Abstract
척수 운동 뉴런의 무결성에 영향을주는 질환은 신경 쇠약 상태 사이. 지난 수십 년 동안, 이들 신경 근육 질환의 여러 동물 모델의 개발을 지연 시키거나 이러한 상태의 진행을 역전 겨냥한 다른 치료 시나리오와 과학계를 제공했다. 뉴런의 역행 기계 활용함으로써, 이러한 접근 중 하나는 척수 운동 뉴런에 대응하는 셔틀 치료 유전자 순서 골격근을 대상으로하고있다. 일단 유망하지만, 이러한 유전자 전달 방법의 성공은 지금까지 수득 보였다 형질 운동 뉴런의 차선 수에 의해 방해되어왔다. 모터 엔드 플레이트 (MEP들)는 운동 뉴런 α 척수 직접 시냅스 접촉 골격 근육에 고도의 전문 영역이다. 이와 관련하여,이 점에 유의하는 것이 중요하다 지금까지 노력하는 역행운동 뉴런에 전사 유전자 표적 근육 MEP 영역의 위치를 참조하지 않고 제조 하였다. 여기에서는 간단한 프로토콜 1) 골격근의 표면상의 최저 소비 효율 정확한 위치를 드러내 2) 운동 뉴런으로 근육 내 전달 및 역행 트레이서 후속 최적 역행 수송을 안내하기 위해이 정보를 사용을 설명한다. 우리는 유럽 의회 의원의 타겟팅을 통해 척수의 운동 신경 세포에 치료 유전자의 역행 전송 조사에 더 많은 연구에서 이러한 추적 실험의 결과를 활용할 수 있도록 노력하겠습니다.
Introduction
이러한 운동 신경 질환과 같은 신경 학적 조건에서 결과 spinal- 자발적인 운동뿐만 아니라 뒤센 근위축증 제어의 손실 영향을받는 개인의 일상 생활에 높고 오래 지속 영향을 쇠약 상태이다. 지난 10 년간, 중지 또는 적어도 이러한 신경 근육 질환의 해로운 영향을 지연하는 것을 목표로 연구 노력은 세계의 많은 의사와 과학자에 대한 우선 순위왔다. 이와 관련하여,이 신경 근육 질환을 모방 동물 모델의 최근의 발전은 이러한 조건 1-13의 발생과 진행을 기초로 생리적 인 메커니즘 근본적인 통찰력을 구하는 수단이되어왔다. 이들 신경 근육 질환의 치료는 척수에 직접 액세스를 필요로하며, 척수 주사 14,15 의해 달성 될 수있다. 유전자 치료의 최근 발전은 또한 상단의 가로 무늬 근육을 타겟으로하고척수 1,9-13의 복부 경적 내에 위치 대응 α 운동 신경 셔틀 치료 유전자 낮은 사지. 그러나, 일단이 유망한 전략은 이들 신경의 조건의 결과를 개선하지 못했다. 그것은 이러한 불량한 결과가 될 수 있다고 결론 공정 동안, 적어도 부분적으로, 이러한 보호 유전자의 낮은 효율에 기인 한 이러한 유전자 전달 방법의 낮은 효능을 배제 할 수 없다.
모터 엔드 플레이트 (유럽 의회 의원)는 운동 신경을 α에서 발생하는 대형 주변 모터 섬유의 축삭 터미널로 들여 골격 myofibres의 전문 영역입니다. 함께, 말초 신경 섬유 종말과 유럽 의회 의원은 즉, 신경 근육 접합부, 시냅스 자극이 신경 전달 물질의 선행 성 릴리스, 아세틸 콜린에 의해 트리거하는 사이트를 형성한다. 중요한 것은, 말초 신경 섬유 및 MEP들 사이의 관계를 임시 저장 양방향이고적인는 다른 모터뿐만 아니라 멀리 신경 세포에서 대한 분자와 세포 기관의 수송을 담당하지만, 16-18 인 somata. 이러한 해부학 적 고려 사항에 비추어, 유럽 의회 의원은 해당 운동 신경에 전달 및 유전 물질의 후속 역행 전송을 위해 선택의 대상이 될 것으로 보인다. 이러한 맥락에서, 운동 신경 전달의 성공은 크게 바이러스 벡터 및 근육의 MEP들 19-20의 근육 내 주사 사이의 거리에 의존한다는 놀라운 일이 아니다. 그러나 놀랍게도, 실험실 쥐 및 마우스에 myofibres MEP 영역의 정확한 위치는, 선택의 두 종의 신경 근육 질환 모델, 최근까지 사용할 수 없었다.
