Abstract
Sygdomme, der påvirker integriteten af rygmarven motoriske neuroner er blandt de mest invaliderende neurologiske tilstande. I de sidste årtier har udviklingen af adskillige dyremodeller for disse neuromuskulære lidelser billede det videnskabelige samfund med forskellige terapeutiske scenarier formål at forsinke eller vende progressionen af disse betingelser. Ved at udnytte den retrograd maskiner af neuroner, er et af disse fremgangsmåder været at målrette skeletmuskulatur med henblik på at shuttle terapeutiske gener ind i tilsvarende rygmarven motoriske neuroner. Selv når lovende, har succes sådan gen-levering tilgang blevet vanskeliggjort af sub-optimale antal transducerede motoriske neuroner det har hidtil vist sig at give efter. Motor endeplader (MEP) er højt specialiserede regioner på skeletmuskulaturen der er i direkte synaptisk kontakt til rygmarven α motoriske neuroner. I denne forbindelse er det vigtigt at bemærke, at indtil videre, at indsatsen retrogradoverførsel gener i motorneuroner blev foretaget uden henvisning til placeringen af MEP-regionen i de målrettede muskler. Her beskriver vi en simpel protokol 1) for at afsløre den nøjagtige placering af MEP'er på overfladen af skeletmuskulatur og 2) at bruge disse oplysninger til at guide intramuskulær levering og efterfølgende optimal retrograd transport af retrograde sporstoffer i motoriske neuroner. Vi håber at udnytte resultaterne fra disse sporing eksperimenter i yderligere undersøgelser i undersøge retrograd transport af terapeutiske gener til rygmarven motoriske neuroner gennem målretning af parlamentsmedlemmer.
Introduction
Tabet af kontrol over frivillige bevægelser, at resultaterne fra neurologiske tilstande såsom motor neuron sygdom og spinal- samt Duchenne muskelsvind er en invaliderende lidelse, der har høj og langvarig indflydelse på hverdagen for de ramte personer. I det seneste årti har forskningsindsatsen til formål at stoppe eller i det mindste forsinke de skadelige virkninger af disse neuromuskulære sygdomme været en prioritet for mange klinikere og forskere verden over. I denne forbindelse har den seneste generation af dyremodeller, der efterligner disse neuromuskulære sygdomme været medvirkende til at opnå grundlæggende indsigt i de fysiologiske mekanismer bag udviklingen og progressionen af disse betingelser 1-13. Behandling af disse neuromuskulære sygdomme kræver direkte adgang til rygmarven og kan opnås ved rygmarv injektioner 14,15. Nylige fremskridt inden for genterapi har også målrettet de tværstribede muskler i øvre ogunderekstremiteterne til shuttle terapeutiske gener til de tilsvarende α motoriske neuroner, der er placeret inden for den ventrale horn af rygmarven 1,9-13. Dette har imidlertid endnu en lovende strategi undladt at forbedre resultatet af disse neurologiske tilstande. Selv om det er rimeligt at konkludere, at disse fattige kunne blive, i det mindste delvis, tilskrives den lave effektivitet af disse beskyttende gener, kan man ikke udelukke den lave effektivitet af disse gen-levering metoder.
Motor endeplader (MEP'er) er specialiserede områder af skelet myofibre der er indrykket af Axon terminaler store perifere motoriske fibre stammer fra α motoriske neuroner. Sammen, de perifere nerve fiber afslutninger og parlamentsmedlemmerne danner den neuromuskulære forbindelse, dvs., det sted, hvor synaptiske impulser udløst af anterograd frigivelsen af neurotransmitteren acetylcholin. Vigtigt er det, at forholdet mellem perifere nervefibre og parlamentsmedlemmerne er bi-direktnelle, selvom forskellige motorer er ansvarlig for transporten af molekyler og organeller mod samt væk fra neuron somata 16-18. I lyset af disse anatomiske overvejelser, MEP'erne synes at være mål for valg til levering og efterfølgende retrograd transport af genetisk materiale til de tilsvarende motoriske neuroner. I denne sammenhæng er det ikke overraskende, at succesen af motorneuroner transduktion i høj grad afhænger af afstanden mellem den intramuskulære injektion af virale vektorer og musklens MEP'er 19-20. Imidlertid overraskende, den nøjagtige placering af MEP zoner på myofibre laboratoriets rotter og mus, de to arter af valg at modellere neuromuskulære sygdomme, ikke var tilgængelige indtil for nylig.
