Protocol
Ethik Hinweise: Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) des Hunter College der City University of New York zugelassen.
1. Pre-Experiment Procedures
- Nach der Ankunft in der Tierhaltung, zunächst beherbergen 3 BALB / c Mäusen mit einem Käfig mit einem gefilterten oben und Hackschnitzel Betten. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse freien Zugang zu Nahrung, Purina Nagetierfutter und Wasser. Bettzeug und Lebensmittel sollte zweimal pro Woche gewechselt werden, während Käfige sollten einmal pro Woche gereinigt werden.
- Induzieren Narkose bei Mäusen unter Verwendung eines Isofluran Verdampfer zusammen mit Sauerstoff mit einer konstanten Strömungsrate von 1 l pro min. Das System ist selbstständig und enthält eine Präzisions Vaporizer.
- Position Tier in einer Kunststoff-Box, die die Genauigkeit Verdampfer und Gas / Narkosesystem mit ihm verbunden ist. Anfangs des Verdampfers eingestellt auf 2,5 bis Tier bewusstlos ist, an welchem Punkt senken den Verdampfer bis 2.
- Zu dieser Zeit wechseln dieVentilleitung, Abdichtung an die Box und an den Nasenkegel öffnen.
- Bewegen Sie das Tier zum Vorbereitungsbereich, mit dem Nasenkegel ordnungsgemäß aufgestellt und angeschlossen (zur Aufrechterhaltung der Narkose).
- Vorbereitung 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Maus HCC-Zellen für die Implantation per Maus. BNL 1ME A.7R.1 sollte in Medium wachsen (10% hitzeinaktiviertem FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) Inkubation in einer Zellkulturschale bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit Luft und 5% CO 2.
- Mit einer Spritze mit einer 20 G Nadel, das Implantat 100 ul PBS, enthaltend 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 Mausleberkarzinomzellen in einen Lappen der Leber von Balb / c-Mäusen, die primären Tumoren zu erzeugen. Nach der Implantation, Haus die BALB / c Mäuse in einem Käfig mit den gleichen Haus Anforderungen vor der Implantation.
- Bei der experimentellen Endpunkt, klinische Hinweise auf Leberzellkarzinom zu beobachten, wie signifikante Reduktion der KörperzustandTor (in der Regel nach 4 Wochen festgestellt). An diesem Punkt gibt es eine Wahrscheinlichkeit, dass die primäre Tumoren in der Leber entwickelt, während Metastasen in der Lunge gebildet haben. Danach beginnt das Verfahren der Isolierung und Vermehrung der zirkulierenden Tumorzellen.
2. Sammeln von Vollblut für die zirkulierenden Tumorzellisolation
HINWEIS: ausreichend bereinigt den OP-Bereich und stellen Sie sicher, es ist übersichtlich gestaltet. Autoklaven alle chirurgischen Instrumenten oder genießen in einem Desinfektionsmittel nach Empfehlung des Herstellers
- Opfern Mäusen durch humane Sterbehilfe bei experimentellen Endpunkt (klinische Anzeichen einer Tumorentwicklung). Euthanasie von Mäusen sollte beinhalten CO 2 Ersticken. Beachten Sie die Maus richtig an Anästhesie zu bestätigen korrekt verteilt. Kohlendioxid sollte langsam in die Kammer über einen Zeitraum von 5 veröffentlicht werden - 10 min, was zu Atemstillstand. Folgen Sie durch intra Ausbluten und cervical Dislokation. 5
- Verwenden Sie eine 25 G Nadel in eine 1 ml Spritze für die Sammlung von Vollblut angebracht. Heparanize die Spritze mit 0,01 ml Heparin. Punktion der Haut sofort mit der Nadel schlechter als die xyphisternum bei ca. 45 ° -Winkel. Voran Nadel langsam, um das Herz zu durchstechen, und senken Sie dann den Winkel der Nadel. Stetig halten Sie die Nadel und Spritze in Position, und ziehen Sie 500 ul - 1000 & mgr; l Vollblut aus dem Herzen.
- Entfernen Sie die Spritze und Nadel und übertragen Sie das Blut in eine pre-markierten 1,5 ml pyrogenfreien Röhre. Zentrifugieren Sie das Vollblut in 1,5 ml pyrogenfreien Röhrchen gesammelt bei 1.167 xg für 5 min.
HINWEIS: Die Zentrifugation trennt das Vollblut-Probe in drei Schichten: der Boden oder Hämatokrit Schicht aus roten Blutzellen, eine dünne Zwischenschicht aus buffy coat und einen oberen Plasmaschicht. - Entfernen Sie die Plasma sorgfältig durch Pipettieren und sammeln sie in einem separaten 1,5 ml pyrogenfreien Röhre für Fürther Experimente wie Nachweis von zellfreien Nukleinsäuren 7.
- Für die Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC), zur Erhebung der Buffy-Coat in einen separaten 1,5 ml pyrogenfreien Röhre in Vorbereitung auf roten Blutzellen (RBC) Lyse. Dies ist notwendig, um restliche RBCs in der Buffy-Coat-Schicht zu entfernen.
3. Rezept für Rotes Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer
- Machen Sie einen 1 l-Lösung von RBC Lysispuffer.
- Machen Sie ein 500 ml Ammoniumchlorid und 500 ml Tris. Dann mischen, um eine 1 l-Lösung von RBC Lysepuffers mit einer Endkonzentration von 155 mM Ammoniumchlorid und 10 mM Tris erstellen.
- Puffern der Lösung auf einen pH-Wert von 7,5 auf. Bewahren Sie die RBC Lysispuffer bei +2 bis +8 ° C, und bringen auf RT unmittelbar vor der Verwendung.
4. RBC Lyse von Buffy Coat
- 1 ml RBC Lysepuffer dem sterilen pyrogenfreien 1,5 ml Röhrchen mit dem gesammelten Buffy-Coat.
- Den Inhalt des Rohres durchUmdrehen mehrmals. Die gemischte Inhalt des Röhrchens für 5 min bei RT auf der Bank zu inkubieren. Zentrifugieren der gemischten Inhalt für 5 min bei 1.167 x g.
- Nach der Zentrifugation wird eine weißliche Pellets erhalten werden. Entsorgen Sie die rötliche Überstand langsam und vorsichtig in 10% Bleichmittel ohne Unterbrechung zu dem Pellet. Wenn das Pellet nicht weißlich, erneut führen Sie die Schritte 3,1-3,5. Erhöhung der Inkubationszeit in RBC Lysepuffer 10-15 min kann ebenfalls hilfreich sein.
- Entsorgen Sie die biologischen Abfall einmal Dekontamination von biologischen Abfällen in 10% Bleichmittel nach 24 Stunden abgeschlossen ist.
5. Vermehrung in Zellkultur
HINWEIS: Die Tumorzellen werden in der Regel schnell wachsende Zellen weiße Blutkörperchen, die reichlich in der ursprünglichen Mischung von Zellen in die Schale überimpft werden. Nach wiederholter Wechsel des Mediums, und nachfolgende Passagen CTCs, werden alle weißen Blutzellen entfernt und eine relativ reine Population von CTCs bleibt.
- NachVerwerfen des Überstandes in 10% Bleichmittel, wäscht den weißlich Pellet in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mindestens einmal und Resuspension in komplettem Kulturmedium zur Vermehrung in Zellkultur.
- Einmal Waschen abgeschlossen ist, wird 1 ml der vollständigen BNL 1ME A.7R.1 Kulturmedium (10% hitzeinaktiviertem FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin), um das Pellet und das Pellet in dem Kulturmedium.
- Samen der resuspendiert Mischung von Zellen in einer Zellkulturschale. Inkubieren der Zellkulturschale bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit Luft und 5% CO 2.
- Ändern Sie den Zellkulturmedium alle zwei bis drei Tage. Nach fünf bis sieben Tagen wird CTCs zu der Zellkulturschale eingehalten und gestartet haben wuchernden. Diese Zellen lebensfähig über 25 Passagen und nach mehrmaligem Einfrieren und Auftauen Zyklen 5 bleibt.
6. Prüfung von Leberzellkarzinom zirkulierenden Tumorzelllinie
- Führen apolymerase Kettenreaktion (PCR) basierende Methode, um nur einen bestimmten DNA-Abschnitt des Maus-β-Globin-Gens zu verstärken, um zu bestätigen, dass der Roman gegründet CTC Zelllinien sind Maus-Zellen, wie das Original implantiert BNL 1ME A.7R.1 HCC Linie. Methode wurde ursprünglich beschrieben und Steube et al validiert. 5,8
- Zuführen Immunofärbung für den Hepatozyten-spezifischer Marker cAMP responsive element binding protein 3-like 3 (CREB3L3) unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers. Dies wird diesen Roman gegründet CTCs sind in der Tat Hepatozyten wie das Original implantiert BNL 1ME A.7R.1 Zelllinie zu bestätigen. 5
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Representative Results
Die hier beschriebene Methode hat gezeigt, dass CTC isoliert werden kann. Die Mäuse wurden auf humane Weise zu experimentellen Endpunkt euthanasiert. Der Prozess beteiligt Erstickung mit Kohlendioxid, intra-kardialen Ausbluten und Genickbruch. Ein Schema der wesentlichen Schritte des Verfahrens sind in Fig. 2 dargestellt ist Vollblutproben durch intrakardiale Ausbluten gesammelt wurden, unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls verarbeitet. Nach dem, wurde Zentrifugation verwendet, um die Buffy-Coat-Schicht, die mit dem RBC-Lyse unterzogen wurde, zu bestimmen. Dies wurde dann durch einen anderen Zentrifugationsschritt folgte, um eine weißliche, das Pellet in PBS gewaschen wurde, zu sammeln und in vollständigen Zellkulturmedium zur Vermehrung in Zellkultur resuspendiert. Ein Problem, die oben kommen kann ist, dass das erhaltene Pellet kann nicht klar, in Farbe sein. 15 min oder gegebenenfalls durch Ausführen es zusätzliche Male - Dieses Problem kann leicht durch Modifizieren der Inkubationszeit in RBC Lysepuffer durch Erhöhung auf 10 gelöst werden.Repräsentative Bilder von CTCs in Kultur vermehrt von drei verschiedenen Mäusen sind in 1 im Vergleich zu BNL 1ME A.7R.1 Zellen gezeigt. Schnelle Verbreitung und Morphologie werden dazu beitragen, wenn Zellen besiedelt sind CTC. Allerdings Verifikationstechniken wie PCR und Immunfärbung in den Schritten 5.1 - 5.2 sind erforderlich, um die Schaffung eines lebensfähigen CTC Linie zu bestätigen.
Abbildung 1. Die Ausbreitung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) in Zellkultur von einem orthotopen Syngene Maus-Modell der Leberzellkarzinom Metastasen. Die Zellen wurden in 15 mm x 60 mm Zellkulturschalen in BNL 1ME A.7R.1 Kulturmedium vermehrt. Proliferierenden Tumorzellen eingehalten austeilen und werden aus drei verschiedenen Mäusen gezeigt. Tumorzellen wurden durch kontinuierliche Passagen lebensfähig blieben. Phasenkontrastbild der CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 und CTCOLUF2419 wurden bei 40-facher Vergrößerung (Objektiv) im Vergleich zum BNL 1ME A.7R.1 Zellen (40-facher Vergrößerung) übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Vorgehensweise zur Isolierung und Propagierung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus-Cancer-System. Bei der klinischen Anzeichen einer Leberzellkarzinom wurde als signifikante Reduktion der Körperkondition beobachtet, Vollblut wurde von Mäusen gesammelt. Nach mehreren Zentrifugationen, RBC-Lyse und mehreren Waschschritten wurden die CTCs in Zellkulturschalen ausgesät Ausbreitung. Tumorzellproliferation wurde nach mehreren Tagen beobachtet. Bitte klicken Sie ererneut, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Salt 1 g | VWR | 89508-852 | |
| BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS | VWR | 89511-254 | 1.5 ml pyrogen-free eppendorf Tubes |
| Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in | VWR | BD305125 | 25 G Needle |
| Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack | VWR | BD309659 | 1 ml syringe tip |
| Syringe 1 ml leur lok Pk 100 | VWR | BD309628 | 1 ml syringe |
| VWR Forceps Tissue 6 | VWR | 82027-446 | Forceps |
| Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100 | VWR | 25608-924 | Cyromold |
| Cryo-oct compund 4 oz | VWR | 25608-930 | Oct compound |
| VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72 | VWR | 48311-703 | Slides |
| VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm | VWR | 48-382-128 | Cover Glass |
| VWR Slide Box True North Fm Pu | VWR | 89140-278 | Slide Box |
| Super HT PAP Pen | VWR | 89427-058 | PAP pen |
| Water RNASe and DNAse free 2 L | VWR | 101454-204 | Nuclease Free Water |
| Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g | VWR | 97061-796 | Tris Buffer |
| Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg | VWR | 97062-048 | Ammonium Chloride Buffer |
| Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene | VWR | 353002 | Tissue Culture Dish |
| Clorox Germicidal Bleach, Regular | VWR | 89501-620 | Clorox Bleach |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml) | Thermo Fischer Scientific | 21-040-CV | PBS, 1x |
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 10-017-CV | DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer Scientific | 35-010-CV | FBS |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Thermo Fischer Scientific | 30-002-Cl | Penicillin Streptomycin |
| Sorvall Biofuge pico | Thermo Fischer Scientific | 75002411 | 13,000 rpm Centrifuge |
References
- Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).
- van de Stolpe, A., den Toonder, J. Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future. Cancers. 6, 1195-1207 (2014).
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).
- George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. "Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer. Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS one. 8, e63765 (2013).
- Cheng, B., et al. Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture. International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).
- Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction. Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).
- Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S.
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).
- Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).
- De Giorgi, U., et al. Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).
- Eloubeidi, M. A., et al. Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications. The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).
- O'Toole, D., et al. Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration. Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).