우리는 쥐와 마우스 21-22 여러 앞다리 근육의 MEP 지역의 종합적인지도를 제작했다. 최근에, 우리는 MEP (R)의 조직의 세부 사항을 보여 주었다마우스 뒷다리 (23)의 여러 근육 egion 우리는 현재 쥐의 뒷다리에있는 유럽 의회 의원의 기능을 분석하고 있습니다. 우리의 손에, 이러한 근육의 전체 MEP 영역에 관한 역행 추적자의 근육 내 주사는 이전에보고 된 것보다 더 많은 척수 세그먼트에 걸쳐있다 더 레이블 모터 뉴런에 상승했다. 여기에서 우리는 외부 표면 상에뿐만 아니라 뒷다리의 깊이에 걸쳐 최저 소비 효율을 표시 위치 및 마우스와 래트 모두에서 근육 앞다리은 지난 몇 년 동안 개발 된 프로토콜을 제시한다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 실험 절차는 UNSW 호주의 동물 관리 및 윤리위원회 준수하고 국민 건강과 동물 실험에 대한 의학 연구위원회 (Medical Research Council) 호주의 규정에 따라 수행되었다. 이 프로토콜의 모든 절차는 적절한 동물 관리 및 윤리위원회의 요구에 따라 수행되어야한다.
1. 아세틸 콜린 에스 테라 제 조직 화학 염색
- 아세틸 콜린 에스 테라 제의 반응 혼합물을 제조
- 0.1 M 인산 완충액 (PB)에 200 ml의 아세틸 티오 콜린 요오다 이드 290 mg을 추가. 900 rpm에서 교반기로 섞는다.
- 연속 교반 글리신 600 mg을 추가합니다.
- 생성물이 완전히 용해 될 때까지 천천히 교반하면서 연속 반응 액에 황산구리 420 mg을 추가.
- 동물 시체의 피부를 제거 절개를하여 (조직의 공유를 통해 얻은)관류 쥐 또는 마우스의 피부, 목 지역으로부터 피부를 잡고 그 다리를지나 당겨에. 각 근육을 덮고있는 근막을 제거하거나 크게 반응 용액에 근육 섬유의 충분한 노출을 보장하기 위해 천공 중 하나입니다 있는지 확인합니다.
- 반응 혼합물에 몸 전체 또는 관심의 다리를 담그고 4 ° C에서 O / N을 품어.
- 증류수에 2 분 동안 시체를 씻으십시오. 주의 :이 단계에서는, 근육 청색 착색 모터 엔드 플레이트 (MEP들)이 하얀 점으로 볼 수있다 나타낸다.
- 3 ~ 5 초 동안 10 % 암모늄 황화물의 용액에 시체를 노출.
참고 : 근육 섬유가 빠르게 갈색으로 바뀝니다과 유럽 의회 의원이 검은 얼룩 점으로 관찰 할 수있을 것입니다. 반응을 너무 빠르게 발생하여, 근육 섬유는 황화 암모늄 용액 (예, 5 %)의 낮은 농도를 사용하여 시도 MEP들 및 근섬유 구분할 너무 어둡게 염색하는 경우. 반응 시간을 얻을유럽 의회 의원과 근육 섬유 사이의 최적의 대비가 하나의 샘플에서 다른 다릅니다. 그러므로 시약 정확한 노출 시간을 정의하는 것은 곤란하다. 반응은 밀접하게 모니터링과 대비가 적절한 것으로 간주 할 때 중지해야합니다. - 증류수에 교반, 시체 두 번 세척하고 부드럽게 시체 건조 두드려.
- 사진 관심의 모든 근육에 대한 유럽 의회 의원이 캡처되는 것을 보장 사지의 외측과 내측 측면 모두.
2. 근육 주사 모터 엔드 플레이트에서
- 마이크로 피펫 풀러와 유리 마이크로 피펫을 당겨 (플런저와 등급 Micropipette과의 사용 권장). 해부 현미경의 도움으로, 마이크로 피펫의 루멘의 내부 직경이 약 0.5 mm가되도록 포셉 쌍 마이크로 피펫의 선단을 깰.
- 사용 된 모든 수술기구 갓 멸균 및 제되어 있는지 확인외과 영역에서 멸균입니다.
- 플루오로 - 골드 (증류수에 5 %)와 마이크로 피펫을 채 웁니다.
- 이소 플루오 란 (2 O 4 %)을 유도 챔버에 동물을 유도 anaesthetise. 반사를 바로 잡고 있는지 확인하고 유도 실에서 제거하기 전에이 없음을 확인합니다. 쥐의 주둥이를 통해 코 콘을 안전하고 마취의 유지 보수를위한 이소 플루오 란을 (O 2의 2 %) 제공합니다. 동물의 발가락을 꼬집어 부드럽게 페달 철수와 각막 반사가 모두없는 것을 확인하기 위해 동물의 눈을 누릅니다. 주 : 케타민과 xylazil의 혼합물도 사용될 수있다 (80 및 10 mg을 / kg 각각 복강 내 전달). 케타민은 일정 8 ( "통제") 약물 및 준수되어야 할 것이다 약물의 구매, 사용, 저장 및 폐기와 관련된 필요한 프로토콜입니다.
- 절차의 과정 동안 눈의 건조를 방지하기 위해 눈의 윤활유를 적용.
- T 쉐이브argeted 사지 사용 거즈 세 클로르헥시딘의 교류 스크럽 70 % 알코올로 면도 부위를 닦아합니다. 수술 영역으로 동물을 전송합니다.
- 깨끗한 underpad에 동물을 배치하고 대상 근육 (들)에 좋은 접근을 보장하기 위해 적절하게 배치합니다.
- 멀리 기본 근육에서 대상 근육을 통해 피부를 들어 올려 수술 가위로 피부 절개를 만들기 위해 치아 그립 포셉 한 쌍을 사용합니다. 절개가 완전히 관심의 근육 (들)을 노출 할 수있을만큼 충분히 큰지 확인합니다. 근막에 미치는 영향을 최소화이 있는지 확인하십시오.
- 정신적으로 근육 (들)에 MEP 지역의 위치와 모양을 바꾸어하는 MEP 사진을 사용합니다.
참고 : 좋은 느낌 마커가 관심의 근육 (들)에 사진에서 MEP 영역을 재현하는 데 도움 수 있습니다. - 각 S 1-2 μL의 3 ~ 4 주사, 플루오로 - 금 (MEP 지역의 전체 길이를 따라 여러 주사를 수행hould) 충분하다. 부드럽게 어떤 누출을 제거하는 근육 (들)을 닦으십시오.
- 가깝게 무딘 집게로 절개 피부의 두 끝을 가져와 수술 클립 상처를 닫습니다. 상처의 전체 기간에 따라 0.1 ml의 부피 바카 인 (물 0.5 %) (또는 다른 국소 마취제)을 침투.
- 오프 마취 기계의 전원을 켜고 완전히 마취에서 회복되는 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
- 내 근육 주사의 관리 및 동물의 관류 사이에 14 일 동안 기다립니다.
3. 관류
- 복강 주사에 의해 동물에게 (150 ㎎ / ㎏ 예 Lethabarb) 펜토 바르비 나트륨 용액의 치사량을 투여.
- 페달 금단의 부재 및 각막 반사에 의해 확인 된 바와 같이 마취 깊은 레벨에 도달 할 때까지 동물을 밀접하게 감시한다.
- perfusio에 둔 해부 보드의 뒷면에있는 동물의 위치를N 싱크.
- 흉골의 기반을 덮고있는 피부를 들어 올려 치아 그립 포셉 한 쌍을 사용합니다. 바로 흉골 아래 강한 수술 가위와 작은 피부 절개를 한 후 그립 흉골의 칼 모양의 연골을 집게를 사용합니다. 칼 모양의 연골을 누른 상태에서 겨드랑이에 흉골에서, 흉강의 양면에 절개를 확대.
- 마음을 노출 다이어프램을 잘라.
- 혈액의 응고를 방지하기 위해 직접 심장의 정점에 헤파린의 0.ml을 주입한다.
- 좌심실에 캐 뉼러의 삽입을 허용하는 정점을 차단하고 신속 haemostat의 도움으로 장소에 캐 뉼러를 클램프.
- 미세 가위로 오른쪽 아트리움에 절개를 즉시 연동 펌프를 시작합니다. 아트리움에서 흐르는 액체가 혈액의 거의 무료이며 간장의 색이 밝은 갈색이 될 때까지 0.1 M PB로 관류. 이어서, SOLU으로 관류동물의 몸 전체까지 파라 포름 알데히드 (0.1 M PB의 4 %)의 기 경질된다.
4. 경추 척수 해부 및 조직학 준비
- 복부에 동물의 시체를 놓습니다.
- 메스와 신체의 정중선에서 피부를 잘라 장골의 수준으로 두개골의 기지에서 그것을 반영한다.
- 을 극복하고 척추의 등 부분을 노출 척추 주위 근육을 반영합니다.
- 아틀라스, 두 번째 자궁 세그먼트 (즉, C2)의 뼈 극돌기를 식별하고 대응하는 기본 등의 루트를 찾기 위해 수술 rongeurs이나 집게 한 쌍을 제거합니다.
- 영구 펠트 마커로 색칠하여 오른쪽 (C2) 루트를 확인합니다.
- 하나 다음 척추를 제거하고 교류 색상 (즉, C2는, C4가, C6 및 C8은 녹색과 C3에 색 수와 오른쪽 지느러미 뿌리를 표시, C5는 C7은 T1이 COL 될 수 있습니다OR 연산 파란색).
- 작은 외과 용 바늘을 사용하여 (예를 들어, 30 게이지 바늘 G)를 부드럽게 관통 척수의 하단부를 덮는 경질 내지. 종 방향 슬릿을 만들기 위해 rostrally 바늘을 이동하는 동안이 위를 향하도록 바늘의 베벨으로, 코드에서 멀리 경질을 들어 올립니다.
- 경질을 반영한다.
- 새로운 메스 블레이드 단면 또는 두 개의 세그먼트 블록으로 척수의 횡 방향으로 잘라.
- 신중 개의 인접한 뿌리 사이 메스 블레이드 반쯤 각 블록의 좌측에 작은 기준 마크를 위해선, 각각의 블록에 대해, 인 시츄 척수 세그먼트두고. 블록의 복부 측면에서 볼 수 있도록로 기준 마크가 조직을 통해 충분히 깊은 있는지 확인하십시오. 다음 해부 조직 세그먼트의 배향을 돕기 위해, 동물의 해부에 대해 전방 또는 후방 중 하나를 가리키는, 약 45 °의 각도에서 기준 마크를 확인.
- 파라 포름 알데히드 (0.1 M PB 4 %)의 용액을 포함하는 작은, 명확하게 표시된 병에 개별 블록을 수집하고 RT O / N에 둡니다.
- 수크로오스 (0.1 M PB 30 %)의 용액을 함유하는 깨끗한 병에 명확히 표시된 블록을 전송하고 적어도 이틀 동안 4 ℃에서 보관.
- 극저온 금형의 세그먼트를 놓고 조직 동결 매체로 덮여. 길이 방향의 조직 학적 준비를 들어,이 위를 향 등의 측면과 블록의 방향 및 극저온 금형의 블록 방향을 기준 마크를 사용합니다.