Vi har produceret omfattende kort over MEP-regionen i flere forben muskler i rotter og mus 21-22. For nylig har vi vist detaljerne i organiseringen af MEP rEgion flere muskler i musen bagben 23 og vi er i øjeblikket analyserer funktionerne i parlamentsmedlemmerne på rotte bagben. I vores hænder, intramuskulære injektioner af retrograd sporstoffer rettet til hele MEP zoner i disse muskler gav anledning til mere mærkede motoriske neuroner, der spænder over mere rygmarv segmenter end tidligere rapporteret. Her præsenterer vi den protokol, der er blevet udviklet i de seneste år til at vise beliggenheden af medlemmerne på den ydre overflade samt hele dybden af bagbenet og forben musklerne i både mus og rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer beskrevet her overholdt Animal Care og etiske komité for UNSW Australien og blev udført i overensstemmelse med National Health og Medical Research Council i Australien regler for dyreforsøg. Alle procedurerne i denne protokol skal udføres i overensstemmelse med kravet i den relevante Animal Care og etiske komité.
1. Acetylcholinesterase histokemisk farvning
- Forbered Acetylcholinesterase reaktionsblandingen
- Tilføj 290 mg acetylthiocholiniodid til 200 ml 0,1 M phosphatpuffer (PB). Bland med en magnetomrører ved 900 rpm.
- Tilsættes 600 mg af glycin under kontinuerlig omrøring.
- Tilsæt langsomt 420 mg kobbersulfat til reaktionsblandingen under kontinuerlig omrøring, indtil produktet er fuldstændig opløst.
- Fjerne huden på dyrekroppen (opnået gennem væv deling) ved at gøre indsnitind i huden på en perfunderet rotte eller mus, gribe skindet fra halsområdet og trække den forbi sine fødder. Sørg for, at fascia dækker hver muskel er enten fjernet eller væsentligt perforeret for at sikre rigelig eksponering af muskelfibre til reaktionsopløsningen.
- Nedsænkes hele kroppen eller led af interesse i reaktionsblandingen og inkuberes O / N ved 4 ° C.
- Vask slagtekroppen i 2 minutter i destilleret vand. Bemærk: I denne fase, musklerne udviser en blå farve, og motorens endeplader (MEP) kan ses som hvide prikker.
- Udsætte slagtekroppen til en 10% ammoniumsulfid opløsning i 3-5 sek.
Bemærk: De muskelfibre vil hurtigt blive brune og parlamentsmedlemmerne vil være observerbare som sorte plettet prikker. Hvis reaktionen forløber for hurtigt, og muskelfibrene farves for mørkt til at skelne mellem medlemmerne og muskelfibrene prøve at bruge lavere koncentrationer af ammoniumsulfid-opløsning (fx 5%). Reaktionstiden for at få denoptimal kontrast mellem MEP'er og muskelfibrene varierer fra prøve til den anden. Det er derfor vanskeligt at definere den nøjagtige eksponeringstid til reagenset. Reaktionen bør overvåges nøje, og stoppes, når kontrasten skønnes tilstrækkelig. - Vask slagtekroppen to gange under omrøring i destilleret vand og blidt pat slagtekroppen tør.
- Fotografi både laterale og mediale aspekter af lemmer, der sikrer, at de medlemmer af Parlamentet for alle muskler af interesse fanget.
2. intramuskulære injektioner på Motor End Plates
- Træk glasmikropipetter med en mikropipette aftrækker (brugen af graduerede mikropipetter med stempler anbefales). Med hjælp af et dissektionsmikroskop, bryde spidsen af mikropipetter med en pincet således at den indre diameter af lumen af mikropipetten er ca. 0,5 mm.
- Sørg for at alle kirurgiske instrumenter, der anvendes frisk autoklaveres og thpå det kirurgiske område er steril.
- Fyld mikropipetter forsynet med Fluoro-Gold (5% i destilleret vand).
- Fremkalde bedøve i dyret i en induktion kammer med isofluoran (4% i O 2). Check for stabilitetsrefleks og sikre dens fravær, før du fjerner den fra induktion kammer. Sikre en næse kegle over snuden af rotte og levere isofluoran (2% i O 2) til vedligeholdelse af anæstesi. Klem dyrets tæer og forsigtigt røre dyrets øje for at sikre, at både tilbagetrækning pedal og hornhinden reflekser er fraværende. Bemærk: En blanding af ketamin og xylazil kan også anvendes (80 og 10 mg / kg, blev indgivet intraperitonealt). Ketamin er et Schedule 8 ("kontrolleret") narkotika og nødvendige protokoller er forbundet med købet, anvendelse, opbevaring og bortskaffelse af lægemidlet skal overholdes.
- Anvend øjet smøremiddel for at forhindre udtørring af øjnene i løbet af proceduren.
- Barbere targeted lem og brug gaze at tørre barberede område med tre skiftende scrubs af chlorhexidin og 70% alkohol. Overfør dyret til det kirurgiske område.
- Placer dyret på et rent underlag og placere det korrekt at sikre god adgang til målrettede muskler (r).
- Brug en tang med tand greb til at løfte huden over den pågældende muskel væk fra den underliggende muskulatur og lave et snit i huden med kirurgiske sakse. Sikre, at snittet er stor nok til helt at eksponere musklen (r) af interesse. Sørg for, at der er minimal forstyrrelse af fascia.
- Bruge fotografierne MEP til mentalt gennemføre placeringen og formen af MEP region på musklen (s).
Bemærk: En fin filt markør kunne hjælpe til at gengive MEP regionen fra fotografiet på musklen (r) af interesse. - Udføre multiple injektioner langs den fulde længde af MEP-regionen (for Fluor-Gold, 3 til 4 injektioner af 1-2 pi hver should være tilstrækkeligt). Tør forsigtigt musklen (r) for at fjerne enhver udsivning.
- Bringe de to ender af indsnit hud tæt sammen med stumpe pincet og lukke såret med kirurgiske clips. Infiltrere 0,1 ml Bupivacain (0,5% i vand) (eller andre lokalanæstetika) langs hele spektret af såret.
- Drej bedøvelsesmiddel maskinen og overvåge dyret indtil det har er helt efter anæstesi.
- Vent i 14 dage mellem indgift af intra-muskulære injektioner og perfusion af dyrene.
3. perfusionsopløsning
- Administrere en dødelig dosis af pentobarbitonnatrium opløsning (f.eks Lethabarb; 150 mg / kg) til dyret ved intraperitoneal injektion.
- Nøje overvåge dyret indtil et dybt plan af anæstesi er nået, hvilket bekræftes af den manglende tilbagetrækning pedalen og hornhinden reflekser.
- Placer dyret på ryggen på en dissekere bord placeret over en perfusion sink.
- Brug en tang med tand greb til at løfte huden, der dækker bunden af brystbenet. Lav en lille incision i huden med et par stærke kirurgiske sakse umiddelbart under brystbenet og derefter bruge tangen til at gribe formet som et sværd brusk af brystbenet. Mens du holder formet som et sværd brusk, forstørre snittet på begge sider af brysthulen, fra brystbenet til armhulerne.
- Skære membranen for at blotlægge hjertet.
- Injicer 0.ml af heparin direkte ind i spidsen af hjertet for at forhindre koagulation af blodet.
- Skær spidsen for at tillade indsættelse af en kanyle i den venstre ventrikel, og derefter hurtigt klemme kanylen på plads ved hjælp af en hæmostat.
- Lave et snit i højre atrium med et par fine sakse og starte den peristaltiske pumpe. Perfundere med 0,1 M PB indtil væsken strømmer ud af atrium er næsten fri for blod og farven af leveren bliver lys brun. Derefter perfundere med en Solution paraformaldehyd (4% i 0,1 M PB), indtil hele kroppen af dyret bliver stiv.
4. Cervikal Spinal Cord Dissektion og Forberedelse til histologi
- Lå dyrekroppen på dens mave.
- Skære huden ved legemets midtlinje med en skalpel og reflektere det fra bunden af kraniet til niveauet af hoftebenet.
- Skære igennem og afspejler de paravertebrale muskler til at udsætte dorsale aspekt af rygsøjlen.
