Isolasjon og forplantning av sirkulerende tumorceller fra en mus Cancer Model

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Hunter College of The City University of New York.

1. Pre-eksperimentet Prosedyrer

1. Ved ankomst til dyret anlegget, først huse 3 BALB / c-mus i et bur med en filtrert topp og treflis sengetøy. Sørg for at musene har fri tilgang til mat, Purina gnagerfor, og vann. Sengetøy og mat bør endres to ganger i uken, mens bur bør rengjøres en gang i uken.
2. Indusere generell anestesi i mus ved hjelp av en isofluran fordamper sammen med oksygen ved en konstant strømningshastighet på 1 l pr min. Systemet er selvforsynte og innbefatter en presisjonsfordamper.
3. Stilling dyr i en plastboks som har presisjonen fordamper og gass / bedøvende system koblet til den. Utgangspunktet satt vaporizer til 2,5 før dyret er bevisstløs, og da senke fordamper til to.
4. På den tiden, slårventil linje, tetting til boksen og åpne det til nesen membran.
5. Flytt dyret til forberedelse området, med nesen membran plassert riktig og koblet (for vedlikehold anestesi).
6. Forbered 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 mus HCC celler for implantasjon per mus. BNL 1ME A.7R.1 skal vokse i medium (10% varmeinaktivert FBS, 1% penicillin / streptomycin og 2 mM L-Glutamin) inkubering i en cellekulturskål ved 37 ° C i en fuktet inkubator med luft og 5% CO _2.
7. Med en sprøyte med en 20 G nål, for å implantat 100 ul PBS inneholdende 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 mus hepatocellulær carcinoma celler inn i en flik av leveren hos BALB / c-mus fremstille de primære svulster. Post-implantasjon, huset de BALB / c mus i et bur med samme hus krav som pre-implantasjon.
8. På den eksperimentelle endepunktet, er observer som betydelig reduksjon i kroppens tilstand kliniske tegn på leverkreftscorer (vanligvis oppdaget etter 4 uker). På dette punktet, er det en sannsynlighet for at primærsvulster har utviklet seg i leveren, mens metastatiske er dannet avleiringer i lungene. Deretter starte prosessen med isolering og formering av sirkulerende tumorceller.

2. Innsamling av Whole Blood for Sirkulasjons Tumor Cell Isolation

MERK: Riktig renses operasjonen området og sørge for at det er ryddig. Autoklav alle kirurgiske instrumenter eller suge i et desinfeksjonsmiddel i henhold til produsentens anbefaling

1. Ofre mus ved human avlivning ved eksperimentelle endepunktet (kliniske tegn på svulst utvikling). Euthanization av mus bør involvere CO ₂ kvelning. Observere mus riktig å bekrefte anestesi er riktig fordelt. Karbondioksid bør slippes sakte inn i kammeret i løpet av en periode på 5 - 10 min, forårsaker respirasjonsstans. Følg med intrakardiell exsanguination og cervical forvridning. ⁵
2. Bruke en 25 G nål festet til en 1 ml sprøyte for innsamling av helblod. Heparanize sprøyten med 0,01 ml heparin. Punktering huden umiddelbart med nålen dårligere til xyphisternum ved ca 45 ° vinkel. Avansere nålen sakte å punktere hjertet, og senk vinkelen på nålen. Stadig holde nålen og sprøyten på plass, og trekke ut 500 mL - 1000 mL fullblod fra hjertet.
3. Fjern sprøyten og nålen og overføre blod inn i en pre-merket 1,5 ml pyrogenfrie tube. Sentrifuger fullblod samlet i 1,5 ml pyrogenfritt rør ved 1167 xg i 5 min.
   MERK: sentrifugering separerer hele blodprøven i tre lag: det nederste eller hematokritt lag bestående av røde blodlegemer, et mellomliggende tynt lag av buffy coat og et topp plasmasjikt.
4. Fjern plasma nøye ved pipettering og samle det i en egen 1,5 ml pyrogenfrie tube for Furtheh eksperimenter slik som påvisning av cellefrie nukleinsyrer ^7.
5. For isolering av sirkulerende tumorceller (CTCS), samle buffy coat i et separat 1,5 ml pyrogenfritt rør som forberedelse for røde blodceller (RBC) lysering. Dette er nødvendig for å fjerne rester av RBCs i buffy coat-laget.

3. Oppskrift på røde blodceller (RBC) Lysis Buffer

1. Foreta en 1 l løsning av RBC lysis buffer.
2. Gjør en 500 ml salmiakk og 500 ml Tris. Bland deretter for å skape en 1 l løsning av RBC lysis buffer med en endelig konsentrasjon på 155 mM av ammoniumklorid og 10 mM Tris.
3. Bufre oppløsningen til en pH-verdi på 7,5. Oppbevar RBC lysis buffer på 2-8 ° C, og bringe til RT umiddelbart før bruk.