- -20 ℃에서 냉동 - 금형을 동결하고 50 μm의 두께 섹션에서 저온 유지 장치로 절단. 주 : 단면에 직접 부착 현미경 슬라이드 상에 장착 및 / N을 O 건조 남아있을 수있다. 대안 적으로, 섹션 0.1 M PB 가득 48- 웰 플레이트에 부유 할 수 있고,이어서 슬라이드 조직 절편 방향을 기준 마크를 사용하여 장착.
5. 요추 공동RD 해부 및 조직학 준비
- 가 돌아왔다에 동물의 시체를 놓습니다.
- 동물의 복부를 따라 중간 선 절개를 수행하고 내장을 제거합니다. 척추의 복부 측면을 노출 후부 복부 벽의 근육을 해부하다.
- T13 복부 루트 뼈를 종료 짧은 꼬리 가장 리브와 인접 T13 척추를 찾습니다.
- 연속 (T13)에 의해 두 개 또는 세 개의 척추 주동이을 하나를 제거 (즉, T12, T11 및 필요한 경우, T10) 미세 수술 rongeurs와는 복부 코드의 복부 측면에있는 항목의 점까지 T13 복부 루트를 따라와 영구 펠트 마커를 표시합니다.
- 이 시점부터, 교호 컬러로 채색, L1, L2, L3, L4, L5, L6 및 S1에 대한 복부 루트 엔트리 포인트의 위치를 식별하기 위해 동일한 절차를 반복한다.
- 4.5-4.10 LUM 절에 설명 된 것과 동일한 절차를 따라척수 해부 바.
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Representative Results
아세틸 콜린 에스 테라 조직 화학적 염색은 근육의 폭을 가로 지르는 운동 단부 판의 위치를 알 수있다. (1) 전체의 래트 앞다리 수행 이러한 염색의 결과를 도시한다. 그것은 암모늄 황화물 용액의 농도를 최적화하기 위해 제안된다 (예., 5~7% 대신 10 %)뿐만 아니라 시편 용액에 침지하는 시간은 근육 섬유에 비특이적 백그라운드 염색이 너무이면 과도한.도 2는 마우스 상완 삼두근 근육 모터 엔드 플레이트 영역의 길이를 따라 역행 신경 추적자 주사 후 경추 척수 표지 운동 뉴런의 열을 도시한다. 역행 표지 운동 뉴런은 전형적. 척수의 여러 세그먼트를 가로 질러 연장하는 종 방향 열을 형성하는 3 SEL 통해 얻은 표지 척수 운동 뉴런의 상이한 수를 도시한다상완 삼두근에 모터 엔드 플레이트 영역 표적화 ective 플루오 골드. MEP 영역의 특정 구획 타겟팅 반대로 극대 흡수는 MEP 영역의 전체 폭에 전달 다음 관찰 하였다.
그림 1 : 모터 엔드 플레이트 아세틸 콜린 에스 테라 제 조직 화학적 염색 후 쥐의 측면 앞다리보기 () 이전과 암모늄 황화물 용액 (B) 노출 후. (A)에서, 상기 모터 엔드 플레이트는 근섬유가 녹색 - 청색 색조를 채택하면서 근육의 전체 폭을 가로 지르는 연속 선을 형성하는 백색 반점 도트로서 명백하다. (B)에서, 동일한 앞다리는 황화 암모늄 용액에 침지 한 후에 제시된다. 황화 암모늄 용액의 현상 후, 상기 모터 엔드 플레이트 TU갈색 근육 섬유를 통해 RN 검은. 도면의 양쪽 부분에서 화살표 (1) Acromiotrapezius, (2) Spinodeltoideus 및 (3) 상완 삼두근 용 모터 단부 판의 위치를 가리.