- Identificere den benede spinosus proces med Atlas, den anden cervikale segment (dvs. C2), og fjern det med et par kirurgiske rongeurs eller tang til at finde den tilsvarende underliggende dorsale rod.
- Identificere den rigtige C2 roden ved at farve det med en permanent filt markør.
- Fjern den næste ryghvirvler én efter én og markere de rigtige dorsale rødder med skiftende farver (dvs. C2, C4, C6, og C8 kan være farvet i grønt og C3, C5, C7, T1 kan være colORed med blåt).
- Brug en lille kirurgisk nål (f.eks, 30 G gauge nål) til forsigtigt gennembore gennem dura dækker den nedre ende af rygmarven. Med facet af nålen opad, løftes dura væk fra ledningen under flytning af nålen rostrally at gøre en langsgående spalte.
- Afspejle dura.
- Skær rygmarven tværs i en- eller to-segmenters blokke med en ny skalpelblad.
- Lad rygmarv segmenter i situ og, for hver blok, omhyggeligt lave en lille referencemærke på venstre side af hver blok med skalpelblad halvvejs mellem to tilstødende rødder. Sikre, at det referencemærke er dybt nok gennem vævet for at være synlig fra den ventrale aspekt af blokkene. Gøre referencemærke i en vinkel på ca. 45 °, peger enten anteriort eller posteriort i forhold til animalsk anatomi, for at hjælpe med orienteringen af vævet segment efter dissektion.
- Saml de enkelte blokke i små, tydeligt mærket flasker med en opløsning af paraformaldehyd (4% i 0,1 M PB) og henstår ved RT O / N.
- Overfør blokkene i rene, tydeligt mærket flasker med en opløsning af saccharose (30% i 0,1 M PB) og holde ved 4 ° C i mindst to dage.
- Placer segmenterne i cryo-forme og dækkede dem med væv frysning medium. For langsgående histologisk præparat, orientere blokkene med dorsale aspekt opad og bruge referencemærke at orientere blokken i cryo-forme.
- Fastfryse cryo-forme ved -20 ° C og skåret med en kryostat i 50 um-tykke snit. Bemærk: Sektionerne kan monteres direkte på adhæsion mikroskopobjektglas og lader den tørre O / N. Alternativt kan sektionerne blive emitteret i plader med 48 brønde fyldt med 0,1 M PB og monteres efterfølgende ved hjælp af referencemærke at orientere vævssnit på objektglas.
5. Lumbar Spinal Cord Dissektion og Forberedelse til histologi
- Læg dyret slagtet på det tilbage.
- Udfør en midtlinieincision langs maven af dyret og fjern indvoldene. Dissekere ud musklerne i den bageste bugvæggen at eksponere den ventrale aspekt af rygsøjlen.
- Find den korte caudale-meste ribben og dens tilstødende T13 ryghvirvel, hvor T13 ventrale rod forlader knoglen.
- Fortløbende fjernes en efter en de to eller tre ryghvirvler rostral til T13 (dvs. T12, T11 og, om nødvendigt, T10) med fine kirurgiske rongeurs at følge T13 ventrale rod indtil indførselsstedet i ventrale aspekt af ventrale ledning og markere det med en permanent filt markør.
- Fra dette punkt, gentage den samme procedure for at identificere placeringen af de ventrale rod entry point for L1, L2, L3, L4, L5, L6 og S1, farve dem med skiftende farver.
- Følg samme procedure som beskrevet i afsnit 4,5-4,10 for lumbar rygmarv dissektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Acetylcholinesterase histokemisk farvning afslører placeringen af motorens endeplader i bredden musklerne. Figur 1 illustrerer resultaterne af en sådan farvning udført på en hel rotte forben. Det foreslås at optimere koncentrationen af ammonium sulfid opløsning (f.eks., 5-7% i stedet for 10%) samt det tidspunkt, hvor prøven nedsænkes i opløsningen, hvis den ikke-specifik baggrundsfarvning på musklerne fibre er for overdreven. Figur 2 illustrerer en søjle af mærkede motoriske neuroner i den cervikale rygmarv efter en injektion af retrograd neuronal tracer langs længden af motoren endeplade region af en mus triceps. De retrogradt mærkede motorneuroner typisk danner en langsgående spalte, der strækker sig på tværs af flere segmenter af rygmarven. Figur 3 illustrerer forskellige antal af mærkede rygmarven motoriske neuroner, der blev opnået ved selektiv Fluor-Gold målretning af motoren endeplade region i triceps brachii. Maksimal optagelse blev observeret efter afgivelse til hele spektret af MEP-regionen, i modsætning til at målrette specifikke rum i MEP-regionen.
Figur 1: Udsigt over Lateral forelimb af rotten efter Acetylcholinesterase histokemisk farvning for motorsiden plader før (A) og efter (B) Eksponering til Ammonium sulfid Solution. I (A), motorens endeplader er synlige som hvide spættede prikker, der danner en kontinuerlig linie, der krydser hele bredden af musklen, mens muskelfibrene vedtage en grøn-blå nuance. I (B), er den samme forben præsenteret efter nedsænkning i ammoniumsulfid opløsning. Efter udviklingen i ammoniumsulfid løsning, motorens endeplader turn sort over de brune muskelfibre. Pilene i begge dele af figurerne peger på placeringen af motorens endeplader til (1) Acromiotrapezius, (2) Spinodeltoideus og (3) Triceps brachii.
Figur 2:. Mikrofotografier af 50 um længdesnit gennem den ventrale horn af rygmarven ved Cervikal Niveauer afsløre Fluor-Gold-mærket motorneuroner WM repræsenterer den hvide substans og GM repræsenterer den grå substans i rygmarven. Den stiplede linje angiver grænsen mellem den grå og hvid substans i rygmarven afsnittet observeret i figuren. Mikrofotografiet blev taget med en 10X målsætning under DAPI filteret mens indsatte blev taget med 20X målsætning under samme filter. I begge paneler, kan observeres Fluor-Gold mærkning i motor neuron cytoplasma samt proksimale Axon / dendritic processer. Figur som oprindeligt udgivet i TOSOLINI et al. (2013) Målretning den fulde længde af motorsiden Plate Regioner i Mouse forben Øger Optagelse af fluor-guld i tilsvarende Spinal Cord Motor neuroner Front. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058
Figur 3:. Selektiv Fluor-Gold Målretning af pladen Region Motor End i triceps brachii og den resulterende mærkning i rygmarven motoriske neuroner (A) er en skematisk gengivelse af placeringen af motorens endeplader på triceps brachii fibre. De tre forskellige sektioner af MEP-regionen, der blev målrettet individuelt er repræsenteret ved de grønne, røde og blå prikker. De grønne og røde prikker repræsenterer de forreste og bageste halvdele af hele MEP regionen henholdsvis mens de blå prikker represent placeringen af bolusinjektion af FG i bugen af musklen. Den dobbelte pil orienterer musklen i en anterior-posterior akse. (B) er en sammensat diagram, der illustrerer mærkning opnået efter selektiv målretning af de forskellige dele af MEP region af triceps brachii, som angivet i (A). Hver prik i (B) repræsenterer et enkelt mærket motor neuron. Den sorte søjle repræsenterer typiske mærkning observeret efter injektion af FG i hele spektret af MEP-regionen af musklen. Den røde motor neuron kolonne opnås efter FG injektioner i den bageste halvdel af musklen, mens den grønne motorneuroner kolonne opnås efter FG injektioner i den forreste halvdel af musklen. Injektioner begrænset til "mave" af musklen gav motoriske neuroner i kun et lille antal rygmarv segmenter, hvilket fremgår af den blå kolonne. Figur oprindeligt offentliggøreed i TOSOLINI et al. (2013) Målretning den fulde længde af motorsiden Plate Regioner i Mouse forben Øger Optagelse af fluor-guld i tilsvarende Spinal Cord Motor neuroner Front. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intramuskulær målretning og efterfølgende retrograd overførsel af terapeutiske transgener til de tilsvarende α motoriske neuroner til eksperimentel behandling af neuromuskulær tilstand er ikke en ny strategi. For eksempel har denne leveringsmetode blevet anvendt til at forsinke neuromuskulær degeneration på forskellige stadier af ALS progression i SOD1 mus og rotter 1,9-12 samt i mus med SMA 13. Mens lovende er effekten af disse scenarier genterapi været begrænset. I denne forbindelse foreslår vi, at optagelsen af transgenerne efter rygmarven motoriske neuroner kunne forbedres ved selektiv målretning af motorens endeplader på muskelfibrene. Det er vigtigt at bemærke, at i de ovennævnte undersøgelser blev intramuskulære injektioner af virale vektorer udføres uden reference til placeringen af MEP-regionen i de målrettede muskler.