4. RBC Lysis av Buffy Coat

1. Tilsett 1 ml av RBC lyseringsbuffer til det sterile pyrogenfri 1,5 ml rør som inneholder det oppsamlede buffy coat.
2. Blande innholdet i røret ettersnu flere ganger. Inkuber de blandet innholdet i røret i 5 min ved romtemperatur på benken. Sentrifuger blandede innholdet i 5 min ved 1167 x g.
3. Etter sentrifugering blir et hvitaktig pellet oppnås. Kast rødlig supernatanten sakte og forsiktig inn 10% blekemiddel uten avbrudd i pelleten. Hvis pellet ikke er hvitaktig, trinn 3.1 re-do - 3.5. Økning av inkubasjonstiden i RBC lyseringsbuffer til 10 - 15 minutter, kan også være nyttig.
4. Trygg kast det biologiske avfallet gang dekontaminering av biologisk avfall i 10% blekemiddel er ferdig etter 24 timer.

5. Formering i cellekultur

MERK: Kreftceller er vanligvis raskt voksende celler hvite blodceller som er rikelig i den opprinnelige blanding av celler seeded i formen. Etter gjentatt forandring av medium, og etterfølgende avsnitt av CTCS, er alle de hvite blodcellene fjernet og en relativt ren populasjon av CTCS gjenstår.

1. Etterforkaste supernatanten til 10% blekemiddel, vaske hvitaktig pellet i 1 ml fosfat-buffret saltvann (PBS) minst en gang, og resuspender i fullstendig kulturmedium for forplantning i cellekultur.
2. Når vaskingen er fullført, tilsett 1 ml komplett BNL 1ME A.7R.1 kulturmedium (10% varmeinaktivert FBS, 1% penicillin / streptomycin og 2 mM L-Glutamin) til pelleten og resuspender pelleten i kulturmediet.
3. Seed den resuspenderte blanding av celler i en cellekulturskål. Inkuber cellekulturskål ved 37 ° C i en fuktet inkubator med luft og _5% CO2.
4. Endre cellekulturmediet hver to til tre dager. Etter fem til syv dager, vil CTCS har levd opp til cellekulturen fatet og begynte voksende. Disse cellene vil være levedyktig utover 25 passasjer og etter gjentatte frysing og tining sykluser ^5.

6. Kontroll av leverkreft Sirkulasjons Tumor Cell Linje

1. Utfør apolymerase kjedereaksjon (PCR) -basert metode for å forsterke bare en bestemt DNA-segment av mus β-globin-genet for å bekrefte at de nye etablerte CTC cellelinjer er museceller som opprinnelig implanterte BNL 1ME A.7R.1 HCC linje. Metoden ble opprinnelig beskrevet og validert av Steube et al. ^5,8
2. Utføre farging for hepatocytt-spesifikk markør cAMP-responsive element bindende protein 3-lignende 3 (CREB3L3) ved hjelp av et spesifikt antistoff. Dette vil bekrefte at romanen etablerte CTCS er faktisk leverceller som den opprinnelige implantert BNL 1ME A.7R.1 cellelinje. ⁵

Representative Results

Metodikken er beskrevet her, har vist at CTCS kan isoleres. Musene ble humant avlivet ved eksperimentelle endepunktet. Prosessen involverte karbondioksid kvelning, intra-hjerte exsanguination, og halshugging. En skjematisk viktige trinn i fremgangsmåten er illustrert i figur 2. Hele blodprøver tatt ved intra-hjerteblodtapping ble bearbeidet ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor. Etter som sentrifugering ble anvendt for å bestemme buffy coat-lag som ble utsatt for RBC lysis. Dette ble deretter fulgt av et sentrifugeringstrinn for å samle et hvitaktig pellet som ble vasket i PBS og resuspendert i fullstendig cellekulturmedium for forplantning i cellekultur. Et problem som kan komme opp er at den oppnådde pellet ikke kan være klar farge. Dette problem kan lett løses ved å modifisere inkubasjonstiden i RBC lyseringsbuffer ved å øke den til 10 - 15 min, eller eventuelt ved å utføre det ytterligere ganger.Representative bilder av CTCS blir dyrket i kultur fra tre forskjellige mus er vist i figur 1, sammenlignet med BNL 1ME A.7R.1 celler. Rask spredning og morfologi vil bidra til å identifisere hvis celler seeded er CTCS. Imidlertid verifikasjon teknikker så som PCR og immunfarging som beskrevet i trinn 5.1 - 5.2 er nødvendig for å bekrefte etablering av en levedyktig CTC linje.

Figur 1. Utbredelse av sirkulerende tumorceller (CTCS) i cellekultur fra en ortotopiske syngeniske musemodell for leverkreft metastaser. Cellene ble dyrket i 15 mm x 60 mm cellekultur retter i BNL 1ME A.7R.1 dyrkingsmedium. Prolifererende tumorceller levd å rett og er vist fra tre separate mus. Tumorceller har vært levedyktig gjennom kontinuerlige passasjer. Fase kontrast bilde av CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 og CTCOLUF2419 ble tatt på 40X forstørrelse (objektiv) i forhold til BNL 1ME A.7R.1 celler (40X forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Skjematisk av Prosedyre for isolering og forplanter seg sirkulerende tumorceller fra en mus Cancer modellsystem. Når kliniske tegn på leverkreft ble observert som signifikant reduksjon i kropps tilstand resultatet, ble fullblod oppsamlet fra mus. Etter flere sentrifuger, RBC lyse, og flere vasketrinn ble CTCS sådd i cellekultur retter for forplantning. Tumorcelleproliferasjon ble observert etter flere dager. Klikk hanre for å se en større versjon av dette tallet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml  pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Needle
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1 ml syringe tip
Syringe 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13,000 rpm Centrifuge