그림 2 :. 플루오로 - 골드 라벨 모터 뉴런 WM을 공개 자궁 수준에서 척수의 복부 혼을 통해 50 μm의 종단면의 현미경 사진은 백질을 나타내고 GM은 척수의 회색 문제를 나타냅니다. 점선은 도면에서 관찰 척수 부 내의 회색 및 백색 물질 사이의 경계를 나타낸다. 삽입이 같은 필터에서 20 배의 목적으로 찍은 반면 현미경은 DAPI 필터에서 10 배 목표로 촬영했다. 양 패널에서, 플루오로 - 금 라벨은 근위 축삭 / dendriti뿐만 아니라 운동 신경 세포질에서 관찰 될 수있다C 프로세스. 같은 원래 Tosolini 등 출판 그림. 마우스 앞다리의 모터 엔드 플레이트 지역의 전체 길이를 타겟팅 (2013) 척수 모터 뉴런 전면 대응에 플루오로 - 골드의 흡수를 증가시킵니다. Neurol. 4시 58분. 도이 : 10.3389 / fneur.2013.00058
도 3 :. 선택적 플루오 금 삼두근 상완에 모터 단판 영역 및 척수 모터 뉴런에서 얻어진 라벨링 표적화 (A)는 삼두근 상완 섬유에 모터 단부 판의 위치의 개략도이다. 개별적으로 대상으로 한 MEP 영역의 세 가지 섹션, 녹색, 붉은 색과 파란색 점으로 표시됩니다. 파란색 점 represe 동안 녹색과 빨간색 점은 각각 전체 MEP 지역의 전방 및 후방 절반을 나타냅니다근육의 배꼽에 FG의 일시 주사 위치를 NT. 양방향 화살표는 전후방 축에서 근육을 놓고 방향. (B)는 (A)에 나타낸 바와 같이, 상완 삼두근의 MEP 영역의 다른 부분의 선택적 타겟팅 다음 얻어진 라벨을 나타내는 복합도이다. (B)의 각 점은 하나의 표지 된 운동 신경을 나타낸다. 검은 열은 전형적인 라벨의 대표가 근육의 MEP 지역의 전체 범위에 FG의 다음과 같은 주사를 관찰된다. 녹색 운동 신경 열이 근육의 앞쪽 절반에 FG 주사 다음 획득 동안 붉은 운동 신경 열은, 근육의 뒤쪽 절반에 FG 주사를 다음을 얻을 수있다. 청색 열에 의해 입증 된 바와 같이 근육 "배"로 제한 주사제, 척수 세그먼트 단지 소수의 운동 뉴런을 얻었다. 원래 게시 같이도Tosolini 등의 에디션. 마우스 앞다리의 모터 엔드 플레이트 지역의 전체 길이를 타겟팅 (2013) 척수 모터 뉴런 전면 대응에 플루오로 - 골드의 흡수를 증가시킵니다. Neurol. 4시 58분. 도이 : 10.3389 / fneur.2013.00058
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Discussion
근육 타겟팅 및 신경 근육 상태의 실험적인 치료에 해당하는 α 운동 신경에 치료 유전자의 후속 역행 전송은 새로운 전략이 아니다. 예를 들어, 이러한 전달 방법은 SOD1의 마우스 및 래트에서 1,9-12 ALS 진행의 다른 단계에서뿐만 아니라 SMA 13 마우스에서 신경 근육 퇴행을 지연시키기 위해 사용되어왔다. 유망한 동안, 이러한 유전자 치료 시나리오의 효능은 제한되었다. 이러한 관점에서, 우리는 척수 운동 뉴런에 의한 도입 유전자의 흡수는 근섬유의 모터 단부 판의 선택적 타겟팅함으로써 개선 될 수 있음을 제안한다. 이는 전술 한 연구에서, 바이러스 벡터의 근육 내 주사가 표적 근육 MEP 영역의 위치에 대한 참조없이 수행 된 것을 주목하는 것이 중요하다.
모터의 단부 판 분포의 고객 분석을 통하여뒷다리와 앞다리의 (유럽 의회 의원)는 몇 가지 원칙이 등장했다. 먼저, MEP 영역은 근육의 전체 폭에 걸쳐있는. 또한, MEP들 일관 myofibres의 방향에 관하여 직교 정렬된다. 특히, MEP 영역 항상 근육의 가장 두꺼운 부분에 위치하지 않은, 영역은 종종 '배'로하고, 이는 종종 루스 근육 내 주사의 대상이다. 그것은 현재의 분석은 21 쥐 C57BL6 마우스 22 ~ 23과 긴 에반스 실시하고이를 유럽 의회 의원의 분포가 동물의이 두 균주의 각 내에 보존되어 발견 된 것을 주목할 필요가있다. 그러나, MEP 분포가 같은 종 내의 동물의 다른 균주 사이에 보존되어 있는지의 여부 문서화 남아있다.
원래, 우리는 작은, MUL을 안내하기 위해 앞다리와 뒷다리의 여러 근육을 위해 MEP 영역의 위치를 기록했다역행 신경 추적 플루오로 - 골드의여 러 근육 내 주사. 이 MEP 맵은 운동 뉴런에 셔틀 유전자로 사용할 수있다. 이러한 예에서, 그러나, 사용 된 바이러스의 종류 (예., 아데노 바이러스, 렌티 바이러스, 등)의 혈청 형뿐만 아니라, 그 굵기에 따라 주사의 양을 조절하는 것이 중요하다. 근막은 그대로 유지하는 것은 관심의 근육 (들)의 범위 내에서 제한 바이러스를 유지하는 좋은 방법이다. 운동 뉴런의 스퓨리어스 형질 감염을 방지하는 또 다른 방법은 인접 부드럽게 근육 주사 후 근육의 표면을 닦아 지배하는 것이다. 대상 근육을 공급하는 운동 신경의 풀 내에서이를 함유하는 것보다 더 관련이있을 수있는 전달의 높은 수준을 달성하는 경우주의 사항은 몇 가지 실험적인 디자인에 관련이있을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 확실한 안전을 위해 좋은 방법이다. 더 이상 고립 된 근육 주사해야하는 경우, 가능한 경우, 선택, 현명 수 있습니다피부 절개의 크기를 최소화하기 위해 서로에 가까운 근육의 그룹. 쥐들은 (아니라 근육에 부착 즉.) 매우 느슨한 피부를 가지고, 그래서 큰 피부 절개를 수행 할 필요없이 여러 근육을 대상으로 비교적 용이하다.
이상적으로, 이러한 치료는 척수 운동 뉴런의 전체 모집단에 걸쳐 유익한 유전자를 전송할 것 같은 신경 퇴행성 기계를 사용 ALS 및 기타 신경 근육 조건 효과적인 유전자 치료는 과제로 남아. 그러나, 예컨대 뉴로로서 관심 치료 유전자가 분비 단백질을 코딩하는 경우 전달의 지속적인 수준을 달성하기 위해 모든 운동 뉴런을 타겟팅 할 필요가 없다. 형질 도입 된 것들의 근방 실제로는 비 - 형질 운동 뉴런이 분비기구 (24)를 통해 뉴로 외인성 분자의 내재화하는 것으로 나타났다. 이 '방관자 효과'크게 effi을 향상운동 뉴런 대응에 셔틀 분비 단백질을 코딩하는 유전자를 대상으로 근육의 cacy. 한편, 호흡 제어의 손실은 ALS에서 사망의 궁극적 인 원인이라는 사실이 주어 치료 바이러스 작 제물의 근육 내 주사가 늑간 근육 하나에서 수행 될 수 또는 intrapleurally 25 호흡에 관여하는 운동 뉴런을 보호하기 위해. 쉽게 골격 근육의 유럽 의회 의원의 위치 및 조직을 강조하는 방법을 설명함으로써, 본 프로토콜은 신경 근육 기능 장애에 대한 새로운 유전자 치료 전략을 모색 할 수있는 유용한 도구가 될 증명할 것입니다. 이 프로토콜은 또한 이들 하위 운동 신경 질환에서 신경 근육 접합부의 무결성을 유지하기 위해 최소 침습적 방법을 제공한다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 RM에 국민 건강 및 의료 연구 센터 (NHMRC) 프로젝트 연구비 지원
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10 µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
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- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
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