I hele vores analyser af fordelingen af motorens endeplader(MEP'er) af bagben og forben, har et par principper opstået. Første, MEP regionen strækker sig over hele bredden af en muskel. Desuden er de parlamentsmedlemmer konsekvent linie vinkelret med hensyn til retningen af myofibre. Især er MEP-regionen ikke altid placeret i den tykkeste del af musklen, et område, der ofte omtales som den "mave", og det er ofte mål for bolus intramuskulære injektioner. Det er værd at bemærke, at de nuværende analyser blev udført på C57BL6 mus 22-23 og Long Evans rotte 21 og det blev fundet, at fordelingen af medlemmerne er bevaret i hver af disse to stammer af dyr. Men uanset om MEP fordelingen er bevaret mellem forskellige stammer af dyr af samme art er fortsat, skal dokumenteres.
Oprindeligt har vi dokumenteret placeringen af MEP regionen i flere muskler i forben og bagben for at orientere små, MULcomputeren genstarter måske flere intramuskulære injektioner af retrograd neuronal tracer Fluor-guld. Disse MEP kort kan anvendes til at shuttle transgener i motorneuroner. I et sådant tilfælde er det imidlertid vigtigt at justere mængden af injektioner i overensstemmelse med typen af virus, der anvendes (f.eks., Adenovirus, lentivirus, etc.) dens serotype samt dens titer. Holde fascia intakt er en god måde at holde virussen begrænset inden for grænserne af musklen (r) af interesse. En anden måde at undgå falske transfektion af motoriske neuroner innerverer nabo muskler er at tørre overfladen af musklen forsigtigt efter injektionerne. Disse forholdsregler kan være relevant i nogle eksperimentelle design, hvor opnåelse af et højt niveau af transduktion kunne være mere relevant end indeholder det inden for den pulje af motoriske neuroner forsyner målrettet muskel. Ikke desto mindre, de er gode praksis af indlysende sikkerhedsmæssige årsager. Hvis mere end én isolerede muskler skal injiceres, kan det være klogt, hvis det er muligt, at vælgeen gruppe af muskler, der er tæt på hinanden for at minimere størrelsen af huden indsnit. Rotter og mus har meget løs hud (dvs.., Ikke er knyttet til musklerne), så det er forholdsvis let at målrette flere muskler uden at skulle udføre enorme hud indsnit.
Effektiv genterapi til ALS og andre neuromuskulære forhold ved hjælp af retrograd maskineri af neuroner er fortsat en udfordring, som ideelt set vil en sådan terapi overføre gavnlige gener på tværs af hele befolkningen i rygmarven motoriske neuroner. Det er dog ikke nødvendigt at målrette alle motoriske neuroner til at opnå bæredygtige niveauer af transduktion, hvis det terapeutiske gen af interesse kodning en sekretorisk protein såsom en neurotrophiner. Faktisk, ikke-transducerede motorneuroner i nærheden af dem, der er blevet transduceret er blevet vist at internalisere eksogene molekyler af neurotrophiner gennem en parakrin mekanisme 24. Denne "tilskuer effekt 'i høj grad forbedrer effcacy af intramuskulær målretning til shuttle sekretoriske protein-kodende gener i tilsvarende motoriske neuroner. På den anden side, i betragtning af, at tabet af respiratorisk styring er den ultimative dødsårsag i ALS, kunne intramuskulære injektioner af terapeutiske virale konstruktioner udføres i mellemsiddende muskler 1 eller intrapleuralt 25 for at beskytte de motoriske neuroner, der er involveret i at trække vejret. Ved at beskrive en metode til nemt at fremhæve placering og organisering af MEP'er på skelet muskler, vil den nuværende protokol vise sig at være et værdifuldt værktøj til at udforske nye strategier genterapi for neuromuskulære dysfunktioner. Denne protokol giver også en minimalt invasiv måde at bevare integriteten af den neuromuskulære forbindelse i disse lavere motor neuron sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en National Health & Medical Research Centre (NHMRC) projekttilskud til RM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10 µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9 mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neuroscience. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
