从小鼠癌症模型的循环肿瘤细胞的分离和繁殖

Protocol

伦理声明：所有的动物研究批准了纽约市立大学亨特学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）。

1.预实验程序

1. 抵达后到的动物设施，最初容纳3 BALB / c小鼠用过滤的顶部和木片寝具一个笼子。确保鼠标可以免费获得食物，普瑞纳啮齿动物食物和水。床上用品和食物应每周更换两次，而网箱应每周清洁一次。
2. 使用与氧一起的异氟烷蒸发器以每分钟1升的恒定流速诱导小鼠全身麻醉。该系统是自力更生，包括精密蒸发器。
3. 位置动物在塑料盒中具有汽化器精度和气体/麻醉剂系统连接到它。最初设置的蒸发器，以2.5至动物是无意识的，在该点降低汽化器至2。
4. 此时，切换阀管线，它密封的框，并将其打开到鼻锥。
5. 移动到动物的准备区，用鼻锥体置于正确和连接的（用于维持麻醉）。
6. 准备5×10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1小鼠肝癌细胞每只小鼠植入。 BNL 1ME A.7R.1应生长在培养基（10％热灭活的FBS，1％青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺）在培养箱与空气和5％孵育在细胞培养皿在37℃下_的 CO 2。
7. 用具有20G的针的注射器，含有^5×10 6，BNL 1ME A.7R.1小鼠肝癌细胞到BALB / c小鼠的肝脏中的一个波瓣植入体100微升PBS，以产生原发肿瘤。植入后，房子在具有相同住宅要求植入前一个轿厢的BALB / c小鼠。
8. 在实验终点，肝癌的临床证据是观察到的显著减少身体状况分数（通常为4周后检测）。在这一点上，存在原发性肿瘤已经开发在肝脏而转移性沉积物形成在肺中的似然性。此后，开始循环肿瘤细胞的分离和传播的过程。

2.收集全血的循环肿瘤细胞分离

注：正确消毒手术区域，并确保它是整洁的。高压灭菌所有手术器械或根据制造商的建议浸泡在杀菌剂

1. 通过在实验终点人道安乐死（肿瘤发展的临床证据）牺牲小鼠。小鼠安乐死应包括_二氧化碳窒息。观察小鼠正确，确认麻醉正确分配。二氧化碳应缓慢释放到经过一段5室 - 10分钟，造成呼吸停止。心内放血和cervic按照人脱位^。5
2. 使用附连到1ml注射器收集全血地下25针。 Heparanize用0.01 ml肝素注射器。穿刺立即皮肤与针劣于xyphisternum在大约45°角。推进针头慢慢刺破心脏，然后放下针的角度。稳步举行的地方针头和注射器，并绘制出500微升 - 1000微升全血从心脏。
3. 取下注射器和针和血液转移至预标记的1.5 ml的无热原管。离心收集到1.5 ml的无热原管中的全血，在1167×g离心5分钟。
   注：离心分离的全血样品分为三层：由红细胞，中间薄层的血沉棕黄层，以及一个顶血浆层底部或血细胞比容层。
4. 通过移液仔细清除血浆收集到一个单独的1.5毫升无热原管菲尔特呃实验诸如检测的无细胞核酸^7。
5. 为循环肿瘤细胞（CTC的）的隔离，收集血沉棕黄层成在准备红细胞（RBC）裂解单独1.5 ml的无热原管。这是必要的，以除去残余的RBCs在血沉棕黄层层。

3.配方的红细胞（RBC）裂解液

1. 使红细胞裂解缓冲液的1L溶液。
2. 使500毫升氯化铵和500毫升的Tris。然后混合以创建的RBC裂解缓冲液的1L溶液用氯化铵的155毫和的Tris 10mM的终浓度。
3. 缓冲溶液的pH为7.5。存储RBC裂解缓冲液在2至8℃，并带来至RT之前立即使用。

巴菲大衣4.红细胞裂解

1. 加入1毫升的RBC裂解缓冲液的无菌无热原1.5毫升管含有所收集的血沉棕黄层。
2. 通过混合管的内容物反相多次。孵育管的内容混合5分钟，在室温在板凳上。在1167离心混合内容，5分钟×g的。
3. 离心后，发白粒料将获得。弃去上清液微红缓慢而小心地将10％的漂白粉无沉淀任何中断。如果颗粒不发白，重新执行步骤3.1 - 3.5。增加RBC裂解缓冲液中温育时间为10 - 15分钟也可以是有帮助的。
4. 安全处置生物废料一旦在10％漂白的生物垃圾无害化处理完毕24小时后。

5.传播在细胞培养

注：肿瘤细胞通常是快速生长的细胞白血细胞，其丰富的细胞接种入培养皿的原始混合物。以下反复变化的介质中，和的CTC的后续的传代，所有的白血细胞被除去的CTC的相对较纯的群体存在。

1. 经弃去上清成10％的漂白剂，在完全培养基中洗涤发白沉淀在1ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）至少一次，重悬在细胞培养物中繁殖。
2. 一旦洗涤完成后，加入1 ml的完整BNL 1ME A.7R.1培养基（10％热灭活的FBS，1％青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺）中，以沉淀和重新悬浮在培养基中的小球。
3. 种子细胞的悬浮搅和成细胞培养皿。孵育细胞培养皿在37℃下在湿润的培养箱中与空气和5％的CO _2。
4. 每两至三天更换细胞培养基。后五至七天，将CTC的粘附在细胞培养皿，并开始增殖。这些细胞将保持存活超过25代和反复冻融^循环 5之后。

6.验证肝癌的循环肿瘤细胞系

1. 执行APolymerase链反应（PCR）为基础的方法中，以扩增小鼠β珠蛋白基因的一个具体的DNA片段，以确认新建立的四氯化碳细胞系是小鼠细胞像原来植入BNL 1ME A.7R.1肝癌线。方法最初是描述和Steube 等验证^。5,8
2. 执行免疫染色的肝细胞特异性标记的cAMP反应性元件通过使用特定的抗体结合蛋白3样3（CREB3L3）。这将确认新成立的CTC确实是肝细胞像原来植入的BNL 1ME A.7R.1细胞系^。5

Representative Results

此处描述的方法已经表明的CTC可被分离。小鼠安乐死在实验终点。在参与过程中二氧化碳窒息，心内放血，和颈椎脱位。的过程的关键步骤的示意图示出在图2中。由心脏内放血收集的全血样品使用上述协议处理。之后，离心法确定进行的RBC裂解血沉棕黄层层。然后将其后跟另一个离心步骤以收集在PBS中洗涤该发白沉淀，并再悬浮于完全细胞培养基用于在细胞培养物繁殖。可能会出现的一个问题是，得到的粒料可能不清晰的颜色。通过执行它附加次15分钟，或者可能 - 这个问题可以通过它增加到10修改RBC裂解缓冲液中的温育时间很容易地得到解决。的CTC的代表图像被传播中培养来自三个不同的小鼠显示在图1相比，BNL 1ME A.7R.1细胞。快速增殖和形态将帮助确定是否细胞接种的检验中心。然而，如PCR和免疫染色在步骤5.1中描述的验证技术 - 需要5.2到确认建立可行的CTC线。

图1.从传播的原位同源小鼠模型的循环肿瘤细胞（检验中心）在细胞培养的肝癌转移。细胞中繁殖15毫米×60 MM细胞培养皿中BNL 1ME A.7R.1培养基。增殖的肿瘤细胞粘附至菜和从三个独立的小鼠被示出。肿瘤细胞通过不断的通道仍然是可行的。 CTCOL1MEA081211，CTCOL1MEACTC08291的相衬图像1 CTCOLUF2419是在比较BNL 1ME A.7R.1细胞（40倍）采取40倍的放大倍率（物镜）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.的隔离和传播循环肿瘤细胞从老鼠肝癌模型系统的过程中，当肝癌的临床证据被观察到显著减少，体况评分，全血是从小鼠收集。经过多次离心，红细胞溶解，和几个洗涤步骤，该检验中心接种于细胞培养皿繁殖。肿瘤细胞的增殖，经过几天观察， 请点击他再查看该图的放大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Needle
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1 ml syringe tip
Syringe 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13,000 rpm Centrifuge