتقائي لوحات نهاية المحرك على الألياف العضلية. من المهم أن نلاحظ أنه في الدراسات المشار إليها أعلاه، وأجريت الحقن في العضل من ناقلات فيروسية دون الرجوع إلى موقع المنطقة MEP في العضلات المستهدفة.

في جميع أنحاء تحليلاتنا لتوزيع لوحات نهاية المحرك(البرلمان الأوروبي) من hindlimb وforelimb، ظهرت بضعة مبادئ. أولا، تمتد المنطقة MEP عبر كامل عرض العضلات. وعلاوة على ذلك، يتم محاذاة أعضاء البرلمان الأوروبي باستمرار متعامد فيما يتعلق اتجاه myofibres. والجدير بالذكر أن المنطقة MEP لا يقع دائما داخل سمكا جزء من العضلات، وهي منطقة غالبا ما يشار إليها باسم "بطن" والتي غالبا ما تكون هدفا لحقن البلعة العضلي. ومن الجدير بالذكر أن أجريت التحليلات الحالية على C57Bl6 الماوس 22-23 وايفانز طويل الفئران 21 ووجد أن توزيع أعضاء البرلمان الأوروبي وحفظها داخل كل من هذه السلالات اثنين من الحيوانات. ومع ذلك، ما إذا كانت أو لم يتم حفظها توزيع MEP بين سلالات مختلفة من الحيوانات داخل نفس النوع يبقى أن موثقة.

في الأصل، قمنا بتوثيق موقع المنطقة MEP لعدة عضلات forelimb وhindlimb من أجل توجيه صغير، MULالحقن في العضل tiple من الوراء التتبع العصبية الفلوري الذهب. هذه الخرائط MEP يمكن استخدامها لالجينات المحورة المكوك إلى الخلايا العصبية الحركية. وفي هذه الحالة، ومع ذلك، فمن المهم أن ضبط كميات من حقن وفقا لنوع من الفيروسات المستخدمة (على سبيل المثال، اتش، الفيروسة البطيئة، وما إلى ذلك) المصلي وكذلك عيار لها. الحفاظ على رباط سليمة هو وسيلة جيدة للحفاظ على الفيروس محصورا في حدود العضلات (ق) من الفائدة. طريقة أخرى لتجنب ترنسفكأيشن زائفة من الخلايا العصبية الحركية التعصيب العضلات جارة هي لمسح سطح العضلات بلطف بعد الحقن. هذه الاحتياطات قد تكون في غير محلها في بعض التصاميم التجريبية حيث تحقيق مستويات عالية من التنبيغ يمكن أن يكون أكثر أهمية من احتوائه ضمن مجموعة من الخلايا العصبية الحركية التي تغذي عضلة المستهدفة. ومع ذلك، فهي ممارسة جيدة لأسباب تتعلق بالسلامة واضحة. إذا تحتاج إلى أكثر من واحد عضلات معزولة ليتم حقنه، قد يكون من الحكمة، إذا كان ذلك ممكنا، لتحديدمجموعة من العضلات التي هي قريبة من بعضها البعض لتقليل حجم شق الجلد. الجرذان والفئران لها الجلد فضفاض جدا (أي، لا تعلق على العضلات)، ولذلك فمن السهل نسبيا لاستهداف العديد من العضلات دون الحاجة إلى إجراء شقوق الجلد ضخمة.

العلاج الجيني الفعال لALS والحالات العصبية والعضلية الأخرى التي تستخدم آلية إلى الوراء من الخلايا العصبية لا يزال يشكل تحديا كما، من الناحية المثالية، فإن هذا العلاج من شأنه نقل الجينات المفيدة عبر سكان الشوكي الخلايا العصبية الحركية الحبل. ومع ذلك، فإنه ليس من الضروري أن تستهدف جميع الخلايا العصبية الحركية لتحقيق مستويات مستدامة تنبيغ إذا كانت الجينات العلاجية في المصالح الترميز بروتين إفرازية مثل neurotrophins. وقد ثبت أن الخلايا العصبية الحركية في الواقع، غير transduced في محيط تلك التي تم transduced لاستيعاب جزيئات الخارجية من neurotrophins من خلال آلية نظير الصماوي 24. "تأثير تلك المارة" يعزز إلى حد كبير ايفيcacy من العضل استهداف لمكوك إفرازية ترميز البروتين الجينات إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة. من ناحية أخرى، نظرا لحقيقة أن فقدان السيطرة في الجهاز التنفسي هي السبب الأساسي للوفاة في ALS، يمكن أن يؤديها الحقن في العضل من يبني الفيروسية العلاجية في العضلات بين الضلوع 1 أو intrapleurally 25 لتحمي الخلايا العصبية الحركية المشاركة في التنفس. من خلال وصف وسيلة لتسليط الضوء بسهولة الموقع وتنظيم أعضاء البرلمان الأوروبي على عضلات الهيكل العظمي، فإن البروتوكول يثبت ليكون أداة قيمة لاستكشاف استراتيجيات العلاج الجيني جديدة للاختلالات العصبية والعضلية. يوفر هذا البروتوكول أيضا وسيلة الغازية الحد الأدنى للحفاظ على سلامة الوصل العصبي العضلي في هذه الدنيا الأمراض العصبية الحركية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مركز بحوث الصحة والطب الوطني (NHMRC) منحة المشروع إلى RM

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluoro-Gold Fluorochrome, LLC Nil Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl Drummond Scientific 5-000-1001-X10 accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide Sigma Life Science A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous Sigma-Aldrich 61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura Finetek 25608-930
Glycine Ajax Finechem 1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin Life Technologies D-3312 Diliuted in distilled water
Isothesia Provet ISOF00 1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips Texas Scientific Instruments, LLC 205016
Lethabarb Enthanasia Injection Virbac (Australia) Pty Ltd. LETHA450
Formaldehyde Solution Ajax Finechem A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides Menzel-Glaser J1800AMNZ
Ammonium Sulphide Sigma-Aldrich A1952 Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) Astrazenca Diluted to 0.25%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
  2. Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
  3. Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
  4. Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
  5. Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
  6. Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
  7. Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
  8. Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
  9. Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
  10. Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
  11. Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
  12. Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
  13. Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
  14. Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
  15. Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
  16. Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
  17. Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
  18. Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
  19. Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
  20. Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
  21. Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neuroscience. 200, 19-30 (2012).
  22. Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
  23. Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
  24. Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
  25. Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).

Tags

علم الأعصاب، العدد 101، الخلايا العصبية الحركية، لوحات نهاية المحرك والنقل إلى الوراء، والعضلات المخططة، الجرذان والفئران، hindlimb، forelimb
الحقن في العضل وإلى جانب لوحات السيارات نهاية: نهج المناظير لمكوك الراسمات مباشرة إلى الخلايا العصبية للسيارات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris,… More

Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons. J. Vis. Exp. (101), e52846, doi:10.3791/52846 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter